Yöntem makalesi

İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi

5.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64394

⸱

9 Ağustos 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AnaBios Corporation

Bu makalede

Özet

Bu protokol, klinik öncesi gelişim sırasında ilaca bağlı kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için güvenilir bir platform olan MyoBLAZER sistemi ile donör kalplerinden alınan yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktilitenin nasıl ölçüleceğini açıklar.

Özet

Kalp kontraktilitesindeki değişikliklerin değerlendirilmesi, yeni kardiyak ve kardiyak hedefli olmayan bileşikler için klinik öncesi geliştirme sırasında esastır. Bu makale, hücrelerin normal fizyolojisini ve farmakolojisini koruyan non-invaziv bir optik yöntem olan MyoBLAZER'ı kullanan yetişkin insan primer ventriküler kardiyomiyositlerinde kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu optik kayıt yöntemi, birden fazla hücreden gelen kontraktilite geçişlerini paralel olarak sürekli olarak ölçerek, görüş alanındaki her bir hücre için hem orta verim hem de değerli bilgiler sağlayarak ilaç etkilerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Kardiyomiyosit kasılmaları, tempolu elektriksel alan stimülasyonu ile indüklenir ve elde edilen parlak alan görüntüleri, çoklu kardiyomiyositler arasında sarkomer kısalmasını ölçen bir görüntü işleme yazılımına beslenir. Bu yöntem, kasılma ve gevşeme aşamalarının kinetiği ile ilgili farklı uç noktaları hızla üretir ve elde edilen veriler daha sonra bir test ürününün farklı konsantrasyonlarına göre yorumlanabilir. Bu yöntem aynı zamanda klinik öncesi gelişimin geç aşamalarında, devam eden klinik çalışmaları desteklemek için takip mekanik çalışmaları gerçekleştirmek için kullanılır. Bu nedenle, sürekli kontraktilite izleme için optik sistemle birleştirilmiş yetişkin insan primer kardiyomiyosit tabanlı model, klinik öncesi tıbbi tedavi geliştirmede yeni bir in vitro kardiyak veri çevrilebilirliği çağına katkıda bulunma potansiyeline sahiptir.

Giriş

Kalp kasının doğal kasılma kapasitesini temsil eden miyokardiyal kontraktilite (inotropi), kardiyak fonksiyonun önemli bir özelliğidir ve elektro-mekanik eşleşmenin dinamiklerine bağlıdır. Miyokardiyal kontraktilitede ilaca bağlı değişiklikler kalp hastalığını tedavi etmek için arzu edilir (ör., kalp yetmezliği) ve kardiyotoksisite bağlamında aranmaz (ör., sol ventrikül ejeksiyon fraksiyonunda azalma). Bu nedenle, yeni ilaçların klinik geliştirme sırasında başarılı olabilmesini sağlamak için klinik öncesi kontraktilite modelleri doğru öngörücülük ile ilişkilendirilmelidir. Bununla birlikte, indirgemeci yapay hücresel modellere (örneğin, ilgilenilen belirli kardiyak hedefleri aşırı eksprese eden genetiği değiştirilmiş ölümsüzleştirilmiş hücre hatları) ve insan olmayan hayvan modellerine dayanan mevcut klinik öncesi stratejiler, önemli sınırlamalar göstermiştir ve yüksek ilaç yıpranma oranları (yani, yüksek oranda yanlış sinyal) ile ilişkili bulunmuştur1,2,3,4. Buna göre, insanlarda ilaç sonuçlarını tahmin etmek ve dolayısıyla yeni tedavilerin başlatılmasını hızlandırmaya yardımcı olmak için yüksek güçle (yani yüksek oranda gerçek sinyallerle) ilişkili yeni ve güvenilir insan hücresel kalp kasılma modellerinin oluşturulması zorunludur5.

Araştırma 6,7,8,9,10 ve kardiyomiyosit izolasyon teknikleri 11,12,13,14,15 için insan donör kalplerinin geri kazanılması için yakın zamanda oluşturulan çığır açan yöntemler, klinik öncesi gelişim sırasında insan temelli çalışmalar yürütmek için eşsiz bir fırsat sağlamıştır. Bu amaçla, yetişkin insan primer kardiyomiyositleri, insan kalbi kasılmasında ilaca bağlı değişikliklerin değerlendirilmesinde fayda göstermiştir11,12,13,14. Bu makale, yetişkin insan kardiyomiyositlerinde yeni bileşiklerin kontraktilite etkilerini araştırmak için protokolü detaylandırmaktadır.

Protokol

Tüm yöntemler ilgili yönergelere ve düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışmalar için kullanılan tüm insan kalpleri nakledilemezdi ve Amerika Birleşik Devletleri'ndeki (ABD) kadavra organ bağışçılarından bilgilendirilmiş yasal onay (birinci kişi veya yakın akraba) ile etik olarak elde edildi. Kurtarma protokolleri ve in vitro deneyler, ABD Organ Tedarik Nakli Ağı (OPTN) içindeki nakil merkezlerindeki Kurumsal İnceleme Kurulları (IRB'ler) tarafından önceden onaylanmıştır. Ayrıca, donör kalplerinin tüm transferleri tamamen izlenebilir ve ABD federal yetkilileri tarafından periyodik olarak gözden geçirilir.

NOT: Bu protokolün yürütülmesi sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman (örn. laboratuvar önlükleri, koruyucu gözlükler, eldivenler) giymek de dahil olmak üzere gerekli tüm güvenlik prosedürlerini uygulayın.

