Hipokampal Nörojenik Nişi İncelemek için Tek Çekirdekli RNA Dizilimi ile Birleştirilmiş Floresan Aktive Edilmiş Çekirdekler Negatif Nöronik Sıralama

Yetişkin Hipokampal Nörogenezi (AHN) olarak da bilinen yetişkinlikte hipokampal nöronların sürekli üretimi, öğrenme, hafıza edinimi / klirensi ve örüntü ayrımı gibi bilişsel işlevlerle ilişkilidir ve bilişsel eksiklikleri önlemek için yaşlanma ve nörodejeneratif hastalıklarda önemli bir esneklik mekanizması gibi görünmektedir ^1,2,3 . Kemirgenler, immünositokimya ve yeni nesil dizileme (NGS) yöntemleri de dahil olmak üzere çeşitli yöntemler kullanarak AHN'yi incelemek için tercih edilen model olmuştur. Bu sonuçların diğer türlere çevirisi tartışmalı olmaya devam etmektedir. Gerçekten de, AHN çoğu türde gözlenmiştir, ancak yaşam boyunca, özellikle de insanlarda 4,5,6,7,8 oranında devam ettiği düzenli olarak tartışılmaktadır.

Bugüne kadar, AHN^1'i modüle etmek için çeşitli içsel ve dışsal sinyal yolları doğrulanmıştır. Bununla birlikte, hücreler arası iletişimin AHN üzerindeki etkisi sadece⁹. Bu ilk olarak, genetiği değiştirilmiş hayvanlarla in vivo analiz yapmak için şu anda bilinen hücre belirteçlerinin yetersiz özgüllüğüne bağlanabilir. Gerçekten de, birçok çalışma, çoklu hücre tipleri^1'de eksprese edilen doublecortin veya glial fibriler asidik protein (GFAP) gibi belirteçlere dayanmaktadır. İkincisi, yetişkin hipokampal niş^10'daki karmaşıklık ve yüksek derecede hücre çeşitliliği, her hücre tipinin profilini çıkarmak için teknik zorluklar getirmektedir. Bu, özellikle NSC'ler veya glial hücreler gibi farklı popülasyonlar için analitik boru hatlarında kullanılan örtüşen hücresel belirteçlerle biyoinformatik analiz için geçerlidir ve AHN ^7,11'i değerlendirirken tartışmalı sonuçlara yol açmaktadır. Üçüncüsü, çok sayıda nöron, astrositler, oligodendrositler veya ependimal hücreler gibi daha az miktarda hücre popülasyonunun araştırılmasını baltalamaktadır, ancak AHN'nin ince ayar düzenlemesindeki rolleri öne çıkmaktadır⁹. Birlikte, bu sınırlamalar sonuçları kemirgenlerden diğer türlere çevirme yeteneğini etkiler. Bu, özellikle hipokampal nörojenik niş gibi karmaşık bir dokuyu in vitro olarak özetlemenin zorluğu ve insan dokularını içeren çalışmalarda doku işleme için standartlaştırılmış protokollerin eksikliği ile birlikte yüksek kaliteli dokuya erişmenin önündeki birçok engel ile daha da artmaktadır^12,13. Bu nedenle, hücre popülasyonlarının profilini çıkarmak için yeni yaklaşımlar geliştirmek ve dentat girus (DG) içindeki yeni hücresel belirteçleri tanımlamak kritik öneme sahiptir ve sonuçta her hücre tipinin AHN regülasyonuna farklı katkılarının daha iyi anlaşılmasına yol açacaktır.

