İnsan Eklem Kıkırdak Eksplantlarında Atomik Kuvvet Mikroskobu Tabanlı Mikro Girintide Pratik Konuların Ele Alınması

Summary

Atomik kuvvet mikroskobu mikro girintileriyle ilgili en yaygın sorunları belirlemek ve ele almak için adım adım bir yaklaşım sunuyoruz. Çeşitli derecelerde osteoartrit kaynaklı dejenerasyon ile karakterize edilen yerli insan eklem kıkırdak eksplantlarında ortaya çıkan sorunları örneklendiriyoruz.

Abstract

Şüphesiz, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) şu anda biyolojik alandaki mikro ve hatta nano ipuçlarını değerlendirmek için en güçlü ve kullanışlı tekniklerden biridir. Bununla birlikte, diğer mikroskobik yaklaşımlarda olduğu gibi, metodolojik zorluklar ortaya çıkabilir. Özellikle, numunenin özellikleri, numune hazırlama, alet tipi ve girinti probu istenmeyen artefaktlara yol açabilir. Bu protokolde, ortaya çıkan bu sorunları sağlıklı ve osteoartritik eklem kıkırdağı eksplantları üzerinde örneklendiriyoruz. Bu amaçla, ilk olarak, tüm doku eksplantlarının büyük 2D mozaik floresan görüntülemesi yoluyla, farklı dejenerasyon aşamalarına göre ex vivo eklem kıkırdak disklerinin nasıl oluşturulacağını, derecelendirileceğini ve görsel olarak nasıl sınıflandırılacağını adım adım gösteriyoruz. Ex vivo modelin en büyük gücü, erken başlangıçtan ilerlemeye kadar osteoartrit ile ilişkili değişikliklerin araştırılmasına izin veren yaşlı, yerli, insan kıkırdağını içermesidir. Ek olarak, doku hazırlamadaki yaygın tuzakların yanı sıra gerçek AFM prosedürü ve sonraki veri analizi de sunulmaktadır. Numune hazırlama ve işleme, gelişmiş dejenerasyonun neden olduğu topografik numune özellikleri ve numune-uç etkileşimi gibi temel ancak önemli adımların veri toplamayı nasıl etkileyebileceğini gösteriyoruz. Ayrıca AFM'deki en yaygın sorunları incelemeye tabi tutuyoruz ve mümkün olduğunda bunların nasıl üstesinden gelineceğini açıklıyoruz. Bu sınırlamaların bilinmesi, doğru veri toplama, yorumlama ve nihayetinde bulguların geniş bir bilimsel bağlama yerleştirilmesi için son derece önemlidir.

Introduction

Elektronik cihazların ve sistemlerin sürekli küçülen boyutu nedeniyle, mikro ve nano tabanlı teknoloji ve ekipmanların hızlı gelişimi ivme kazanmıştır. Böyle bir cihaz, biyolojik yüzeyleri tarayabilen ve hem nano hem de mikrometre ölçeklerinde topografik veya biyomekanik bilgileri alabilen^atomik kuvvet mikroskobudur (AFM) ^1,2. Geniş özellikleri arasında, bu araç, çeşitli biyolojik sistemlerin mekanik özellikleri hakkında bilgi edinmek için bir mikro ve bir nano girinti olarak çalıştırılabilir 3,4,5,6.

Protocol

Almanya'da Tübingen Üniversite Hastanesi'nde total diz artroplastisi yapılan hastalardan toplanan femoral kondiller kullanıldı. Bu çalışmaya sadece dejeneratif ve posttravmatik eklem patolojileri olan hastalardan alınan eklem kıkırdak örnekleri dahil edildi. Çalışma başlamadan önce bölüm, kurum ve yerel etik kurul onayı alınmıştır (Proje no.674/2016BO2). Katılım öncesi tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı.

NOT: Deney adımlarının kronolojik sırasına göre bir akış şeması Şekil 1'de verilmiştir.

1. Doku işleme ve kıkırdak disklerinin oluşturulması

<....