1. Kardiyomiyositlerin izolasyonu (kontraktilite ölçümünden 1 gün önce)

  1. Donör kalplerini laboratuvara varır varmaz buz gibi tescilli kardiyoplejik solüsyon6 ile yeniden perfüze edin ve enzimatik olarak yetişkin insan primer miyositlerini ventriküllerdenizole edin 11,12,13,14,15.
  2. Daha sonra kardiyomiyositleri süspansiyon halinde tutun ve 10 mL çözelti A (110 mM sükroz, 0.005 mM CaCl 2, 3 mM MgCl 2, 70 mM KOH, 60 mM laktobiyonik asit, 10 mM KH 2 PO4, 20 mM taurin, 20 mM L-histidin, 20 mM HEPES, 2 mM L-glutamik asit, 2 mM L- (-) - malik asit, KOH ile pH 7.4) 20 mL Wheaton şişelerinde (Malzeme Tablosu) deneysel olarak sorgulanana kadar soğutulmuş bir sıcaklıkta.
    NOT: Flakon başına 200.000 hücre saklayın.

2. Laminin kaplama hazırlığı (kontraktiliteyi ölçmeden 1 gün önce)

  1. Sekiz oyuklu bir kültür plakasının (Malzeme Tablosu) her bir oyuğuna tek bir cam lamel (25 mm x 25 mm kare, Malzeme Tablosu) yerleştirin.
  2. Ardından, lamelleri 5 μg/mL konsantrasyonda laminin ile kaplayın. Bunu yapmak için, 800 μL insan rekombinant Laminin 521 stoğu (Malzeme Tablosu, −20 °C'de saklanır) ila 7.2 mL B çözeltisine (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 2.5 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glikoz ve 10 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4) ekleyin ve iyice karıştırın.
  3. 200 μL seyreltilmiş laminin çözeltisini her bir lamel ortasına bırakın. Ardından tabağı kapatın ve 4 °C'lik bir buzdolabında istifleyin.
    NOT: Yeterli laminin kaplı lamel olduğundan emin olmak için birden fazla sekiz oyuklu kültür plakası hazırlayın.

3.Ca2+-toleranslı kardiyomiyositlerin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün)

  1. Buzdolabından bir şişe hücre çıkarın, şişeden çözelti A'yı aspire edin ve soğutulmuş 10 mL B çözeltisi ekleyin.
    NOT: Hücrelerin emilmediğinden emin olun ve pipeti flakon duvarının üst kısmının içine yerleştirerek B solüsyonunu flakon içine dağıtın.
  2. Hücre şişesini kapatın ve ardından hücrelerin B çözeltisi boyunca dağıldığından emin olmak için hafifçe döndürün. Son olarak, hücrelerin oda sıcaklığında (RT) 1 saat oturmasına izin verin.

4. Kayıt sisteminin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün)

NOT: Kayıt sistemi, bir sıcaklık kontrol kutusu, stimülatör, bilgisayar kontrollü basınçla çalışan perfüzyon, basınçla çalışan perfüzyon şişeleri, ilgilenilen bölgelerin (ROI'ler) seçilmesine ve kasılma geçişlerinin görüntülenmesine izin veren kurum içi edinim yazılımı, ters mikroskop, hücre odası ve kamera içerir (Şekil 1).

  1. Emme vakum sistemini açın. Ardından, mikroskop kapağını çıkarın, açın, kamerayı bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve son olarak kameranın aşırı ısınmamasını sağlamak için fanın açık olduğunu onaylayın.
  2. Ardından, mikroskop ısıtma plakasını (Malzeme Tablosu) ve sıcaklık kontrol kutusunu (Malzeme Tablosu, Şekil 1) açın ve uygun çalışma sıcaklığına ayarlayın. Ardından, saha stimülatörünü (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve basınç sistemini açın. Son olarak, çözeltinin borusunu (Malzeme Tablosu) kayıt odasına bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1).

5. Test bileşiklerinin hazırlanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün)

  1. Seyreltik dimetil sülfoksit (DMSO; Malzeme Tablosu) C çözeltisinde 1.000 kat (145 mM NaCl, 4 mM KCl, 1.8 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, 11.1 mM glikoz ve 10 mM HEPES, NaOH ile pH 7.4) % 0.1 DMSO araç çözeltisi yapmak için.
  2. Bir bileşiği 0.001 μM'lik terapötik maruziyetinin 1 katı, 100 katı, 100 katı ve 1000 katında test etmek için, test bileşiğini DMSO'da 1 mM'lik bir konsantrasyonda çözün.
  3. Üç DMSO stoğu daha üretmek için bu çözeltiyi DMSO ile seri olarak seyreltin (örn., 0.001 mM, 0.01 mM ve 0.1 mM). Son olarak, nihai test konsantrasyonlarını (0.001 μM, 0.01 μM, 0.1 μM ve 1 μM) elde etmek için her bir test bileşiği stoğunu 100 mL C çözeltisi içinde 1.000 kat seyreltin.
  4. Araç çözeltisini ve bileşiğin nihai mikromolar konsantrasyonlarının çözeltilerini 100 mL cam şişelere ekleyin (Malzeme Tablosu, Şekil 1) ve ardından şişeleri basınçla çalışan perfüzyon sistemine bağlayın (Malzeme Tablosu, Şekil 1).
  5. Ardından, 1,8 mL/dk hızında sabit bir perfüzyon akışı sağlamak için 200-300 mbar'lık bir basınç kullanarak perfüzyon sistemini bilgisayar güdümlü bir programla (Malzeme Tablosu) hazırlayın.
    NOT: Test bileşiğinin bir çözünürlük sorunuyla ilişkili olduğu tespit edilirse deneyi yapmayın. Ayrıca, hücrelere deneysel uygulamadan önce 30 dakika içinde stok çözeltilerden bileşik test çözeltilerini formüle edin.