Bunu başarmak için, RNA dizilimi ile birlikte tek hücreli (sc) ve tek çekirdekli (sn) izolasyon, DG¹⁴ gibi karmaşık dokuları araştırmak için etkili hale gelmiştir. Bu nedenle, tek hücreleri fare yetişkin hipokampal nişinden izole etmek için hücresel zenginleştirme stratejileri çoğunlukla ^NSC'leri incelemek için gerçekleştirilmiştir^15,16. Nöronal olmayan hücreleri DG'den zenginleştirmek için ilginç bir strateji, GluR1 / Cd24 çift negatif tek hücrelerin dizilenmesiyle uygulandı ve biyoinformatik analizden sonra astrositler ve NSC'ler arasında belirgin kümeler olmadan 1.408 hücrenin dizilenmesiyle sonuçlandı¹⁷. Bunun nedeni, hücre bütünlüğüne ve RNA'ya zarar veren tek hücre hazırlığı için gereken sert enzimatik sindirim olabilir. Bu teknik sorunu atlamak için, bunun yerine tek çekirdek izolasyonunu kullanan çeşitli yöntemler geliştirilmiştir ve özellikle karmaşık dokular için uygundur^11,18. Bununla birlikte, DG içindeki nöronların baskınlığı veya daha geniş anlamda hipokampal-entorinal sistem içinde, bu beyin bölgelerinde bulunan hücre popülasyonlarının tamamını incelemek için bir örnekleme önyargısı oluşturur. Ek olarak, tek hücre kütüphanelerinin hazırlanması için yüklenecek sınırlı sayıda hücre, sıralanmış tek çekirdeklerin analitik boru hatlarında ana hücre popülasyonunun varlığını vurgulamaktadır. Gerçekten de, büyük nöronal kümeler genellikle açıklama eklenir ve analiz edilirken, diğer hücre popülasyonları yeterince temsil edilmez veya kaçırılır ^5,11.

Bu önyargıların üstesinden gelmek ve fare DG'sinde bulunan nöronlar dışındaki hücre tiplerinin profilini çıkarabilmek amacıyla, bu çalışmada, nöronal nükleer antijenli boyalı tek çekirdeklerin negatif seçimi ile çoğu nöronal popülasyonu dışlayan Floresan Aktif Çekirdek Sıralama (FANS)¹⁸ ilkesini kullanan bir yöntem geliştirilmiştir (NeuN, Rbfox3 olarak da bilinir). Bu antijen seçimi, NeuN'yi güvenilir bir nöronal belirteç¹⁹ olarak tanımlayan literatür ve bu yaklaşım için nükleer bir protein kullanma gerekliliği tarafından yönlendirilmiştir. NeuN-negatif FACS-sıralanmış hücreler daha sonra 10x Genomik platformunda RNA dizilimi için hazırlandı. Sonuçlar, NeuN eksprese eden hücrelerin dışlanmasının, glial ve nadir hücre popülasyonlarının hücre tipine özgü, yüksek kaliteli transkriptomik profillemesine izin verdiğini göstermektedir.

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Francis Crick Enstitüsü'nün yönergelerinin yanı sıra İngiltere İçişleri Bakanlığı yönergeleri ve yasalarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

Şekil 1: Nöronal olmayan popülasyonların snRNA-sekleri için yetişkin farelerin disseke edilmiş DG'sinden tek bir çekirdek süspansiyonunun hazırlanması. snRNA-seq ile devam etmeden önce fare DG'sinin diseksiyonu, tek çekirdeklerin süspansiyonunun hazırlanması, NeuN immün boyama ve negatif NeuN-FANS-sıralamayı içeren protokolün ana adımlarını açıklayan akış diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Genel Müdürlük diseksiyonu (Zamanlama: 15 dk.)

