Method Article

Olgun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit Monokatmanları Kullanılarak Yüksek Verimli Kardiyotoksisite Taraması

DOI:

10.3791/64364

⸱

March 24th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Frankel Cardiovascular Regeneration Core Laboratory, Cardiovascular Medicine-Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor, 2CAIRN Research, 3StemBioSys, Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite taraması için hayvanların kullanılmasına bir alternatif sunar. Preklinik toksisite taramasında hiPSC-CM'lerin yaygın olarak benimsenmesinin bir sınırlaması, hücrelerin olgunlaşmamış, fetal benzeri fenotipidir. Burada hiPSC-CM'lerin sağlam ve hızlı olgunlaşması için protokoller sunulmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), klinik öncesi kardiyotoksisite testi için hayvanlara ve hayvan hücrelerine olan bağımlılığı değiştirmek ve azaltmak için kullanılır. İki boyutlu tek katmanlı formatlarda, hiPSC-CM'ler, optimal bir hücre dışı matris (ECM) üzerinde kültürlendiğinde yetişkin insan kalp kası hücrelerinin yapısını ve işlevini özetler. İnsan perinatal kök hücre kaynaklı ECM (olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matriks-MECM), kaplamadan sonraki 7 gün içinde hiPSC-CM yapısını, işlevini ve metabolik durumunu olgunlaştırır.

Olgun hiPSC-CM monokatmanları da klinik olarak ilgili ilaçlara beklendiği gibi yanıt verir ve aritmilere ve kardiyotoksisiteye neden olma riski vardır. HiPSC-CM monokatmanlarının olgunlaşması, şimdiye kadar düzenleyici bilim ve güvenlik taraması için bu değerli hücrelerin yaygın olarak benimsenmesinin önünde bir engeldi. Bu makalede, hiPSC-CM elektrofizyolojik ve kontraktil fonksiyonun kaplanması, olgunlaşması ve yüksek verimli, fonksiyonel fenotiplemesi için doğrulanmış yöntemler sunulmaktadır. Bu yöntemler, ticari olarak temin edilebilen saflaştırılmış kardiyomiyositlerin yanı sıra, yüksek verimli, odaya özgü farklılaşma protokolleri kullanılarak şirket içinde üretilen kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler için de geçerlidir.

Yüksek verimli elektrofizyolojik fonksiyon, voltaja duyarlı boyalar (VSD'ler; emisyon: 488 nm), kalsiyuma duyarlı floroforlar (CSF'ler) veya genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörleri (GCaMP6) kullanılarak ölçülür. Her fonksiyonel parametrenin optik kayıtları için yüksek verimli bir optik haritalama cihazı kullanılır ve elektrofizyolojik veri analizi için özel özel bir yazılım kullanılır. MECM protokolleri, pozitif inotrop (izoprenalin) ve insan Ether-a-go-go-ilişkili gen (hERG) kanalına özgü blokerler kullanılarak ilaç taraması için uygulanır. Bu kaynaklar, diğer araştırmacıların yüksek verimli, klinik öncesi kardiyotoksisite taraması, kardiyak ilaç etkinlik testi ve kardiyovasküler araştırmalar için olgun hiPSC-CM'leri başarıyla kullanmalarını sağlayacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) uluslararası ölçekte doğrulanmıştır ve in vitro kardiyotoksisite taraması için mevcuttur1. Son derece saf hiPSC-CM'ler neredeyse sınırsız sayıda üretilebilir, kriyoprezerve edilebilir ve çözülebilir. Yeniden kaplama üzerine, aynı zamanda yeniden canlanırlar ve insan kalbini anımsatan bir ritimle büzülmeye başlarlar 2,3. Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hiPSC-CM'ler birbirleriyle çiftleşir ve tek bir doku olarak atan fonksiyonel sinsiti oluşturur. Günümüzde, hiPSC'ler rutin olarak hasta kan örnekle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde hiPSC kullanımı Michigan Üniversitesi HPSCRO Komitesi (Human Pluripotent Stem Cell Oversight Committee) tarafından onaylanmıştır. Malzeme ve ekipman listesi için Malzeme Tablosu'na bakın. Medya ve kompozisyonları için Tablo 1'e bakınız.

1. Olgunlaşmaya neden olan hücre dışı matris (MECM) üzerinde olgunlaşma için ticari olarak temin edilebilen kriyokorunmuş hiPSC-CM'lerin çözülmesi ve kaplanması

  1. Tüm reaktifleri oda sıcaklığına ısıtın ve MECM plakalarını Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) veya kalsiyum ve magnezyum içeren fosfat tamponlu salin (PBS) ile kardiyomiyosi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

faz kontrastı ve immünofloresan konfokal görüntüleme ile karakterize hiPSC-CM matürasyonu
MECM kaplamalı 96 delikli plakalar kullanılarak ticari olarak temin edilebilen hiPSC-CM'lerin ECM aracılı olgunlaşması için zaman çizelgesi Şekil 1A'da sunulmuştur. Bu veriler, laboratuvara kriyokorunmuş hücre şişeleri olarak gelen ticari olarak temin edilebilen kardiyomiyositler kullanılarak toplanır. Her flakon >5 × 106 canlı kardiyomiyosit içerir. Hücreler ~% 98 saft.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HiPSC-CM'ler kullanılarak in vitro kardiyotoksisite taramasına birkaç farklı yaklaşım vardır. HiPSC-CM'lerin kullanımı ile ilgili yakın tarihli bir "En İyi Uygulamalar" makalesi, çeşitli in vitro tahlilleri, birincil okumalarını ve daha da önemlisi, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunu ölçmek için her bir tahlilin granülerliğini sunmuştur20. Membran delici elektrotların kullanılmasına ek olarak, insan kardiyak elektrofizyolojik fonksiyonunun en doğrudan ölçümü VSD'ler ta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TB, StemBioSys, Inc.'in bir çalışanıdır. AMR ve JC, StemBioSys, Inc.'in eski danışmanlarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH hibeleri HL148068-04 ve R44ES027703-02 (TJH) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.25 Tripsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg / mL BSA (7.5 ve mikro; mol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVektör biyolaboratuvarları1909
Albümin insanSigmaA9731-1G
alfa aktinin antikoruThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/A
https://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus CHIR99021LC Laboratuvarlarıc-6556
Şeffaf Test ortamı (florobrit)ThermoFisherA1896701Adenovirüs için transdüksiyon
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Sığır Serumu)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM bakım ortamıFUJIFILM/Hücresel DinamikM1003
iCell2 CM'lerFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T. HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidratSigmaA8960-5g
L-glutaminGibcoA2916801
LS sütunlarıMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Tamponu (autoMACS Çalışan Tampon)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optik Haritalama CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Konfokal MikroskopNikon
esansiyel olmayan amino asitlerGibco11140-050
ön ayırma filtresiMiltenyii Biotec130-041-407
PSC'den Türetilmiş Kardiyomiyosit İzolasyon Kiti, insanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS ayırıcı (Mıknatıs)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoik asitSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamin)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antikoru (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (etilendiamintetraasetik asit - EDTA çözeltisi)Gibco15040-066
Y-27632 dihidroklorürTocris1254
ve beta; -merkaptoetanolGibco21985023

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiotoxicity ScreeningHiPSC CardiomyocytesMonolayer CultureExtracellular MatrixOptical MappingElectrophysiological AnalysisCalcium ImagingMagnetic Cell SortingDrug Response TestingAction Potential Measurement

Related Articles