6. Kardiyomiyositlerin kaplanması (kontraktilitenin ölçüldüğü gün)

  1. 4 ° C'lik buzdolabından laminin kaplı lameller içeren sekiz oyuklu bir plaka alın ve bir lamel çok iyi temizlenmiş bir kayıt odasına dikkatlice yerleştirin (Şekil 1). Ardından, sekiz oyuklu plakayı bir sonraki kaplamaya kadar 4 °C buzdolabına geri koyun.
    NOT: Lameli ince bir laminin tabakasıyla kaplanmış halde tutarken, kaplanmış lameli silmek için tüy bırakmayan bir mendil (Malzeme Tablosu) kullanın. Ayrıca, kullanılmış lamelleri keskin bir kaba attığınızdan emin olun.
  2. Daha sonra, yükseltilmiş bir hücre şişesi alın (adım 3.2) ve hücreleri kaybetmeden (~ 200 μL) mümkün olduğunca küçük bir hacme ulaşmak için şişeden çözelti B'yi aspire edin. Daha sonra, 200 μL'lik hücreleri, ters çevrilmiş bir mikroskop tablasına monte edilmiş kayıt mikroskobu odasına dağıtın (Malzeme Tablosu).
  3. Hücrelerin 5 dakika boyunca lamel üzerine yerleşmesine izin verin. Hücrelerin tam olarak yerleşmesini beklerken, mikroskopta görüş alanını açın ve hücre yoğunluğunun deney çalışmasının başlaması için yeterli olup olmadığını (~% 70) belirleyin.
    NOT: 200 μL'den fazla dağıtılırsa, emişin tüm hücreleri aspire etmediğinden emin olun.

7. Kardiyomiyosit kontraktilitesinin kaydedilmesi

  1. Kaplama tamamlandıktan sonra, basınçla çalışan perfüzyon sistemini kullanarak hücreleri C çözeltisi ile sürekli perfüze ederek 5 dakika boyunca dengeleyin (Malzeme Tablosu). Emişi doğru şekilde ayarlayın, hem sıcaklık kontrol kutusunu hem de ısıtma plakasını açın ve ~35 °C verecek şekilde ayarlayın.
  2. Daha sonra, bir alan stimülatörüne bağlı odanın zıt taraflarına yerleştirilmiş bir çift platin tel ile bir alan stimülatörü üzerinde 1 Hz pacing frekansında (3 ms süreli bipolar darbe) eşik üstü voltajla hücreleri uyarın.
  3. Uyarıcı nabzın genliğini 1 V'a ayarlayın ve ardından kardiyomiyositler kasılma-gevşeme döngüleri oluşturmaya başlayana kadar artırın. Deneme boyunca 1,5x eşik değeri kullanın.
    NOT: Çubuk şeklinde morfolojiye ve net çizgilere sahip sağlıklı hücreleri seçin. Ardından, görüş alanını ayarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda daralan hücreyi görünüme getirmeye odaklanın (Şekil 2A).
  4. Ardından, optik kasılma kayıt sisteminin toplama yazılımı içindeki hücrelerin sayısallaştırılmış görüntülerini görüntüleyin. Bu yazılım, aynı karede birden fazla miyosit içeren bir video akışını kaydetmek için 150 FPS hızında yüksek çözünürlüklü, yüksek kare hızlı bir kamera kullanır (Malzeme Tablosu, Şekil 1).
    NOT: Bu, birkaç sağlıklı miyositin sarkomer dinamiklerini aynı anda yakalamak ve ölçmek için yeterli zamansal ve uzamsal çözünürlük sağlar. Video akışından sarkomer uzunluğundaki değişikliklerin gerçek zamanlı olarak paralel olarak hesaplanmasını sağlamak için modern yüksek çekirdek sayılı işlemcilerden yararlanılır (optik yoğunluk verileri, sağlıklı kardiyomiyositlerin görüntüleri üzerine yerleştirilen ve kasılma eksenine paralel olarak yerleştirilen kullanıcı tanımlı ilgi alanlarından [ROI] toplanır, Şekil 2B). Optik yoğunluk verileri, kardiyomiyositlerin Z çizgilerine karşılık gelen parlak ve koyu bantları gösterir (Şekil 1, Şekil 2C). Son olarak, bu veriler izleme amacıyla kullanıcıya gösterilir ve daha sonra analiz edilmek üzere bir diske kaydedilir (Şekil 2C).
    1. Hücrelerin odakta olmayan alanlarından kaçının. Ayrıca, ilaçların uygulanması sırasında hücrelerin kasılmasında meydana gelen değişiklikler, ROI'lerin hücrelerin kasılmasını okuyamamasına neden olabileceğinden, ROI'leri hücrelerin kenarına yakın konumlandırmayın.
  5. ROI'lerin seçimi tamamlandığında ve kasılmalar kullanım için gerekli standartları karşıladığında (örneğin, sarkomer kısalması %>1; 1 Hz pacing frekansının uygulanmasıyla ritmik kasılma, aritmik olayların olmaması), bir bileşiğin etkilerini değerlendirmek için deneyi başlatın. Stimülasyon protokolü ve bileşiğin test konsantrasyonlarını uygulama sırası Tablo 1'de gösterilmektedir. Toplama yazılımı, verilerin alınmasını ve görüntülenmesini ve test konsantrasyonlarının ve işlem süresinin etiketlenmesini otomatik bir şekilde yönetecektir.
    NOT: Kasılma, temel araç periyodunun tamamı boyunca sabit bir genlikte kalırsa test konsantrasyonları uygulayın. Yukarı veya aşağı bir çalışma gösteren hücreleri diskalifiye edin.
    6. Ayrıca, deney boyunca perfüzyonun farklı test konsantrasyonlarına geçtiğinden emin olun.
  6. Deney ve sunucuda veri depolama tamamlandıktan sonra, perfüzyonu ve ısıtıcıyı kapatın, stimülasyonu durdurun, mikroskop odasını damıtılmış suyla temizleyin, ardından cam lamel çıkarın ve odayı iyice kurulayın.
    NOT: Bir sonraki hücre setinin herhangi bir bileşiğe zamanından önce maruz kalmasını önlemek ve böylece toplanan verileri geçersiz kılmak için çok önemli olduğundan hazneyi iyice temizleyin.
  7. Daha sonra, yeni bir kardiyomiyosit kaplaması yapın ve bileşiğin testini tamamlamak veya yeni bir bileşiğin test edilmesi için yeterli veri elde etmek için ek bir deney yapın.

