Method Article

İnsan Eklem Kıkırdak Eksplantlarında Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı Mikro Girintide Pratik Konuların Ele Alınması

DOI:

10.3791/64371

⸱

October 28th, 2022

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital Tübingen, 2Department of Oral and Maxillofacial Surgery, University Hospital Tübingen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Atomik kuvvet mikroskobu mikro girintileriyle ilgili en yaygın sorunları belirlemek ve ele almak için adım adım bir yaklaşım sunuyoruz. Çeşitli derecelerde osteoartrit kaynaklı dejenerasyon ile karakterize edilen yerli insan eklem kıkırdak eksplantlarında ortaya çıkan sorunları örneklendiriyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şüphesiz, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda biyolojik alandaki mikro ve hatta nano ipuçlarını değerlendirmek için en güçlü ve kullanışlı tekniklerden biridir. Bununla birlikte, diğer mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi, metodolojik zorluklar ortaya çıkabilir. Özellikle, numunenin özellikleri, numune hazırlama, alet tipi ve girinti probu istenmeyen artefaktlara yol açabilir. Bu protokolde, ortaya çıkan bu sorunları sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde örneklendiriyoruz. Bu amaçla, ilk olarak, tüm doku eksplantlarının büyük 2D mozaik floresan görüntülemesi yoluyla, farklı dejenerasyon aşamalarına göre ex vivo eklem kıkırdak disklerinin nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak nasıl sınıflandırılacağını adım adım gösteriyoruz. Ex vivo modelin en büyük gücü, erken başlangıçtan ilerlemeye kadar osteoartrit ile ilişkili değişikliklerin araştırılmasına izin veren yaşlı, yerli, insan kıkırdağını içermesidir. Ek olarak, doku hazırlamadaki yaygın tuzakların yanı sıra gerçek AFM prosedürü ve sonraki veri analizi de sunulmaktadır. Numune hazırlama ve işleme, gelişmiş dejenerasyonun neden olduğu topografik numune özellikleri ve numune-uç etkileşimi gibi temel ancak önemli adımların veri toplamayı nasıl etkileyebileceğini gösteriyoruz. Ayrıca AFM'deki en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkün olduğunda bunların nasıl üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bu sınırlamaların bilinmesi, doğru veri toplama, yorumlama ve nihayetinde bulguların geniş bir bilimsel bağlama yerleştirilmesi için son derece önemlidir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elektronik cihazların ve sistemlerin sürekli küçülen boyutu nedeniyle, mikro ve nano tabanlı teknoloji ve ekipmanların hızlı gelişimi ivme kazanmıştır. Böyle bir cihaz, biyolojik yüzeyleri tarayabilen ve hem nano hem de mikrometre ölçeklerinde topografik veya biyomekanik bilgileri alabilenatomik kuvvet mikroskobudur (AFM) 1,2. Geniş özellikleri arasında, bu araç, çeşitli biyolojik sistemlerin mekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için bir mikro ve bir nano girinti olarak çalıştırılabilir 3,4,5,6. Veriler, ucunda yaklaşık 1 nm kadar küçük olabilen mekanik bir prob aracılığıyla yüzeyle fiziksel temas yoluyla toplanır7. Numunenin ortaya çıkan deformasyonu daha sonra konsol ucunun girinti derinliğine ve numuneye uygulanan kuvvetegöre görüntülenir 8.

Osteoartrit (OA), eklemlerde ve çevre dokularda eklem kıkırdağının bozulması ile karakterize, kemik yüzeylerinin tamamen açığa çıkmasına yol açabilen uzun süreli dejeneratif kronik bir hastalıktır. AE'nin yükü büyüktür; Şu anda, 65 yaş ve üstü tüm kadınların yarısı ve tüm erkeklerin üçte biri OA9'dan muzdariptir. Travmalar, obezite ve bunun sonucunda eklemindeğişmiş biyomekaniği 10, ortak bir sonuç olarak görülen eklem kıkırdak dejenerasyonunu belirler. Ganz ve arkadaşlarının öncü çalışması, OA sürecinin ilk adımlarının kıkırdak11'in biyomekanik özelliklerini içerebileceğini öne sürdü ve o zamandan beri araştırmacılar bu hipotezidoğruladılar 12. Benzer şekilde, dokunun biyomekanik özelliklerinin, hücre-hücre ve hücre-matris karışmasının yanı sıra ultrastrüktürel organizasyon tarafından işlevsel olarak düzenlendiği genel olarak kabul edilir. Herhangi bir değişiklik, genel doku biyomekanik işleyişini önemli ölçüde etkileyebilir13. Bugüne kadar, OA tanısı kliniktir ve düz film radyografisine dayanmaktadır14. Bu yaklaşım iki yönlüdür: birincisi, OA tanısını formüle etmek için tanımlanmış bir dejeneratif kesme eşiğinin olmaması, durumun ölçülmesini zorlaştırır ve ikincisi, görüntüleme yöntemleri duyarlılık ve standardizasyondan yoksundur ve lokalize kıkırdak hasarını tespit edemez15,16,17. Bu amaçla, kıkırdağın mekanik özelliklerinin değerlendirilmesi, hastalığın etiyolojisinden bağımsız olarak OA'nın seyri sırasında değişen ve çok erken bir aşamada doku işlevselliği üzerinde doğrudan etkisi olan bir parametreyi tanımlaması gibi belirleyici bir avantaja sahiptir. Girinti aletleri, dokunun girintiye direnme kuvvetini ölçer. Bu aslında yeni bir kavram değil; En eski çalışmalar 1980'lere ve 1990'lara kadar uzanıyor. Bu dönemde, çok sayıda çalışma, eklem kıkırdağının artroskopik ölçümleri için tasarlanmış indentasyon aletlerinin kıkırdaktaki dejeneratif değişiklikleri saptamak için çok uygun olabileceğini düşündürmektedir. 30 yıl önce bile, bazı çalışmalar, girinti aletlerinin artroskopi sırasında basınç sertliği ölçümleri yaparak doku dejenerasyonu sırasında kıkırdak yüzeyindeki in vivo değişiklikleri tespit edebildiğini gösterebildi18,19,20.