1. Çekirdek izolasyon ortamı 1 ve 2'yi (NIM1 ve NIM2), homojenizasyon tamponunu (HB) ve Yıkama ortamını (WM) hazırlayın (Ek Tablo 1). Tüm tamponları, ortamları, reaktifleri ve aletleri ihtiyaç duyulana kadar buzun üzerine yerleştirin. Sıçrama homojenizatörünü ( bakınız Malzeme Tablosu) hazırlama sırasında (homojenizasyon adımından en az 1 saat önce) buzun üzerine koyun.
   NOT: NIM1, 4 °C'de 6 aya kadar hazırlanabilir ve saklanabilir. NIM2, HB ve WM taze hazırlanmalıdır.
   DİKKAT: DTT, proteaz inhibitörü ve Triton X-100'ü dikkatli bir şekilde manipüle edin. Bu bileşikler cildi ve gözü tahriş edici, akut toksik ve su ortamı için tehlikelidir. Bu kimyasalları kullanırken koruyucu eldiven, giysi, göz ve yüz koruyucu kullanın, kullandıktan sonra ellerinizi iyice yıkayın ve çevreye salınımdan kaçının.
2. 22 aylık bir erkek C57Bl / 6J fareyi, Ev Ofisi Program 1 prosedürü^20'yi takiben servikal çıkık ile ötenazileştirin.
   NOT: Bu çalışmada 22 aylık fare kullanımı ile ilgili gerekçeler için tartışmaya bakınız. Bununla birlikte, bu protokol yaşam süresi boyunca herhangi bir yaşta gerçekleştirilebilir.
3. Beyni ötenazi yapılmış bir fareden çıkarın ve buz gibi soğuk 1x PBS ile dolu 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın (Şekil 1). Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Bir neşter kullanarak beyinciğini çıkarın ve beyni her iki yarımküre arasında (sagital eksen boyunca) ikiye bölün.
4. 10 cm'lik yeni bir Petri kabını buz gibi PBS ile doldurun ve buzun üzerine yerleştirin. Beynin yarısını yeni Petri kabına aktarın. Dürbün kullanarak, DG'yi disseke edin ve beynin ikinci yarısından ikinci DG'yi elde etmek için bu adımı tekrarlayın.
   NOT: Bu adımlar (adım 1.2-1.4) daha önce açıklanan yordam^21'den uyarlanmıştır. Hücrelerin bütünlüğünü korumak için bu aşamada mümkün olduğunca hızlı ilerlemek önemlidir.
5. İki DG'yi önceden soğutulmuş Dounce homojenizatörüne aktarın ve 1 mL soğuk HB ekleyin.