8. Optik kontraktilite kayıt sisteminin kapatılması

  1. Bileşik(ler)in günlük testi tamamlandığında, önce sistemi temizlemek için gerekli olmayan tüm ekipmanı kapatın ve verileri çevrimdışı analiz için kopyalayın.
  2. Ardından, son test konsantrasyonlarının çözeltilerini içeren 100 mL'lik cam şişeleri (Malzeme Tablosu) çıkarın ve bunları yarıya kadar RBS 25 Konsantre çözeltisi (Malzeme Tablosu) ile doldurulmuş cam şişelerle değiştirin. RBS solüsyonunu mikroskop odasından 5 dakika geçirin, ardından perfüzyon tüpünü hazneden ayırın, damıtılmış suyla temizleyin ve son olarak iyice kurulayın.
    NOT: Olası taşmaları önlemek için vakumun iyi çalıştığından emin olun.
  3. Ardından, perfüzyon tüpünü drenaj borusuna bağlayın. Basınçla çalışan perfüzyon sisteminin yazılımını (Malzeme Tablosu) kullanarak, basınç ve akış hızının yeterince ayarlandığından emin olarak RBS çözeltisini 10 dakika çalıştırın. Daha sonra, perfüzyon sisteminin temizliğini tamamlamak için 5 dakika boyunca% 1 DMSO perfüze edin ve ardından 15-20 dakika damıtılmış su.
  4. Mikroskop ışığını kapatın ve kapağını kapatın. Ardından, kamera kablolarını mikroskobun yan tarafındaki kutudan çıkarın ve fanı kapatın. Kullanılmış tüm şişelerin temizlik ve otoklav için gönderildiğinden emin olun. Son olarak, tüm drenaj kovalarının 1/4 veya daha az dolu olduğundan emin olun.
    NOT: Ertesi gün kullanmak üzere yeterli laminin kaplı lamel olduğundan emin olun.
  5. Son olarak, her kayıt sisteminde yapılan tüm deneylerin edinme klasöründeki dosyaları kopyalayın ve ek çevrimdışı analiz için bunları güvenli bir yedekleme sunucusuna yapıştırın. Ardından, tüm veri dosyalarını alma klasöründen silin.