Eklem kıkırdağının AFM girintisi (AFM-IT), dokunun önemli bir mekanik özelliği, yani sertlik hakkında bilgi sağlar. Bu, uygulanan, tahribatsız bir yük ile girintili doku alanının21 ortaya çıkan deformasyonu arasındaki ilişkiyi tanımlayan mekanik bir parametredir. AFM-IT'nin makroskopik olarak etkilenmemiş kollajen ağlarında sertlikteki yaşa bağlı değişiklikleri ölçebildiği, böylece OA başlangıcı ile ilişkili patolojik değişiklikler arasında ayrım yapabildiği gösterilmiştir (eklem kıkırdağında Outerbridge ölçeğinde derece 0)22. Daha önce, AFM-IT'lerin, erken kıkırdak dejenerasyonu için görüntü tabanlı bir biyobelirteç olarak uzamsal kondrosit organizasyonu temelinde, en erken dejeneratif mekanik değişikliklerin yalnızca ölçülmesine değil, aynı zamanda gerçekten belirlenmesine de izin verdiğini göstermiştik. Bu bulgular başkaları tarafından zaten doğrulanmıştır23,24. Bu nedenle, AFM-IT, erken dejeneratif değişiklikleri teşhis etmek ve tanımlamak için ilginç bir araç görevi görür. Bu değişiklikler zaten hücresel düzeyde ölçülebilir ve OA patofizyolojik sürecinin anlaşılmasını yeniden şekillendirir.

Bu protokolde, doğal kıkırdak eksplantlarının hazırlanmasından AFM veri toplama ve işlemeye kadar eklem kıkırdak eksplantlarının eksiksiz bir histolojik ve biyomekanik derecelendirme prosedürünü gösteriyoruz. Adım adım bir yaklaşımla, eklem kıkırdak dokusunun farklı dejenerasyon aşamalarına göre nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak sınıflandırılacağını, 2D büyük mozaik görüntüleme ve ardından mikro-AFM girintileri ile gösteriyoruz.

Şu anda, AFM-IT, kıkırdaktaki7 biyomekanik değişiklikleri ölçmek için en hassas araçlardan biri olmasına rağmen, diğer herhangi bir enstrümantal teknik gibi, hatalı veri toplamaya yol açabilecek sınırlamaları ve pratik özellikleri25 vardır. Bu amaçla, kıkırdak eksplantlarının AFM ölçümleri sırasında ortaya çıkan en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkünse bunların nasıl en aza indirileceğini veya üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bunlar, numunelerin topografik yönlerini ve bunları AFM uyumlu bir ortamda stabilize etmenin zorluklarını, doku yüzeyinin fiziksel özelliklerini ve bu tür yüzeylerde AFM ölçümlerinin gerçekleştirilmesinde ortaya çıkan zorlukları içerir. Hatalı kuvvet-mesafe eğrilerinin örnekleri de sunulmakta ve bunlara neden olabilecek koşullar vurgulanmaktadır. Konsol ucunun geometrisine özgü ek sınırlamalar ve veri analizi için Hertz modelinin kullanımı da tartışılmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Almanya'da Tübingen Üniversite Hastanesi'nde total diz artroplastisi yapılan hastalardan toplanan femoral kondiller kullanıldı. Bu çalışmaya sadece dejeneratif ve posttravmatik eklem patolojileri olan hastalardan alınan eklem kıkırdak örnekleri dahil edildi. Çalışma başlamadan önce bölüm, kurum ve yerel etik kurul onayı alınmıştır (Proje no.674/2016BO2). Katılım öncesi tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

NOT: Deney adımlarının kronolojik sırasına göre bir akış şeması Şekil 1'de verilmiştir.

1. Doku işleme ve kıkırdak disklerinin oluşturulması

  1. Doku hazırlığı
    1. Ameliyat sonrası rezeksiyonu takiben, kıkırdak örneklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) ile dolu bir kaba koyun. Numunelerin ortama tamamen daldırıldığından emin olun. Cerrahi rezeksiyon ile kıkırdağın daha fazla işlenmesi arasındaki süre 24 saati geçmemelidir. Numunenin kurumasını önlemek için tüm işlem boyunca numunelerin tamamen ortama daldırıldığından emin olun.
    2. Bir neşter kullanarak kıkırdağı kemikten kesin.
  2. Kıkırdak disk üretimi
    1. Biyopsi zımbası kullanarak 4 mm çapında kıkırdak diskleri oluşturun.
      NOT: Kıkırdak tabakası kalınlığının 1 mm'yi geçtiği kondil bölgelerinin seçilmesi ve çıkarılması önemlidir. Bu, özellikle kıkırdak tabakasının tipik olarak aşınma ve yıpranma süreçleri veya dejenerasyon nedeniyle kalınlığını kaybettiği yük taşıma bölgelerinde sorunlu olabilir.
    2. Önceden oluşturulmuş 4 mm'lik kıkırdak diskleri özel yapım bir kesme cihazına yerleştirin ve kıkırdak diskleri bir spatula yardımıyla sabitleyin ve sabit tutun. Kıkırdak diskleri kesme cihazına yerleştirirken dikkatli olunmalıdır. Numuneleri, kıkırdağın en üst tabakası (eklem kıkırdağının yüzeysel bölgesi) bıçağa bakmayacak şekilde konumlandırın
    3. Kıkırdak diskleri jiletle kesin. Böylece 4 mm x 1 mm'lik disk şeklinde kıkırdak örnekleri oluşturulur. Numunenin kurumasını önlemek için, doku kesimini mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
    4. Her diski bir spatula yardımıyla toplayın ve oluşturulan kıkırdak disklerini %5 (h/h) penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM içeren 1,5 mL'lik tüplere yerleştirin. Bir tüpe yaklaşık 15 disk yerleştirin.
  3. Kıkırdak disklerin kriyotom kesiti (dik dilimler için)
    NOT: Bu adım isteğe bağlıdır ve kıkırdak diskleri içindeki hücresel patern dağılımının yandan görünüşlü bir görselleştirmesi isteniyorsa kullanılabilir. Hücresel paternin dağılımı eklem kıkırdağının 3 boyutlu bir özelliği olduğu için bir doğrulama yöntemi olarak kullanılabilir26. Konfokal mikroskop kullanılarak tüm kıkırdak disklerinin optik kesitleri ve 3D rekonstrüksiyonları da kullanılabilir, bu nedenle numunelerin protokolde açıklandığı gibi kesitlenmesi ihtiyacını ortadan kaldırır.
    1. Kıkırdak diskini suda çözünür gömme ortamı ile örtün ve kriyotom düğmesinin kenarına yerleştirin (diskin yüzeyi düğmenin yüzeyine dik olacak şekilde). Kriyotom cihazında, gömme ortamı düşük sıcaklıklarda donar.
    2. Standart bir kriyotom kullanarak, diskin ortasına ulaşılana kadar (yani kriyoseksiyonlar 4 mm uzunluğa ulaştığında) dokuyu 60 μm kalınlığında yanlara doğru bölümlere ayırın ve dilimleri toplayın. Disk eksplantını dik olarak bölümlere ayırarak, kıkırdağın tüm bölgeleri (yüzeysel, orta ve derin) görselleştirilebilir.
    3. Bölümleri bir cam slayt üzerinde toplayın ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile üç kez yıkayarak suda çözünür gömme ortamını çıkarın.