2. Doku ayrışması, tek çekirdek izolasyonu ve anti-NeuN immün boyama (Zamanlama: 2 saat)

1. Dokuyu gevşek "A" havanesinin 10 vuruşuyla, ardından sıkı "B" havanesinin 15 vuruşuyla homojenize edin.
   NOT: Sürtünme ve köpüklenmenin neden olduğu ısıyı azaltmak için sıçrama homojenizasyonu buz üzerindeki harçla yumuşak vuruşlarla yapılmalıdır. İşlem sırasında tüm tamponlar ve ekipmanlar önceden soğutulmalı ve buz üzerinde tutulmalıdır.
2. Homojenatı önceden soğutulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın; Dounce homojenizatörünü 1 mL soğuk HB ile durulayın ve aynı tüpte birleştirin. 15 mL tüpe 3 mL HB ekleyin ve buz üzerinde 5 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpü yavaşça ters çevirerek 2x karıştırın.
3. 50 mL'lik bir test tüpü üzerinde 0,5 mL HB içeren 70 μm'lik bir süzgeç kapağını önceden ıslatın. 15 mL tüpün üzerinden yavaşça hücre süzgecine devrilerek çekirdek süspansiyonunu adım 2.2'den süzün. Hücre süzgecini 0,5 mL HB ile yıkayın.
4. Hücre süzgecini çıkarın ve bir salıncak kovası santrifüjü kullanarak test tüpünü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süper natantı atın.
   NOT: Homojenatın zorlanması, akış sitometrisi ve snRNA-seq aşağı akış adımları için kritik olan kalıntıların azaltılmasına yardımcı olacaktır.
5. Bir P1000 pipet kullanarak peleti 4 mL HB içinde nazikçe yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 3 mL WM içinde yeniden askıya alın.
6. 0,5 mL WM içeren 15 mL'lik bir test tüpü üzerinde 35 μm'lik bir süzgeç kapağını önceden ıslatın. çekirdek süspansiyonunu 2.5. adımdan hücre süzgecinden süzün, bir P1000 pipet kullanarak bir seferde 0,5 mL'yi hafifçe pipetleyin.
7. Süzgeç kapağını 0,5 mL WM ile yıkayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Filtratın yeni bir 15 mL tüpe aktarın ve 500 x g'de 5 dakika ve 4 ° C için santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti 3 mL WM içinde yeniden askıya alın.
8. 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve fare anti-NeuN, Alexa Fluor 488-konjuge antikor (anti-NeuN-AF488, 1:32.000) ve 1 μg / mL DAPI ile peleti 1 mL WM içinde yeniden askıya alın. Karanlıkta buz üzerinde 45 dakika kuluçkaya yatırın.
   NOT: İzole çekirdeklerin immün boyamasını optimize etmek için, akış sitometrisi analizi ve sıralama için en uygun seyreltmeyi belirlemek üzere antikorun titre edilmesi önerilir. Ardından, boyama koşullarının optimal olduğunu doğrulamak için yeterli kontrolleri çalıştırın. Örneğin, konjuge anti-NeuN-AF488 antikoru ile, lekesiz ve lekeli popülasyonların ayrışmasını değerlendirmek için negatif bir kontrol (yani, antikorun eklenmemesi, Ek Şekil 1A) ve pozitif bir kontrol (yani, antikor ile boyanma, Ek Şekil 1B) çalıştırılmıştır. AF488 konjuge bir antikor ile çalışmaya başlarken, özgüllüğü değerlendirmek için AF488 konjuge izotip kontrolünün çalıştırılması önerilir. Konjuge olmayan bir antikor kullanılıyorsa, sekonder antikorun spesifik olmayan bağlanmasını değerlendirmek için sadece bir çekirdek preparatına ikincil bir antikor eklemek gibi ek kontrol gerekli olabilir.

3. Nöronal popülasyonları dışlamak için floresan aktif çekirdek sıralama (FANS) (Zamanlama: 45 dakika)

1. İmmün boyalı çekirdek süspansiyonunu 5 mL'lik bir test tüpüne aktarın ve akış sitometrisi prosedürünün başlangıcına kadar buz üzerinde tutun.
   NOT: İki fare DG'sinden daha büyük doku parçalarıyla çalışıyorsanız, çözeltideki çekirdek yoğunluğu yükselirse FACS'ın tıkanmasını önlemek için WM tamponu ile daha fazla seyreltme gerekebilir.
2. Tüpleri FACS cihazına yerleştirmeden önce numuneleri düşük hızda 3 sn'lik vorteksle yapın (bkz.
   NOT: (FACS kurulumu) Ayıklama makinelerinin, prosedürün başlangıcında üreticinin tavsiyelerine uygun olarak kalibrasyon parçacıklarıyla hizalanması gerekir. Düşme gecikmesi, FACS modeline göre boncuklar veya mikrosferlerle kalibre edildi (bkz. Numuneler saflık modunda 4 °C'de sıralandı. Toplama hacmini azaltmak için, çekirdekler akış sitometresi için önerilen basınçta 70 μm'lik bir nozuldan ayrıldı. Çekirdekler, 50 μL WM içeren 1.5 mL düşük bağlayıcı tüplere (bakınız Malzeme Tablosu) ayrıldı. Tüm toplama tüpleri, çekirdeğin tüpün duvarlarına yapışma riskini azaltmak için gece boyunca 4 ° C'de PBS +% 5 BSA ile kaplanmıştır.
3. Verileri lekeli çekirdek süspansiyonunun bir örneğinden elde etmek için, hücre kalıntılarını ve toplanmış çekirdekleri dışlamak için kapıları DAPI yüksekliğinde ve DAPI alanında ayarlayın (Şekil 2A). Ayrıca, kapıları log Side scatter (SSC)-area ve log Forward scatter (FCS)-area (Şekil 2B) olarak ayarlayarak kalan DAPI lekeli agregalardan veya hücre kalıntılarından tek çekirdekleri ayırın.
4. Şekil 2C'de gösterildiği gibi, NeuN-AF488-negatif popülasyonu izole etmek için anti-NeuN-AF488 ve FSC alanı için kapıları ayarlayın.
5. Analizden sonra, yukarıda açıklanan geçit stratejisini kullanarak, NeuN-AF488-negatif popülasyonu, 50 μL WM ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir toplama tüpünde sıralayın.
   NOT: Yukarıda açıklanan geçit stratejisini ve DG'yi yetişkin bir farenin beyninden izole etmek için diseksiyon prosedürünü takiben, NeuN-AF488-negatif popülasyonun tek çekirdeğin ~% 14'ünü temsil etmesi beklenmektedir.