9. Kasılma verilerinin analizi

  1. Verilerin ortalamasını almak için analiz yazılımını ve özel yapım bir makroyu kullanarak çevrimdışı analiz gerçekleştirin. Analiz yazılımı, edinim yazılımı tarafından üretilen sarkomer dinamiği verilerinden çeşitli metrikleri hesaplar ve raporlar. Bu parametrelerin ayrıntılı bir listesi Şekil 2D'de verilmiştir.
    NOT: Düşük seviyeli yazılım tekniklerinin uygulanması, birçok kayıt çalışmasının 5 saniyede analiz edilmesini sağlar. İlacın neden olduğu kontraktilitedeki değişiklikleri değerlendirmek için temel parametre kontraktilite genliğidir (sarkomer kısalması% = sarkomer uzunluğundaki değişim). Pik kasılma/dinlenme sarkomer uzunluğundaki sarkomer uzunluğu olarak hesaplanır ve her test konsantrasyonu için son 20 kasılma geçişinin ortalaması alınır.
  2. Her bir kardiyomiyositin spesifik temel araç kontrol koşuluna göre ortalama kasılma genliği üzerindeki test bileşiğinin etkilerini ölçün.
  3. Ortalama sonuçları ortalama ± SEM olarak ifade edin ve test bileşiğinin kasılma genliği üzerindeki konsantrasyon etkisini gösteren bir grafik oluşturun. Daha sonra, IC50 (kasılma genliğinde %50 inhibisyon üreten konsantrasyon) ve EC50 (kasılma genliğinde %50 artış üreten konsantrasyon) değerlerini türetmek için analiz yazılımı (Malzeme Tablosu) kullanarak konsantrasyon-tepki eğrisini Hill denklemine uydurun.
  4. Kasılma genliğine ek olarak, diğer parametreleri de hesaplayabilirsiniz:
    1. Kasılma sonrası: Kasılma sonrası, bir sonraki düzenli kasılmadan önce meydana gelen ve anormal ve senkronize olmayan bir kasılma üreten kardiyomiyositin spontan sekonder kasılma geçici olarak tanımlayın.
    2. Kasılma başarısızlığı: Kasılma başarısızlığını, elektriksel uyaranın bir kasılmayı indükleyememesi olarak tanımlayın.
    3. Kısa süreli değişkenlik (STV) ve alternans: Bu iki parametreyi kasılma genliği değişkenliğinin Poincaré grafiklerinde görselleştirin.
      1. STV'yi hesaplayın (∑|CAn + 1 − CAn| (20 × √2) −1) her kontrol ve test ürünü konsantrasyon periyodunun son 20 geçici olayı ile. Alternansları tekrarlayan dönüşümlü kısa ve uzun kasılma genliği geçici akımları olarak tanımlayın.
      2. Pro-aritmi insidansını hesaplamak için, STV değerlerini her hücrenin araç kontrol değerine normalleştirin, kasılma sonrası, kasılma başarısızlığı, STV ve alternansları çizin ve bunları her bir sinyali sergileyen hücrelerin insidansının %'si olarak ifade edin.
    4. Ato pik zamanı, %30 gevşeme (Decay 30), %90 gevşeme (Decay 90), %90 gevşeme süresi (TR90) (Şekil 2D), başlangıç sarkomer uzunluğu, %50 pik zamanı, pik yüksekliği, pik kasılmada sarkomer uzunluğu, maksimum kasılma hızı ve maksimum gevşeme hızı12 hesaplaması ile multiparametrik mekanik profillemeyi tamamlayın. Kasılma genliği gibi, bu parametreleri her bir kardiyomiyositin spesifik temel kontrol koşuluna göre ifade edin ve bunları konsantrasyon-yanıt grafiklerinde grafiklendirin.

Sonuçlar

Bu protokolde tarif edilen, organ donörlerinden izole edilmiş yetişkin insan primer kardiyomiyositlerinde kontraktiliteyi ölçmek ve bir test bileşiği tarafından indüklenen kontraktilite parametrelerindeki akut değişiklikleri değerlendirmek için bir prosedürdür. Geçici kasılma ölçümünün ölçümü, sarkomer dinamiklerini ölçen video tabanlı bir hücre geometri sistemi olan MyoBLAZER kullanılarak gerçekleştirilir ve fizyolojik pacing frekansında (1 Hz) elektriksel stimülasyon ile kasılma indüklenerek yetişkin kalp durumu taklit edilir. Kardiyomiyositlerin fonksiyonel canlılığı, uyarma-kasılma eşleşmelerinin değerlendirilmesiyle doğrulanır (yani, elektriksel uyarımı [sarkolemmal aksiyon potansiyeli] kasılma ile ilişkilendiren hücresel işleme). İnsan kardiyomiyositlerinde spontan kasılma geçişleri yoktur ve kardiyomiyositler, kasılma / gevşeme döngüleri ile dış elektriksel stimülasyona yanıt verir (Şekil 2C, E) ve ayrıca bir β-adrenerjik agonist olan izoproterenol'e (Şekil 2F, G). İzoproterenol, kontraktilitede konsantrasyona bağlı bir artışa neden olur (Şekil 2G) ve geçici kontraktilite kinetiği üzerindeki etkileri de karakterize edilebilir (Şekil 2D)12.

figure-results-1
Şekil 1: Optik kontraktilite kayıt sisteminin deneysel kurulumu. Parlak alan kasılma kayıtları, daha önce tarif edildiği gibi yetişkin insan primer kardiyomiyositlerindenyapılır 11,12,13,14. Kurulum, bir (A) sıcaklık kontrol kutusu, (B) alan stimülatörü, (C,D) basınçla çalışan perfüzyon sistemi, (E) bilgisayar basıncıyla çalışan program, (F) basınç artı şişeler, (G) toplama yazılımı, (H) satın alma yazılımı ile ROI seçimi, (I) edinme yazılımı ile kasılma geçişlerinin görüntülenmesi, (J) ters mikroskop, (K) mikroskop odası ve ( L) kamera. Ekipmanın tüm özellikleri Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İnsan kardiyomiyosit kontraktilitesi ölçümünün doğrulanması ve β-adrenerjik stimülasyonun etkisi. (A) Temsili bir yetişkin insan primer kardiyomiyositinin faz kontrast mikroskobu görüntüsü, (B) sağlıklı kardiyomiyositlerin görüntüleri üzerine yerleştirilen ve kasılma eksenine paralel olarak yerleştirilen kullanıcı tanımlı ilgi bölgeleri (ROI), (C) (B) aynı ROI'lerden elde edilen kasılma geçişlerinin gösterimi) edinim yazılımı ile, (D) edinim yazılımı ile ölçülen kasılma geçici ile ilgili parametreler: kasılma genliği, zirveye kadar geçen süre, Decay 30, Decay 90, TR90. Ek parametreler de ölçülebilir: başlangıç sarkomer uzunluğu, P tepe noktasına kadar geçen süre, tepe yüksekliği, tepe kasılma süresi, maksimum kasılma hızı ve maksimum gevşeme hızı. (E) Araç kontrolü (F) varlığında ve seçici olmayan bir β-adrenerjik agonist olan 30 nM izoproterenole maruz kaldıktan sonra 1 Hz'lik bir pacing frekansında yetişkin bir insan primer ventriküler miyositinden kaydedilen tipik kasılma geçişleri. E ve F panellerinde gösterilen kontraktilite geçişleri aynı kardiyomiyositten toplandı. Potens bilgisini oluşturmak için 1 Hz pacing frekansında paced insan kardiyomiyositlerinden izoproterenol kullanıldı. (G) İzoproterenol (n = 8 hücre) ile insan kardiyomiyosit kontraktilitesi ölçümü ile oluşturulan tipik kümülatif konsantrasyon-yanıt eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Perfüzyon DizisiAraç çözümüKonsantrasyon 1 (μM)Konsantrasyon 2 (μM)Konsantrasyon 3 (μM)Konsantrasyon 4 (μM)Yıkamak
Tedavi Süresi120 Saniye300 Saniye300 Saniye300 Saniye300 Saniye300 Saniye
Stimülasyon Frekansı1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz1 Hz