2. Hücresel uzamsal modelin bir fonksiyonu olarak kıkırdak disk sıralaması

  1. Disk şeklindeki kıkırdak örneklerinin boyanması
    1. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna bir kıkırdak diski (bölüm 1.2) yerleştirin ve her oyuğa 1:1.000 seyreltmede 130 μL hücre geçirgen floresan boya ekleyin.
    2. Tüm plakayı görsel olarak inceleyin ve her bir oyuğa yalnızca bir disk yerleştirildiğinden emin olun. Plakayı 37 ° C'de standart hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika inkübe edin.
  2. 60 μm'lik kıkırdak dilimlerinin boyanması
    1. Kıkırdak disk kesitlerini (bölüm 1.3) forseps yardımıyla cam mikroskop lamlarına nazikçe yerleştirin.
    2. Kıkırdak bölümlerini nükleer DAPI karşı boyama içeren montaj ortamı ile örtün ve floresan mikroskobu için uygun lameller hafifçe yerleştirin.
    3. Her lamelin kenarlarını normal şeffaf oje ile kapatın ve 3 dakika kurumasını bekleyin.
  3. Yukarıdan aşağıya ve yandan görünüşlü kıkırdak sıralama ve görüntüleme
    NOT: Her disk floresan mikroskobu altında incelenmelidir. Bu adımın amacı, diskleri baskın hücresel modellerine (tek sicimler, çift sicimler, küçük kümeler, büyük kümeler veya dağınık) göre sıralamaktır.
    1. 96 oyuklu plakayı floresan mikroskobunun plaka tutucusuna yerleştirin.
    2. Em 495 nm/Ex 515 nm (bölüm 2.1'de hazırlanan kıkırdak disklerinin yukarıdan aşağıya görüntülenmesi için) veya Em 358 nm/Ex 461 nm (bölüm 2.2'de hazırlanan kıkırdak bölümlerinin yandan görünüm görüntülemesi için) ve 10x objektif için uygun floresan filtresini seçin.
      NOT: 10x objektifin kullanılması, diskin tüm çevresinin incelenmesine olanak tanır ve homojen olmayan veya uygun olmayan boyamaya sahip numuneler hariç tutulabilir. Bununla birlikte, yalnızca yukarıdan aşağıya görünümün kullanılması, yüzeysel erozyon ile yukarıdan aşağıya gözlem için görünür hale getirilen daha derin doku katmanlarının analizinin bir sonucu olarak hücresel organizasyondaki değişikliklerin algılanmasına neden olabilir. Örnek olarak, kollajen kemerlerini takip eden artan bir ip, tek bir hücre veya dağınık hücreler (dağınık desen) olarak algılanabilir26. Sonuç olarak, uygun hücresel model seçimini sağlamak için disklerin her iki tarafı da incelenmelidir.
    3. Her kıkırdak diskinde görüntülenen hücresel deseni görsel olarak belirleyin. Bir diskin yalnızca bir tür hücresel modele sahip olması olası değildir. Diskin kondrosit düzenlemesinin ilgilenilen modelle eşleşmediği kısmı için, numuneleri yalnızca istenmeyen desen AFM ölçümlerinin yapılmadığı (yani, disk sınırından 0,5 mm'ye kadar) en çevredeyse kabul edin ve bunun diskin toplam yüzeyinin %10'unu geçmediğinden eminolun 27, 28.
  4. Tüm kıkırdak disklerinin görüntü alımı
    1. Mikroskobun 10x objektifini seçin ve ayrı bir kıkırdak diski içeren önceden seçilmiş kuyunun altına yerleştirin. Hücresel deseni görmek için diske odaklanın.
    2. Tüm kuyuya genel bir bakış elde etmek için Gezgin İşlevini seçin. Farklı bir sahne konumuna gitmek için farenin sol düğmesini kullanın ve sürükleyin. Fare tekerleği ile yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
      NOT: Bu noktada, her bir ilgi alanına sırayla çift tıklanarak tüm numuneyi içeren kuyunun bir önizlemesi görülebilir.
    3. Taranacak ilgi alanını kapsayan bir kare seçin; Bu noktada, mozaiği oluşturan tüm tek karolar görünür hale gelecektir.
    4. Hücrelerin arka plandan net bir şekilde görselleştirilebilmesi için pozlamayı/ışık yoğunluğunu ayarlayın. Bu noktada, resmin parlaklığı/kontrastı tüm döşemeler için ayarlanmıştır ve artık her döşeme için ayrı ayrı özelleştirilemez.
      NOT: Diskin kenarına yakın hücreler genellikle merkezdeki hücrelerden daha yüksek bir floresan sinyali yaydığından, pozlama/ışık yoğunluğu ayarlarının uyarlanması gerekir.
      1. Pozlama süresinin belirli bir kanal için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, histogramdaki sinyalin dağılımını inceleyin. Mikroskobun görüntü yazılımında bulunan otomatik pozlama mekanizmasını kullanarak, disk içinde bulunan tüm hücreleri görselleştirin.
    5. Yazılımın Odak Haritası Noktası seçeneğini seçin ve ardından ortasına sol tıklayarak her bir döşemeyi seçin.
    6. Odak Haritası seçeneğini seçin. Önceden seçilen tüm kutucukları içeren bir pencere görüntülenir. Görüntülemek ve doğru odağa getirmek için listedeki bir kutucuğa çift tıklayın.
    7. Odak planını kaydetmek ve bir sonraki kutucuğa geçmek için Z Ayarla'yı tıklatın. Her bir döşeme için odak planını ayarladıktan sonra, Taramayı Başlat'a basarak görüntü almaya başlayın.
      1. Tarama daha koyu yatay ve/veya dikey çubuklar görüntülüyorsa, bunun nedeni tek karelerin yanlış ve eşit olmayan şekilde aydınlatılması olabilir. Bunu, gerçek taramadan önce yazılımda bulunan Bağlantılı Gölgelendirme seçeneğini kullanarak çözün.
    8. Görüntüleri kaydedin, dışa aktarın ve doğru şekilde açıklama ekleyin.