Results

Kendi kendine yapılan bir kesme cihazı kullanarak, tek bir hücresel uzamsal desen içeren taze insan kondillerinden küçük (4 mm x 1 mm) kıkırdak diskleri çıkarabildik ve üretebildik³⁰ tek sicim (SS, Şekil 2A), çift sicimler (DS), küçük kümeler (SC), büyük kümeler (BC; Şekil 2A) ve dağınık (Şekil 2B). Temsili bir kıkırdak eksplantı Şekil 3A'da gösterilmiştir. Yalnızca bir tür desen.......

Discussion

İlerleyici ve multifaktöriyel bir hastalık olan OA, eklem kıkırdağında yapısal ve fonksiyonel değişiklikleri tetikler. OA seyri boyunca, mekanik özelliklerdeki bozulmalara eklem kıkırdağı yüzeyindeki yapısal ve biyokimyasal değişiklikler eşlik eder^27,31. OA'da meydana gelen en erken patolojik olaylar, kollajen ağının bozulması ile birlikte proteoglikan tükenmesidir^32,33,34

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfoterisin B	Merck KGaA, Darmstadt, Almanya	1397-89-3
Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) kafası	CellHesion 200, Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	JPK00518
Biyouyumlu numune yapıştırıcısı	Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	H000033
Calcein	Cayman, Ann Arbor, Michigan, ABD	14948	Hücre zarı geçirgen boya, kıkırdak disk sıralama için kullanılır - üstten görünüm görüntüleme
	Konsol Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	SAA-SPH-5UM	Frekans Nom: 30KHz, k: 0.2N / m, uzunluk nom: 115μ m, genişlik nom: 40μ m,  geometri: dikdörtgen, 5&mu ile silindirik uç; m uç yarıçapı
Kıkırdak ctting cihazı	Kendi kendine yapılan	n/a	4mmx1mm CDD kameranın önceden tanımlanmış bütünlerini içeren plastik kesme cihazı
	The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Almanya Floresan	DFK 31BF03
CDD kamera	Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya	DFC3000G
Cryotome	Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya	CM3050S
Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	Veri İşleme Yazılımı	n/a	Sürüm 5.0.86,  aşağıdaki web sitesinden ücretsiz olarak indirilebilir https://customers.jpk.com
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Almanya	41966052
Floresan Mikroskobu (Leica DMi8)	Leica Biosystems, Wetzlar, Almanya	11889113
Cam blok cantiliver tutucu	Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	SP-90-05	JPK PetriDishHeaterTM (Bruker) ile kullanım için özel olarak tasarlanmış, açılı yüzeylere sahip ekstra uzun cam blok.
Ters faz kontrast mikroskobu (AFM'ye entegre)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Mikroskopi, Jena, Almanya	L201306_03
Leibovitz'in L-glutamin içermeyen L-15 ortamı	Merck KGaA, Darmstadt, Almanya	F1315
Mikroskop cam slaytları	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD	CLS294775X50
DAPI	ibidi GmbH, Grä ile montaj ortamı; felfing, Almanya	50011	Kıkırdak diskleri için kullanılan nükleer DAPI (4 ve asal;, 6-diamidino-2-fenilindol) karşı boyama ile montaj ortamı ve yan görünüm görüntüleme
Penisilin-Streptomisin	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, ABD	P4333
AFM (Petri Bulaşık Isıtıcısı) ile ilişkili Petri bulaşık ısıtıcısı	Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	T-05-0117
Neşter	Feather Medical Products, Osaka, Japonya	2023-01
Silikon Etek	Bruker Nano GmbH, Berlin, Almanya	n/a	AFM kafasında orta yoğuşmayı önlemek ve nbsp; önlemek için cam bloğun tabanının temeline yerleştirilen koruyucu silikon membran (D55x0.25).
İstatistik programı - SPSS	IBM, Armonk, New York, ABD	SPSS Statistics 22	Vesion 280.0.0.0 (190)
Doku kültürü yemekleri	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, İsviçre	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Bileşik	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Hollanda	SA6255012	Suda çözünür gömme ortamı