Tablo 1: Stimülasyon protokolü ve test bileşiği uygulama sırası. Kasılma geçişlerinin stabilitesi, araç kontrolünü oluşturan (tipik olarak %0,1 DMSO'da) C çözeltisinde 120 saniye boyunca sürekli kayıt ile değerlendirilir. Daha sonra, test maddesi konsantrasyonu minimum 300 s boyunca veya kararlı durum etkisi elde edilene kadar uygulanır. Kümülatif konsantrasyon-etki (CE) eğrileri sağlayan dört artan test makalesi konsantrasyonu kullanılır. Test makalesinin kümülatif eklemelerinin sonunda, 300 sn'lik bir yıkama süresi uygulanabilir.

Tartışma

Bu makale, yeni bileşiklerin akut etkinliğinin ve kardiyotoksisitesinin test edilmesini sağlayan basitleştirilmiş bir orta verimli yöntem için yetişkin insan kardiyomiyosit kontraktilitesine dayalı optik sistem için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu optik kontraktilite kayıt sisteminin kullanımı kolaydır, birden fazla hücreden paralel olarak kayıtlara izin verir, hücre sağlığı, fizyolojisi ve farmakolojisinin aynı anda değerlendirilmesini sağlar, otomatik ve hızlı veri analizi ile birlikte gelir (birden fazla hücrenin çalışması 5 saniyede analiz edilir) ve hızlı veri toplamaya izin verir (her 30 dakikada bir konsantrasyon-yanıt eğrisi / bileşik / cihaz). Bu özellikler göz önüne alındığında, kayıt sistemi sadece ilaçların kardiyomiyosit kontraktilitesi üzerindeki etkilerini tespit etmek için değil, aynı zamanda ilaç keşfinin erken aşamalarında tıbbi kimya çabalarını desteklemek için yapı-aktivite ilişkisi verileri sağlamak için de kullanılabilir16. Bir kardiyomiyosit izolasyon protokolünden on milyonlarca hücre elde edilebildiğinden, optik kasılma kayıt sistemi-kardiyomiyosit platformunun uygulanması, daha düşük maliyetle artan test kapasitesi (iyi tabanlı plakaların kullanılmasıyla) elde etmek için şu anda araştırılmaktadır. Ayrıca, kayıt sistemi ile ölçülen sistolik ve relaksasyon parametreleri üzerindeki ilaç etkilerinin değerlendirilmesi, inotropik ilaçların multiparametrik mekanik profillemesini sağlayabilir12. Ek olarak, kardiyomiyosit kasılma verileri, yeni ilaçları en çok kardiyotoksikten en az kardiyotoksikten (örneğin, güvenlik marjı) ve en az etkiliden en etkiliye (örneğin, potens marjı) sıralamak için kullanılabilir. Miyokard kontraktilitesinde klinik bir azalma ile ilişkili olan geliştirme programlarını desteklemek için takip kardiyomiyosit kontraktilite çalışmaları da yapılabilir12.

İnsan kardiyomiyosit kontraktilitesi optik kayıt sistemini kullanmanın bir diğer önemli avantajı, ilaç endüstrisinde veri üretimi için hayvanların kullanımını önleyen veya onun yerini alan alternatif bir yöntem olarak düşünülebileceğinden, 3R konsepti (değiştirme, azaltma ve iyileştirme)17 ile uyumlu olmasıdır. Bu 3R avantajı, akademik kardiyak araştırmalara da genişletilebilir. Kardiyomiyosit fizyolojisi ve farmakolojisi ile ilgili mevcut bilgilerin tamamı, hayvan kalplerinden izole edilen hücrelerle yapılan akademik araştırma çalışmalarından gelmektedir18. Böylece, insan kardiyomiyosit optik kontraktilitesi modeli, kritik translasyonel çalışmaların gerçekleştirilmesi olasılığını açar. Bu çalışmaları gerçekleştirmek için, insan yetişkin kardiyomiyositlerinin korunması ve gönderilmesi için protokoller geliştirilmelidir (şu anda AnaBios'un laboratuvarında değerlendirilmektedir) ve kasılma sistemi, insan olmayan kardiyomiyositlerden sarkomer uzunluğundaki değişiklikleri kaydetme yeteneğine sahip olmalıdır (bu, sarkomerler türler arasında iyi korunduğu için optik kasılma kayıt sisteminde geçerlidir).