Şekil 2: NeuN-AF488 negatif tek çekirdeği izole etmek ve hücre kalıntılarını dışlamak için DG. (A-C) Geçit stratejisinden nöronal olmayan hücre popülasyonlarının izolasyonu ve transkriptomik profillemesi. (A) FANLAR, DAPI+ çekirdeklerinin seçimi ve hücre kalıntılarının ve agregalarının dışlanması için kapı ayarını gösteren, izole edilmiş çekirdeklerin temsili bir örneğinin nokta grafiği. (B) FSC alanı ve SSC alanı kullanılarak ilgili tek çekirdeklerin daha fazla seçimi. (C) NeuN-AF488'in pozitif popülasyonu dışlaması ve negatif tek çekirdekleri sıralaması için kapılar. (D) Kötü kaliteli çekirdeklere (beyaz ok) kıyasla minimum miktarda enkaz ve daha yüksek oranda kaliteli çekirdeklere (yuvarlak şekil, siyah ok) sahip iyi bir tek çekirdek süspansiyonunun mikrografisi. Ölçek çubukları = 50 μm, 10 μm (giriş). (E,F) snRNA-seq verilerinin analizi ve 22 aylık C57BL/6J erkek farelerin DG'sinden izole edilen farklı hücre popülasyonlarının profillenmesi. Boyut Azaltma için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP), (E) FACS-sıralanmamış hücrelerden ve (F) NeuN-negatif FACS-sıralanmış hücrelerden, hücre tipine göre renklendirilmiş tek çekirdek profillerinin grafikleri. (G) Her iki örnekte tanımlanan hücre tiplerinin frekanslarını karşılaştıran pasta grafikler. (H) Sıralanan örnekler için ilgili metrikler: çekirdek sayısı, medyan gen sayısı ve çekirdek başına transkript. (I) Her iki örnekte de her hücre tipi için tespit edilen gen sayısının ve transkriptlerin dağılımını gösteren keman grafikleri. Astr. = astrositler, Olig. = oligodendrositler, Vasc. = vasküler hücreler, CRC'ler = Cajal-Retzius hücreleri, Neur. = nöronlar, Imm. = bağışıklık hücreleri, OPC'ler = oligodendrositler öncü hücreler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