3. Kıkırdak eksplantlarının biyomekanik yaklaşımı

  1. AFM ölçümleri için numune hazırlama
    1. Hücresel bir desen (bölüm 2) içeren önceden seçilmiş her kıkırdak diskini biyouyumlu yapıştırıcı ile Petri kaplarına sabitleyin. Diskin üst, alt, sol ve sağ taraflarına yeterli miktarda numune yapıştırıcısı ekleyin.
    2. Diskleri L-glutamin içermeyen 2,5 mL Leibovitz L-15 ortamı ile örtün. Ortam tarafından oluşturulan dalgalar nedeniyle numunenin yüzeyden ayrılmasını önlemek için Leibowitz ortamını numunelerin üzerine nazikçe ekleyin.
  2. Numunelerin AFM'ye yüklenmesi
    1. Petri kabını AFM cihazının numune tutucusuna yerleştirin ve 37 °C'ye ayarlanmış Petri bulaşık ısıtıcısını açın. Doku kültürü kabının istenen sıcaklığa ulaşmasına izin verin. Bu, sıcaklık değişiminin neden olduğu olası artefaktları dışlamak için yapılır.
  3. AFM-konsol kalibrasyonu
    1. Yazılım kurulumunu daha önce Danalache ve ark.29 tarafından açıklandığı gibi başlatın.
    2. Sıvı ölçümleri için uygun bir cam blok konsol tutucu seçin ve dikkatlice AFM kafasına yerleştirin. Bir kilitleme mekanizması, cam bloğu AFM kafasına sabitler. Cam bloğun yansıtıcı yüzeyinin düz ve AFM tutucuya paralel olduğundan emin olun.
    3. Konsolu cam blok konsol tutucunun yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Konsolun kendisi, cam bloğun ortasındaki cilalı optik düzlem üzerinde durmalıdır.
    4. AFM kafasında orta yoğuşmayı önlemek için konsol tutucunun tabanına dikkatlice bir silikon etek (silikon membran) yerleştirin.
    5. Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 100 μm'lik adımlarla tamamen ortama daldırılana kadar indirin.
    6. Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan yaklaşım parametreleriyle bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın. Petri kabının dibine ulaşıldığında konsolu 100 μm geri çekin.
    7. Tam adımları kullanarak konsolu kalibre edin ve Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan parametreleri çalıştırın. Kalibrasyonun sonunda, dikey sapma kaydedilir ve fotodiyot dedektörü tarafından orijinal kayıt birimi olan volt (V) yerine Newton (N) kuvvet birimlerinde görüntülenir. Buradaki deneylerde, kalibrasyondan sonra 4.47 nN'lik bir ayar noktası ortaya çıktı.
    8. Step motor fonksiyonunu kullanarak konsolu 1.000 μm'ye kadar geri çekin.
  4. AFM altında istenen kıkırdak ölçüm yerinin belirlenmesi
    NOT: Kıkırdak disklerin kalınlığının 1 mm olması nedeniyle, numune üzerinde gezinirken konsol görüş alanında görünmez.
    1. Konsolu tanımlamak için mikroskobun CCD kamerasını kullanın. AFM konsolu, Petri kabının numune alınmayan bir alanına yerleştirilmelidir.
    2. Danalache ve ark.29 tarafından açıklanan parametrelerin aynısını kullanarak, Petri kabının temiz, örneksiz bir alanında konsol ile bir tarayıcı yaklaşımı başlatın.
    3. Step motor kontrolü ile konsolu plakanın altından 1.5 mm uzağa geri çekin. Bu adım, konsol ile numune arasında doğrudan bir çarpışmayı önlemek için çok önemlidir.
    4. Parlak alandan floresan görünümüne geçin ve diskin üst kısmını görsel olarak belirleyin.
    5. AFM numune tutucuyu diskin ortasına doğru tam olarak 2 mm hareket ettirin. Bu nokta kıkırdak diskin merkezi olarak kabul edilir.
    6. Bir tarayıcı yaklaşımı çalıştırın ve kıkırdak diskin yüzeyine ulaşıldığında, konsolu 100 μm geri çekin.
  5. Kuvvet-mesafe eğrisi ölçümleri
    1. İstenilen ölçüm bölgesinde konumlandırılan hücrelere odaklanın. Ölçümleri ve hedeflenen konumda kuvvet-mesafe eğrilerinin oluşturulmasını başlatmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
    2. Her ölçüm bölgesinde beş kuvvet-mesafe eğrisi elde edin. Konsolu 500 μm geri çekin ve konsolu bir sonraki ölçüm alanına taşıyın.
      NOT: Kıkırdak disk yüzeyi homojen olmadığı ve düzensizlikleri olduğu için konsolun geri çekilmesi çok önemli bir adımdır. Numunenin yüzeyindeki yüksek bir tepecik, dramatik bir çarpışmaya neden olarak istenmeyen konsol ucuna/numune hasarına yol açabilir. Diskin yüzeyine dağılmış en az beş farklı ölçüm bölgesi seçmenizi ve her bölgede en az beş kuvvet mesafesi eğrisi elde etmenizi öneririz.
    3. Kuvvet mesafesi eğrilerini inceleyin ve kaydedin.
  6. Hertz uyum modeli kullanılarak Young moduli'nin tahmini
    1. Analiz edilecek oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerini (.jpk dosyası) veri analiz yazılımında Toplu Spektroskopi Eğrileri Aç seçeneğini kullanarak açın.
    2. Hertz sığdırma modelini seçin ve ardından Esneklik sığdırma seçeneğini belirleyin.
      1. Esneklik sığdırma seçeneği, seçilen kuvvet mesafesi eğrisi üzerinde aşağıdaki hesaplamaları otomatik olarak gerçekleştirir: taban çizgisini hesaplar ve taban çizgisi uzaklığını kaldırmak için tüm eğriden çıkarır (taban çizgisi y ekseninde sıfıra geri getirilir); kuvvet-mesafe eğrisinin sıfır kuvvet çizgisini geçtiği noktayı tespit ederek temas noktasını belirler (temas noktası x ekseninde sıfıra ayarlanır); uç-numune ayrımını hesaplar (konsolun bükülmesini hesaba katan piezo'nun yükseklik sinyali çıkarılır); ve kuvvet-mesafe eğrisini seçilen modele otomatik olarak uyar. İstenirse, bu adımların her biri bağımsız olarak da gerçekleştirilebilir.
    3. Aşağıdaki uyum parametrelerini kullanarak uyarlayın: 0,5 Poisson oranı ve uygun konsol ucu yarıçapı.
      NOT: Küresel konsol uçlu bir konsol kullanırken, Hertz fit modeli kullanılmalıdır. Bu çalışmada kullanılan konsol, 5 μm yarıçaplı küresel bir uca sahipti. Uygulanan maksimum kuvvete ulaşılana kadar (ayar noktası) kuvvet mesafesi eğrisini takmanızı öneririz.
    4. Doğruluğu sağlamak için kuvvet-mesafe eğrisinin uyumunu görsel olarak kontrol edin. Bu adım, analiz edilen kuvvet-mesafe eğrilerinin her biri için yapılmalıdır.
  7. Girinti derinliği belirleme
    NOT: Kullanılan veri analiz aracına bağlı olarak bu işlem farklılık gösterebilir. Deneyci, veri analiz programında yer alan bir dizi adımı izleyerek girinti derinliğini kolayca okuyabilir.
    1. Oluşturulan kuvvet-mesafe eğrilerinin her birini veri analiz yazılımında açın ve analiz süreci olarak Hertz fit Modelini seçin.
    2. Dikey sapma eksenini (y ekseni) sıfırlamak için Taban Çizgisi Uzaklığını Çıkar seçeneğini uygulayın ve Kaydırma + Eğim işlevini seçin.
    3. Otomatik olarak sıfır x koordinatına getirilen temas noktasını otomatik olarak tanımlamak için Temas Noktası Bul işlevini kullanın.
    4. Dikey Uç Konumu işlevini kullanarak, girinti sırasında ham piezo yüksekliğinden yalnızca konsol sapmasını hesaba katan mesafeyi çıkarın.
    5. İşlenmiş kuvvet-mesafe eğrisini görüntülemek için Esneklik Sığdırma seçeneğini belirleyin ve grafiğin alanını, Dikey Uç Konumu Ekseninde (x ekseni) en negatif değerle hizalanacak şekilde seçin.
    6. Girintiyi parametre sekmesindeki X Min kutusundan okuyun ve belgeleyin. Sonuçları kaydedin ve belgeleyin.