İnsan kardiyomiyosit kontraktilite sistemi, çeşitli fizyolojik koşulları (örneğin, elektromekanik kuplaj, kalp atış hızını taklit eden pacing frekansı, vücut ısısı, tüm insan kalp hedeflerinin entegrasyonu) taklit edebilir ve ilaç keşfinde önemli bir bileşen olarak translasyonel değer göstermiştir11,12,13,14, kardiyak kasılma döngüsü sırasında görülen mekanik yük ve kayma stresindeki değişiklikleri taklit edemese de. Kardiyak hücre dışı matrislerin yapısı ve işlevi artık daha iyi anlaşılmıştır19, bu tür matrislerin geliştirilmesi potansiyel olarak mekanik yük sınırlamasının üstesinden gelmeye yardımcı olabilir ve farklı kalp benzeri sertliklere sahip matrisler şu anda AnaBios'un laboratuvarında değerlendirilmektedir. İnsan kardiyomiyosit optik kasılma sisteminin bir başka sınırlaması, kalbi besleyen sinir ağının olmamasıdır (örneğin, sempatik ve parasempatik lifler)20. Bu nöro-kardiyak temas, nörotransmiterlerin (örneğin, β-adrenoseptör reseptörlerinin bir agonisti olan izoproterenol; M2 muskarinik reseptörlerinin bir agonisti olan asetilkolin) birlikte uygulanmasıyla yeniden kurulabilir ve bileşik, kardiyomiyosit kontraktilitesi üzerindeki potansiyel etkileri açısından değerlendirilir. Ayrıca, kontraktilite geçişleri, elektrokardiyogram ve Ca 2+ kullanımı üzerindeki ilaç etkilerini değerlendirirken de gerekli olan aksiyon potansiyelleri ve Ca2+ geçici akımlarının eşzamanlı ölçümleri olmadan kaydedilir. Bu ihmal sistemin bir sınırlaması olarak düşünülebilse de, aksiyon potansiyeli sinyallerinin (akım-kelepçe yöntemi veya voltaja duyarlı boyalarla) ve Ca 2+ geçici akımlarının (Ca2+ göstergeleri/boyaları ile) kayıtları sitotoksisite ile ilişkilendirilebileceğinden olması çok kritik değildir. Bu tür sitotoksik etkiler, kalp kasılmasını modüle etmek için yeni ilaçların değerlendirilmesini etkileyebilir. Aksine, bu protokolde açıklanan kayıt sistemi gibi kardiyomiyositlerin sağlığını, fizyolojisini ve farmakolojisini koruyan non-invaziv bir optik yöntemin kullanılması, yalnızca en yüksek kalitede kontraktilite verilerinin elde edilmesini sağlamakla kalmayacak, aynı zamanda yeni ilaçların insanlardaki kontraktil etkilerini iyi tahmin edebilecek veriler sağlayacaktır.

Açıklamalar

Tüm yazarlar AnaBios Corporation'ın çalışanlarıdır ve hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma AnaBios Corporation ve NIH Küçük İşletme İnovasyon Araştırması (SBIR) hibesi (1R44TR003162-01) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100– 1000 ve mikro; L Filtreli, Geniş Ağızlı, Steril uçlarPipetUF-1000W
100 mL, Duran basınç artı şişelerDWK Yaşam Bilimleri218102406
1 L, 0,22 ve mikro; m Vakum Filtre sistemiVWR567-0020
290 mmol/kg Ozmolarite StandardıWescorOA-029
Masaüstü pH MetreMettler Toledohttps://www.mt.com/us/en/home/products/Laboratory_Analytics_Browse/pH-meter/pH-meters.html
Kalsiyum Klorür dihidrat (CaCl2)Sigma-AldrichC3881
Kamera Optronis GmbHCyclone-25-150-Mhttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
Corning 25 mm x25 mm Kare # 1 Kapak CamıCorning2845-25
Siklon-25-150Optronishttps://optronis.com/en/products/cyclone-25-150/
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG8270
Dijital Zamanlayıcı / KronometreFisher Scientific14-649-17
Dimetil sülfoksit (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Sekiz kuyulu dikdörtgen polistiren steril kültür plakasıThermo Fisher Scientific73521-426https://us.vwr.com/store/product/4679368/nunclontm-delta-rectangular-dishes-polystyrene-sterile-thermo-scientific
FHD Mikroskop Odası SistemiIonOptix
Flow EZ, Bilgisayar güdümlü program sürümü 1.1.0.0 ile modüler basınç tabanlı akış kontrolörü.Fluigent OxyGEN
Ağır Hizmet Tipi Vakum ŞişeleriVWR16211-080
HEPESSigma-AldrichH3375
İnsan Rekombinant Laminin 521BioLaminaLM521-05
Idex Kromatografi Tüpü, Doğal FEP, 1/16" OD x 0.030" IDCole-Palmer1520L
Kimberly-Clark Profesyonel Kimtech Bilim KimwipesFisher Scientific06-666
L-(-)-Malik asitSigma-Aldrich112577
Laktobiyonik asitSigma-Aldrich153516
L-Glutamik asitSigma-Aldrich49449
L-HistidinSigma-AldrichH8000
Magnezyum Klorür hekzahidrat (MgCl2)Sigma-AldrichM9272
Mikroskop Sıcaklık Kontrol Kademe IsıtıcıAmScopeTCS-100
MyoPacer Alan StimülatörüIonOptix
Nunc Dikdörtgen TabaklarThermo Scientific267062
Olympus IX83P1ZF Ixplore Standart mikroskopOlympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/inverted/ixplore-standard/?campaignid=657680540&adgroupid
=116963199831& Anahtar Kelime=IX73%20
Mikroskobu& gclid=EAIaIQobChMIl
qjyiMWP-AIVVx-tBh2JoQ85EAA
YASAAEgLp3fD_BwE
pH 4.01, 7.00 ve 10.01 StandartlarıOaktonWD-05942-10
Potasyum Klorür (KCl)Sigma-Aldrich746436
Potasyum Hidroksit (KOH)Sigma-AldrichP4494
Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)Sigma-Aldrich795488
Prism YazılımıGraphPad Yazılımı - Dotmaticshttps://www.graphpad.com/
RBS 25 Sıvı DeterjanSigma-Aldrich83460
Sharps ContainerUlineS-15307
SigmaPlot analiz yazılımıSystat Software Inc.https://systatsoftware.com/
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-AldrichS3014
Sodyum Hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich221465
Öğrencisi Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları91150-20
SükrozSigma-AldrichS7903
TaurinSigma-AldrichT0625
Sıcaklık Kontrol KutusuWarner InsturmentsTC-324C
Buhar Basıncı OzmometresiELITechGroupModel 5600
Wheaton 20 mL ŞişelerDWK Yaşam Bilimleri225288