4. Tek çekirdekli RNA dizilimini gerçekleştirmek için tek çekirdek süspansiyonunun hazırlanması (Zamanlama: 30 dakika)

1. Sıralamadan sonra, tüpün duvarındaki damlacıkları toplamak için toplama tüpüne %1 BSA içeren 1 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. 50 μL bırakarak süpernatanı atın.
   NOT: Santrifüjlü çekirdekleri dikkatli bir şekilde kullanın, çünkü tüpün dibinde herhangi bir pelet gözlemlemek zor olabilir. Bir salıncak kovası santrifüjü kullanmak, peleti bozmadan süpernatantın atılmasına yardımcı olacaktır.
2. Pipet, santrifüjlü çekirdekleri yeniden askıya almak için nazikçe kullanılır. 0.5 mL'lik bir mikrotüp içinde 5 μL Tripan mavisine 5 μL çekirdek süspansiyonu ekleyin.
   DİKKAT: Tripan mavisini sağlık için tehlikeli olduğu, kansere neden olabileceği ve doğurganlığa veya doğmamış çocuğa zarar verdiğinden şüphelenildiği için dikkatli kullanın. Koruyucu eldiven, kıyafet, göz ve yüz koruyucu kullanın. Tüm güvenlik önlemleri okunup anlaşılana kadar elleçlemeyin.
3. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak konsantrasyonu ölçün ve tek hücreli süspansiyonun yaşayabilirliğini değerlendirin (bkz. Adım 5'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi kütüphane hazırlığını ve çekirdeklerin sıralanmasını gerçekleştirin.
   NOT: Dizileme için iyi kalitede olduğu düşünülen örnekler, mikroskop altında hücre kalıntıları olmadan yuvarlak ve düzenli çekirdek şekli göstermiştir (Şekil 2D). Nükleer membranın etrafında bir halenin varlığı veya çoklu çekirdeğin bir araya toplanması, hasarlı çekirdeklerin belirtileridir ve bu tür hücre süspansiyonları snRNA-seq için dikkate alınmamalıdır (Şekil 2D). Ölçülen çekirdek konsantrasyonu 300-700 çekirdek / μL aralığındaydı.

5. Kütüphane hazırlama ve sıralama

NOT: Aşağıdaki adımların tanımı, bu çalışmada kullanılan kurum içi sıralama platformuna dayanmaktadır (bkz. Bu nedenle, farklı bir platform kullanırken bazı ayarlar farklı olabilir. Burada, yalnızca önemli adımlar açıklanmaktadır ve her parametre, ilk kullanımdan önce optimizasyonla da olsa, seçilen üreticinin rehberliği ve protokolleri izlenerek belirlenmelidir. RNA bozulmasını önlemek ve dizilemenin optimum kalitesini sağlamak için sıralanmış çekirdek süspansiyonları konsantre edildikten sonra kütüphanelerin hazırlanmasının mümkün olduğunca çabuk yapılmasını sağlamak çok önemlidir.

1. 7.000 ila 10.000 çekirdeği mikroakışkan Tek Hücreli Çipe yükleyin.
2. Sağlanan kontrolörü ve seçilen tedarikçiden gelen reaktifleri kullanarak nanolitre ölçekli damlacıklarda yüklü çekirdekleri bölümleyin. Her damlacık içindeki liz çekirdekleri ve ters transkripsiyon RNA.
   NOT: Bir damlacık içinde ortaya çıkan tüm cDNA'lar aynı hücre barkodunu paylaştı.
3. Seçilen tedarikçinin yönergelerini izleyerek ve sıralama platformuyla uyumluluğu sağlayarak snRNA-seq için kütüphaneler hazırlayın. Elektroforez, florometri veya qPCR tabanlı yöntemler kullanarak nihai kütüphanelerin kalitesini ve konsantrasyonunu kontrol edin ve varsa, sıralamadan önce bunları eşit olarak bir araya getirin.
4. Denatüre 3ʹ gen ekspresyon kütüphanelerini bir araya getirdi ve üreticinin tavsiyesine göre seyreltin.
5. Hücre başına 50.000 okuma çifti sıralama derinliğine sahip yeni nesil bir sıralama platformunda çift uçlu, tek veya çift indeksleme dizilimi gerçekleştirin.