4. İstatistiksel analiz

  1. İstatistik yazılımını açın. Açılan menüden Yeni Veri Kümesi'ni seçin.
  2. DataSet dosyasını seçtikten sonra Değişken Görünümü sekmesini açın. Her hücresel örüntü kategorisi için sayısal değişkenleri tanımlayın: tek diziler = SS, çift diziler = DS, küçük kümeler = SC, büyük kümeler = BC, dağınık ve Young moduli.
  3. Veri görünümü sekmesinde, karşılık gelen hücresel model kategorilerinin her biri için ölçülen Young modül verilerini girin. Menü çubuğundan Çözümle'yi ve ardından Araştırmacı Veri Analizi'ni seçerek veri dağıtımını analiz edin.
  4. Bağımlı değişken olarak Young'ın Moduli'sini ve faktör listesi olarak Hücresel Model'i seçin. Sonuçlar bölümü için kullanılan bir kutu çizimi, çıktı dosyasındaki sonuçlar arasında görüntülenir.
  5. İstatistiksel bir analiz yapmak için, analiz menü çubuğu sekmesinin parametrik olmayan test bölümünde Bağımlı Örnekler'i seçin. Alanlar sekmesi altında Test Alanları olarak Young's Moduli'yi ve Gruplar olarak Hücresel Desen'i seçin. Çalıştır'a basın.
    NOT: Sonuçlar çıktı dosyasında görüntülenir. İstatistiksel analiz için bir Friedman testi yapılır.
  6. Parametrik olmayan testin p değerlerini, adım 4.4'te oluşturulan kutu grafiğine dahil edin. Menü çubuğunda Dosya'ya tıklayıp Kaydet'i seçerek sonuçları kaydedin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendi kendine yapılan bir kesme cihazı kullanarak, tek bir hücresel uzamsal desen içeren taze insan kondillerinden küçük (4 mm x 1 mm) kıkırdak diskleri çıkarabildik ve üretebildik30 tek sicim (SS, Şekil 2A), çift sicimler (DS), küçük kümeler (SC), büyük kümeler (BC; Şekil 2A) ve dağınık (Şekil 2B). Temsili bir kıkırdak eksplantı Şekil 3A'da gösterilmiştir. Yalnızca bir tür desen...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlerleyici ve multifaktöriyel bir hastalık olan OA, eklem kıkırdağında yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri tetikler. OA seyri boyunca, mekanik özelliklerdeki bozulmalara eklem kıkırdağı yüzeyindeki yapısal ve biyokimyasal değişiklikler eşlik eder27,31. OA'da meydana gelen en erken patolojik olaylar, kollajen ağının bozulması ile birlikte proteoglikan tükenmesidir32,33,34