Kaynaklar

  1. Abi-Gerges, N., Miller, P. E., Ghetti, A. Human heart cardiomyocytes in drug discovery and research: new opportunities in translational sciences. Current Pharmaceutical Biotechnology. 21 (9), 787806(2020).
  2. Cook, D., et al. Lessons learned from the fate of AstraZeneca's drug pipeline: A five dimensional framework. Nature Reviews Drug Discovery. 13 (6), 419-431 (2014).
  3. Van Meer, B. J., Tertoolen, L. G. J., Mummery, C. L. Measuring physiological responses of human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes to drugs and disease. Stem Cell. 34 (8), 2008-2015 (2016).
  4. Piccini, J. P., et al. Current challenges in the evaluation of cardiac safety during drug development: translational medicine meets the critical path initiative. American Heart Journal. 158 (3), 317-326 (2009).
  5. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  6. Page, G., et al. Human ex-vivo action potential model for pro-arrhythmia risk assessment. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 81, 183-195 (2016).
  7. Britton, O. J., et al. Quantitative comparison of effects of dofetilide, sotalol, quinidine, and verapamil between human ex vivo trabeculae and in silico ventricular models incorporating inter-individual action potential variability. Frontiers in Physiology. 8, 597(2017).
  8. Qu, Y., et al. Action potential recording and pro-arrhythmia risk analysis in human ventricular trabeculae. Frontiers in Physiology. 8, 1109(2017).
  9. Trovato, C., et al. Human Purkinje in silico model enables mechanistic investigations into automaticity and pro-arrhythmic abnormalities. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 142, 24-38 (2020).
  10. Otsomaa, L., et al. Discovery and characterization of ORM-11372, a novel inhibitor of the sodium-calcium exchanger with positive inotropic activity. British Journal of Pharmacology. 177 (24), 5534-5554 (2020).
  11. Nguyen, N., et al. Adult human primary cardiomyocyte-based model for the simultaneous prediction of drug-induced inotropic and pro-arrhythmia risk. Frontiers in Physiology. 8, 1073(2017).
  12. Abi-Gerges, N., et al. Multiparametric mechanistic profiling of inotropic drugs in adult human primary cardiomyocytes. Scientific Reports. 10, 7692(2020).
  13. Jordaan, P., et al. Cardiotoxic potential of hydroxychloroquine, chloroquine and azithromycin in adult human primary cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 180 (2), 356-368 (2021).
  14. Ton, A. T., et al. Arrhythmogenic and antiarrhythmic actions of late sustained sodium current in the adult human heart. Scientific Reports. 11, 12014(2021).
  15. Schmid, C., Abi-Gerges, N., Leither, M. G., Zellner, D., Rast, G. Ion channel expression and electrophysiology of singular human (primary and induced pluripotent stem cell-derived) cardiomyocytes. Cells. 10 (12), 3370(2021).
  16. Guha, R. On exploring structure activity relationships. Methods in Molecular Biology. 993, 81-94 (2013).
  17. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Ra then and now: The need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  18. Ruiz-Meana, M., Martinson, E. A., Garcia-Dorado, D., Piper, H. M. Animal ethics in cardiovascular research. Cardiovascular Research. 93 (1), 1-3 (2012).
  19. Rienks, M., Papageorgiou, A. P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial extracellular matrix. Circulation Research. 114 (5), 872-888 (2014).
  20. Zaglia, T., Mongillo, M. Cardiac sympathetic innervation, from a different point of (re)view. Journal of Physiology. 595 (12), 3919-3930 (2017).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İnsan KardiyomiyositleriKontraktilite ÖlçümüOptik KayıtSarkomer KısalmasıElektriksel Alan StimülasyonuKonsantrasyon YanıtıKalsiyum Geçici DurumuPreklinik Kardiyak DeğerlendirmeKontraktilite Genliği
İzole Yetişkin İnsan Primer Kardiyomiyositlerinde Kalp Kontraktilitesinin Ölçülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.