Burada sunulan protokol, snRNA-seq gerçekleştirmek için DG'den izole edilen nöronal olmayan tek çekirdeklerin süspansiyonunu hazırlamak için bir yöntemi açıklamaktadır. FANS'lı veya fanssız, biyoinformatik kümeleme, DG içindeki bilinen hücre tiplerine karşılık gelen iyi ayrılmış çekirdek gruplarını ortaya çıkardı (Şekil 2E, F). FACS-sıralanmamış örnekte, dizilenen yüksek kaliteli çekirdeklerin çoğunluğu üç nöron grubundan oluşuyordu (bu örnek için toplam çekirdeğin% 84.9'u, Şekil 2E, G, H). DG'de en çok temsil edilen hücre popülasyonlarının granül nöronlar, diğer uyarıcı nöronlar (uyarıcı nöronlar olarak etiketlenmiş) ve inhibitör nöronlar10 olduğu göz önüne alındığında, bu tür sonuçlar beklenmektedir. Tanımlanan nöronal olmayan kümeler çoğunlukla astrositler, oligodendrositler ve oligodendrosit öncü hücreleri (OPC'ler), bağışıklık hücreleri (% 3.3) ve Cajal-Retzius hücreleri (% 0.6) dahil olmak üzere glial hücre tiplerinden (% 11.1) yapılmıştır. NeuN pozitif popülasyonlarını dışlamak için FANS uygularken (NeuN-negatif FACS-sıralanmış örneklem; Şekil 2F,G,H), glial hücre kümeleri baskın hale geldi (%81.3). Daha fazla sayıda glial çekirdeğin izolasyonu, FANS olmadan bir araya gelecek farklı popülasyonların daha iyi bir segmentasyonuna izin verir. Gerçekten de, NSC'lerde veya astrositlerde eksprese edilen spesifik genlerin yeniden kümelenmesi ve analiz edilmesinde, dört alt küme ayrıldı (Ek Şekil 2A, B). Daha spesifik hücresel belirteçlere bakıldığında ve hücre tipleri boyunca gen ekspresyon seviyelerini değerlendirerek, Hopx ve Notch2'nin daha yüksek ekspresyonuna sahip ana astrositik popülasyonlardan ayrı olarak ayrılan ve neredeyse hiç Aldh1a1 veya Aqp4 ekspresyonu olmayan küçük bir NSC kümesi tespit edildi (Ek Şekil 2C). Bununla birlikte, astrositler ve NSC'ler arasındaki gen ekspresyonundaki örtüşme nedeniyle, farklı alt hücre tiplerini spesifik olarak profillemek ve tanımlamak için daha fazla analiz yapılması gerekecektir. Ayrıca, NeuN-negatif FANS örneği, hücreye özgü belirteçlerin ekspresyonu için çapraz referans alındığında endotel hücrelerini, perisitleri ve vasküler leptomeningeal hücreleri kapsayan vasküler hücreler (% 2.3) olarak etiketlenmiş ek kümelere sahipti (veriler gösterilmemiştir).

Sıralama için kitaplıklar oluşturmak üzere seçilen protokole yönelik kılavuzun ardından, FANS'lı veya FANS'sız yüksek kaliteli ifade profilleri elde edildi. 50.000 okuma / çekirdekte sıralanan örnekler için, düşük kaliteli çekirdekleri filtreledikten sonra, FACS-sıralanmamış örnek (5.578 transkript, Şekil 2H) için çekirdek başına ortalama 2.510 gen ve NeuN-negatif FANS örneği için 1.665.5 gen (3.508 transkript) tespit edildi (Şekil 2H, I). Bu metrikler, bu protokolün farklı yaklaşımlar kullanan çalışmalarla karşılaştırılabilir tek çekirdeklerin yüksek kaliteli transkriptomik profilini oluşturduğunu 22,23 ve FACS sıralama işleminin sonraki snRNA-seq için çekirdeklere zarar vermediğini doğrulamaktadır. Özellikle, iki örnek arasındaki çekirdek başına gen ve transkript sayısındaki fark, düşük veri kalitesinden değil, FACS-sıralanmamış numunedeki nöronların yüksek oranından (NeuN-negatif FANS örneğinde% 1.7'ye kıyasla% 84.9), daha yüksek bir transkripsiyonel aktiviteye (FACS-sıralanmamış örnekte 2.660 gen / çekirdek ve 6.170 transkript / çekirdek) sahip olan nöronların yüksek oranından kaynaklanmaktadır. transkriptler/çekirdek, Şekil 2I).