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tübingen Üniversite Hastanesi Ortopedik Cerrahi Anabilim Dalı'ndan ortopedi cerrahlarına doku örneklerini sağladıkları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amfoterisin BMerck KGaA, Darmstadt, Almanya1397-89-3
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kafası CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaJPK00518
Biyouyumlu numune yapıştırıcısı Bruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaH000033
CalceinCayman, Ann Arbor, Michigan, ABD14948Hücre zarı geçirgen boya, kıkırdak disk sıralama için kullanılır - üstten görünüm görüntüleme
Konsol Bruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaSAA-SPH-5UMFrekans Nom: 30KHz, k: 0.2N / m, uzunluk nom: 115μ m, genişlik nom: 40μ m,  geometri: dikdörtgen, 5&mu ile silindirik uç; m uç yarıçapı
Kıkırdak ctting cihazı Kendi kendine yapılan n/a4mmx1mm CDD kameranın önceden tanımlanmış bütünlerini içeren plastik kesme cihazı
The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Almanya FloresanDFK 31BF03
CDD kameraLeica Biosystems, Wetzlar, AlmanyaDFC3000G
CryotomeLeica Biosystems, Wetzlar, AlmanyaCM3050S 
Bruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaVeri İşleme Yazılımın/aSürüm 5.0.86,  aşağıdaki web sitesinden ücretsiz olarak indirilebilir https://customers.jpk.com
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Almanya41966052
Floresan Mikroskobu (Leica DMi8)Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya11889113
Cam blok cantiliver tutucuBruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaSP-90-05JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) ile kullanım için özel olarak tasarlanmış, açılı yüzeylere sahip ekstra uzun cam blok.
Ters faz kontrast mikroskobu (AFM'ye entegre)AxioObserver D1, Carl Zeiss Mikroskopi, Jena, AlmanyaL201306_03
Leibovitz'in L-glutamin içermeyen L-15 ortamı Merck KGaA, Darmstadt, AlmanyaF1315
Mikroskop cam slaytlarıSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABDCLS294775X50
DAPIibidi GmbH, Grä ile montaj ortamı; felfing, Almanya50011Kıkırdak diskleri için kullanılan nükleer DAPI (4 ve asal;, 6-diamidino-2-fenilindol) karşı boyama ile montaj ortamı ve yan görünüm görüntüleme
Penisilin-StreptomisinSigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABDP4333
AFM (Petri Bulaşık Isıtıcısı) ile ilişkili Petri bulaşık ısıtıcısıBruker Nano GmbH, Berlin, AlmanyaT-05-0117
NeşterFeather Medical Products, Osaka, Japonya2023-01
Silikon EtekBruker Nano GmbH, Berlin, Almanyan/aAFM kafasında orta yoğuşmayı önlemek ve nbsp; önlemek için cam bloğun tabanının temeline yerleştirilen koruyucu silikon membran (D55x0.25).
İstatistik programı - SPSSIBM, Armonk, New York, ABDSPSS Statistics 22Vesion 280.0.0.0 (190)
Doku kültürü yemekleri TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, İsviçreTPP93040
Tissue-tek O.C.T. BileşikSakura Finetek, Alphen aan den Rijn, HollandaSA6255012Suda çözünür gömme ortamı 
AFM'ye entegre edilmiş mikroskobuna entegre AFM için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allison, D. P., Mortensen, N. P., Sullivan, C. J., Doktycz, M. J. Atomic force microscopy of biological samples. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (6), 618-634 (2010).
  2. Deng, X., et al. Application of atomic force microscopy in cancer research. Journal of Nanobiotechnology. 16 (1), 102(2018).
  3. Radmacher, M. Studying the mechanics of cellular processes by atomic force microscopy. Methods in Cell Biology. 83, 347-372 (2007).
  4. Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
  5. Rabinovich, Y., et al. Atomic force microscopy measurement of the elastic properties of the kidney epithelial cells. Journal of Colloid and Interface Science. 285 (1), 125-135 (2005).
  6. Dufrêne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces. Nature Reviews Microbiology. 2 (6), 451-460 (2004).
  7. Cykowska, A., Danalache, M., Bonnaire, F. C., Feierabend, M., Hofmann, U. K. Detecting early osteoarthritis through changes in biomechanical properties - A review of recent advances in indentation technologies in a clinical arthroscopic setup. Journal of Biomechanics. 132, 110955(2022).
  8. Gavara, N. A beginner's guide to atomic force microscopy probing for cell mechanics. Microscopy Research and Technique. 80 (1), 75-84 (2017).
  9. Fuchs, J., Kuhnert, R., Scheidt-Nave, C. 12-Monats-Prävalenz von Arthrose in Deutschland. Journal of Health Monitoring. 2, 55-60 (2017).
  10. Felson, D. T. Osteoarthritis of the knee. New England Journal of Medicine. 354 (8), 841-848 (2006).
  11. Ganz, R., Leunig, M., Leunig-Ganz, K., Harris, W. H. The etiology of osteoarthritis of the hip. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (2), 264-272 (2008).
  12. Saxby, D. J., Lloyd, D. G. Osteoarthritis year in review 2016: Mechanics. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (2), 190-198 (2017).
  13. Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: Degeneration and osteoarthritis, repair, regeneration, and transplantation. Instructional Course Lectures. 47, 487-504 (1998).
  14. Braun, H. J., Gold, G. E. Diagnosis of osteoarthritis: Imaging. Bone. 51 (2), 278-288 (2012).
  15. Guermazi, A., Roemer, F. W., Burstein, D., Hayashi, D. Why radiography should no longer be considered a surrogate outcome measure for longitudinal assessment of cartilage in knee osteoarthritis. Arthritis Research & Therapy. 13 (6), 247(2011).
  16. Guermazi, A., et al. Different thresholds for detecting osteophytes and joint space narrowing exist between the site investigators and the centralized reader in a multicenter knee osteoarthritis study--Data from the Osteoarthritis Initiative. Skeletal Radiology. 41 (2), 179-186 (2012).
  17. Bedson, J., Croft, P. R. The discordance between clinical and radiographic knee osteoarthritis: A systematic search and summary of the literature. BMC Musculoskeletal Disorders. 9 (1), 116(2008).
  18. Dashefsky, J. H. Arthroscopic measurement of chondromalacia of patella cartilage using a microminiature pressure transducer. Arthroscopy. 3 (2), 80-85 (1987).
  19. Berkenblit, S. I., Frank, E. H., Salant, E. P., Grodzinsky, A. J. Nondestructive detection of cartilage degeneration using electromechanical surface spectroscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 116 (4), 384-392 (1994).
  20. Appleyard, R. C., Swain, M. V., Khanna, S., Murrell, G. A. The accuracy and reliability of a novel handheld dynamic indentation probe for analysing articular cartilage. Physics in Medicine and Biology. 46 (2), 541-550 (2001).
  21. Hsieh, C. H., et al. Surface ultrastructure and mechanical property of human chondrocyte revealed by atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 16 (4), 480-488 (2008).
  22. Stolz, M., et al. Early detection of aging cartilage and osteoarthritis in mice and patient samples using atomic force microscopy. Nature Nanotechnology. 4 (3), 186-192 (2009).
  23. Tschaikowsky, M., et al. Proof-of-concept for the detection of early osteoarthritis pathology by clinically applicable endomicroscopy and quantitative AI-supported optical biopsy. Osteoarthritis and Cartilage. 29 (2), 269-279 (2021).
  24. Tschaikowsky, M., et al. Hybrid fluorescence-AFM explores articular surface degeneration in early osteoarthritis across length scales. Acta Biomaterialia. 126, 315-325 (2021).
  25. Eaton, P., Batziou, K. Artifacts and Practical Issues in Atomic Force Microscopy. Atomic Force Microscopy: Methods and Protocols. Santos, N. C., Carvalho, F. A. , Springer. New York, NY. 3-28 (2019).
  26. Danalache, M., et al. Exploration of changes in spatial chondrocyte organisation in human osteoarthritic cartilage by means of 3D imaging. Scientific Reports. 11, 9783(2021).
  27. Danalache, M., et al. Changes in stiffness and biochemical composition of the pericellular matrix as a function of spatial chondrocyte organisation in osteoarthritic cartilage. Osteoarthritis and Cartilage. 27 (5), 823-832 (2019).
  28. Danalache, M., Erler, A. L., Wolfgart, J. M., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Biochemical changes of the pericellular matrix and spatial chondrocyte organization-Two highly interconnected hallmarks of osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2170-2180 (2020).
  29. Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of atomic force microscopy to detect early osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041(2020).
  30. Rolauffs, B., et al. Proliferative remodeling of the spatial organization of human superficial chondrocytes distant from focal early osteoarthritis. Arthritis and Rheumatism. 62 (2), 489-498 (2010).
  31. Wilusz, R. E., DeFrate, L. E., Guilak, F. Immunofluorescence-guided atomic force microscopy to measure the micromechanical properties of the pericellular matrix of porcine articular cartilage. Journal of The Royal Society Interface. 9 (76), 2997-3007 (2012).
  32. Guilak, F., Ratcliffe, A., Lane, N., Rosenwasser, M. P., Mow, V. C. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis. Journal of Orthopaedic Research. 12 (4), 474-484 (1994).
  33. Billinghurst, R. C., et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartilage. The Journal of Clinical Investigation. 99 (7), 1534-1545 (1997).
  34. Wu, P. J., et al. Detection of proteoglycan loss from articular cartilage using Brillouin microscopy, with applications to osteoarthritis. Biomedical Optics Express. 10 (5), 2457-2466 (2019).
  35. Loparic, M., et al. Micro- and nanomechanical analysis of articular cartilage by indentation-type atomic force microscopy: Validation with a gel-microfiber composite. Biophysical Journal. 98 (11), 2731-2740 (2010).
  36. Moshtagh, P. R., Pouran, B., Weinans, H., Zadpoor, A. The elastic modulus of articular cartilage at nano-scale and micro-scale measured using indentation type atomic force microscopy. Osteoarthritis and Cartilage. 22, 359-360 (2014).
  37. Danalache, M., Jacobi, L. F., Schwitalle, M., Hofmann, U. K. Assessment of biomechanical properties of the extracellular and pericellular matrix and their interconnection throughout the course of osteoarthritis. Journal of Biomechanics. 19, 109409(2019).
  38. Houtman, E., et al. Human osteochondral explants: Reliable biomimetic models to investigate disease mechanisms and develop personalized treatments for osteoarthritis. Rheumatology and Therapy. 8 (1), 499-515 (2021).