Birlikte, bu temsili sonuçlar, FANS kullanarak NeuN negatif çekirdeklerinin seçiminin, düşük bolluktaki hücre tiplerini yeni disseke edilmiş beyin dokusundan izole etmek ve snRNA-seq yöntemleri aracılığıyla bu farklı hücre popülasyonlarının yüksek kaliteli tek çekirdekli transkriptomik profillemesini gerçekleştirmek için güçlü bir araç olduğunu göstermektedir.

Ek Şekil 1: FANS için immün boyamanın doğrulanması. Çekirdek süspansiyonu (A) negatif kontrol olarak anti-NeuN-AF 488 antikoru olmadan veya (B) antikor ile inkübe edildi ve immün boyama koşullarını doğrulamak için FACS sıralayıcısından geçirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Gen ekspresyon analizi ve astrosit kümesinin yeniden kümelenmesi. (A) Boyut Azaltma için Tekdüze Manifold Yaklaşımı ve Projeksiyonu (UMAP) grafiği, Şekil 2F'deki genom çapında ekspresyon profillerine dayanarak 4968 çekirdeğin kümelenmesini göstermektedir. Hücre tipi çağrılar, hücre tipi belirteçlere göre yapıldı. (B) Astrosit kümesi, potansiyel hücresel alt tipleri araştırmak için daha fazla alt ayar için (A) 'dan seçilen 2579 çekirdekten oluşur. Farklı renklerle gösterilen Seurat (0-3) kümelemesi ile dört alt tip tespit edildi. (C) Dört hücre tipi boyunca spesifik hücresel belirteçlerin gen ekspresyon seviyeleri. Tüm arsalar Seurat R paketi24 kullanılarak elde edildi. Kısaca, RNA-seq sayıları her hücre için toplam ekspresyon ile normalleştirildi ve ölçek faktörü (10.000) ile çarpıldı. Bu sonuç daha sonra log dönüştürüldü. Dönüştürülen değerler, x ve y eksenlerinde değer olarak kullanılan gömmeleri hesaplamak için UMAP uygulanmadan önce her hücre içinde ölçeklendirildi (varyans bire ölçeklendirildi) ve ortalandı (ortalama sıfıra ayarlandı). Grafikler, her noktanın, indirgeme tekniği tarafından belirlenen hücre gömmelerine dayanan ilgili x ve y koordinatlarına sahip bir hücreyi temsil ettiği bir 2B dağılım grafiği üzerindeki boyutsal indirgeme tekniğinin çıktısını temsil eder. Benzer gen imzalarına sahip hücreler, gömmeler tarafından birbirine yakın konumlandırılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: Nörojenik soyda NeuN'nin gen ekspresyon analizi. (A) Nörojenik soyun kümelenmesini halka açık veri kümesi15'ten gösteren UMAP grafiği. UMAP'ler Ek Şekil 2'de olduğu gibi oluşturulmuştur. (B) Astrosit (Aquaporin 4 = Aqp4), NSC'ler (yalnızca Homeodomain proteini = Hopx), NeuN / Rbfox3 (NSC'ler ve ara progenitör hücreler [IPC'ler]) ve döngü hücrelerini (Siklin bağımlı kinaz 6 = Cdk6) gösteren nörojenik soy boyunca spesifik hücresel belirteçlerin gen ekspresyon seviyeleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo 1: Çalışmada kullanılan ortam ve tampon bileşimleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

SG, TL ve SK, ABD ve Kanada dışında MSD olarak bilinen Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, ABD'nin bir yan kuruluşu olan Merck Sharp & Dohme LLC'nin çalışanlarıdır. SG, Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, ABD'nin hissedarıdır.