  39. Anderson, J. R., Phelan, M. M., Foddy, L., Clegg, P. D., Peffers, M. J. Ex vivo equine cartilage explant osteoarthritis model: A metabolomics and proteomics study. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3652-3667 (2020).
  40. Chen, C. T., Torzilli, P. A. In vitro cartilage explant injury models. Post-Traumatic Arthritis: Pathogenesis, Diagnosis and Management. Olson, S. A., Gauilak, F. , Springer. New York, NY. 29-40 (2015).
  41. Thudium, C. S., Engstrom, A., Groen, S. S., Karsdal, M. A., Bay-Jensen, A. -C. An ex vivo tissue culture model of cartilage remodeling in bovine knee explants. Journal of Visualized Experiments. (153), e59467(2019).
  42. Rolauffs, B., Williams, J., Grodzinsky, A., E Kuettner, K., Cole, A. Distinct horizontal patterns in the spatial organization of superficial zone chondrocytes of human joints. Journal of Structural Biology. 162 (2), 335-344 (2008).
  43. Deveza, L. A., Loeser, R. F. Is osteoarthritis one disease or a collection of many. Rheumatology. 57, 34-42 (2018).
  44. Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), 3269-3283 (2004).
  45. Sicard, D., Fredenburgh, L. E., Tschumperlin, D. J. Measured pulmonary arterial tissue stiffness is highly sensitive to AFM indenter dimensions. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 74, 118-127 (2017).
  46. Krieg, M., et al. Atomic force microscopy-based mechanobiology. Nature Reviews Physics. 1 (1), 41-57 (2019).
  47. Gavara, N. Combined strategies for optimal detection of the contact point in AFM force-indentation curves obtained on thin samples and adherent cells. Scientific Reports. 6, 21267(2016).
  48. Mow, V. C., Kuei, S. C., Lai, W. M., Armstrong, C. G. Biphasic creep and stress relaxation of articular cartilage in compression? Theory and experiments. Journal of Biomechanical Engineering. 102 (1), 73-84 (1980).
  49. Armstrong, C. G., Lai, W. M., Mow, V. C. An analysis of the unconfined compression of articular cartilage. Journal of Biomechanical Engineering. 106 (2), 165-173 (1984).
  50. Deng, L., et al. Fast and slow dynamics of the cytoskeleton. Nature Materials. 5 (8), 636-640 (2006).
  51. Fischer-Friedrich, E., et al. Rheology of the active cell cortex in mitosis. Biophysical Journal. 111 (3), 589-600 (2016).
  52. Gould, T. E., Jesunathadas, M., Nazarenko, S., Piland, S. G. Chapter 6 - Mouth Protection in Sports. Materials in Sports Equipment (Second Edition). Subic, A. , Woodhead Publishing. Sawston, Cambridge. 199-231 (2019).
  53. Kontomaris, S. V., Malamou, A. Hertz model or Oliver & Pharr analysis? Tutorial regarding AFM nanoindentation experiments on biological samples. Materials Research Express. 7 (3), 033001(2020).
  54. Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
  55. Wu, C. -E., Lin, K. -H., Juang, J. -Y. Hertzian load-displacement relation holds for spherical indentation on soft elastic solids undergoing large deformations. Tribology International. 97, 71-76 (2016).
  56. Westbrook, J. H., Conrad, H. The Science of Hardness Testing and its Research Applications. , American Society for Metal. Metals Park, Ohio. (1973).
  57. Pritzker, K. P. H., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: Grading and staging. Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
  58. Stylianou, A., Kontomaris, S. V., Grant, C., Alexandratou, E. Atomic force microscopy on biological materials related to pathological conditions. Scanning. 2019, 8452851(2019).
  59. Sokolov, I. Atomic force microscopy in cancer cell research. Cancer Nanotechnology. 1, 1-17 (2007).
  60. Emad, A., et al. Relative microelastic mapping of living cells by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74 (3), 1564-1578 (1998).
  61. Crick, S. L., Yin, F. C. Assessing micromechanical properties of cells with atomic force microscopy: Importance of the contact point. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 6 (3), 199-210 (2007).
  62. Shoelson, B., Dimitriadis, E. K., Cai, H., Kachar, B., Chadwick, R. S. Evidence and implications of inhomogeneity in tectorial membrane elasticity. Biophysical Journal. 87 (4), 2768-2777 (2004).
  63. Lin, D. C., Dimitriadis, E. K., Horkay, F. Robust strategies for automated AFM force curve analysis--I. Non-adhesive indentation of soft, inhomogeneous materials. Journal of Biomechanical Engineering. 129 (3), 430-440 (2007).
  64. Rudoy, D., Yuen, S. G., Howe, R. D., Wolfe, P. J. Bayesian change-point analysis for atomic force microscopy and soft material indentation. Journal of the Royal Statistical Society: Series C (Applied Statistics). 59 (4), 573-593 (2010).
  65. Benítez, R., Moreno-Flores, S., Bolós, V. J., Toca-Herrera, J. L. A new automatic contact point detection algorithm for AFM force curves. Microscopy Research and Technique. 76 (8), 870-876 (2013).
  66. Timashev, P. S., et al. Cleaning of cantilevers for atomic force microscopy in supercritical carbon dioxide. Russian Journal of Physical Chemistry B. 8 (8), 1081-1086 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyMicro IndentationArticular Cartilage ExplantsOsteoarthritis ProgressionCartilage Mechanical PropertiesFluorescence ImagingYoung s ModulusForce Distance CurvesSample PreparationCantilever Calibration

Related Articles