İnsan Antral Foliküllerinden Soya Özgü Hücrelerin Ekstraksiyonu, Etiketlenmesi ve Saflaştırılması

İnsan yumurtalıklarının birincil fonksiyonel elemanları, oositlerin büyümesini ve gelişimini yöneten foliküllerdir. Foliküler hücrelerin izolasyonu için protokoller in vitro fertilizasyon bağlamında iyi bir şekilde oluşturulmuştur, ancak bunlar sadece oosit elde etme noktasında luteinize foliküllerden hücrelerin toplanması için uygundur¹. Doğal yumurtalıklardan veya ksenotransplante edilmiş yumurtalık dokusundan kaynaklanan farklı gelişim aşamalarında ayrı hücre popülasyonlarının antral foliküllerden izole edilmesini sağlayan bir protokol geliştirdik². Folikül yerleşik hücrelerinin oosit yetiştiriciliğine katkılarının son derece önemli olduğu konusunda fikir birliği olmasına rağmen, az sayıda çalışma antral evre foliküllerinde bulunan benzersiz fenotipik alt tipleri prospektif olarak tanımlamış ve çıkarmıştır. Farklı gelişim aşamalarında uzmanlaşmış hücreler arasındaki farklılaşma hiyerarşisinin ve sinyal iletiminin daha derin bir şekilde anlaşılması, homeostatik ve patolojik koşullar altında yumurtalık fizyolojisi anlayışımızı genişletebilir. Ayrıca, ayrık hücresel alt tiplerin ayırt edilmesi ve folikül büyümesine / olgunlaşmasına moleküler katkıları, oosit olgunlaşmasını teşvik etmek ve / veya endokrin disfonksiyonu tedavi etmek için yumurtalık fonksiyonunu yeniden yapılandıran ex vivo vekiller üretmenin bir yolunu sağlayabilir.

Yumurtalık içindeki her benzersiz hücre tipi, içerdiği oositin büyümesini ve olgunlaşmasını teşvik etmek için ayrı bir mini organ olarak etkili bir şekilde işlev gören folikülün karmaşık işlevine katkıda bulunur. Folikülün merkezi olan oosit, doğrudan sürekli bir granüloza hücresi tabakası (GC'ler) ile sarılır, teka hücreleri (TC'ler), foliküler üniteyi oluşturmak için oosit ve GC'lerle birleşen ikincil bir hücre tabakası oluşturur. İki gruba ayrılmasına rağmen, GC'ler ve TC'ler çok sayıda alt tip içerir. GC'ler folikül içindeki konumlarına göre sınıflandırılır; Bazal membrana bitişik olanlara karşı oositi çevreleyen GC'ler sırasıyla ooforlu ve duvar GC'leri olarak tanımlanır ve bu alt tipler benzersiz transkriptomik imzalar gösterir. TC'lerin steroidojenik, metabolik ve yapısal destek sağlamak için işlev gören çok sayıda alt tipi vardır. Endotelyal, perivasküler ve immün hücreler normal over fizyolojisinin korunmasında merkezi bir rol oynar. Yumurtalık stroması sadece folikül büyümesi için bir substrat olarak hizmet etmekle kalmaz, aynı zamanda TC'lere yol açan bir progenitör kaynağı sağlar. Yumurtalık içindeki bu çok katmanlı hücresel alt tip kompleksi, hem endokrin hem de üreme organı olarak işlev görmesini sağlayan şeydir.

Bu yazıda antral foliküllerden granüloza, teka, stromal, endotel ve hematopoetik hücrelerin tanımlanması ve saflaştırılması için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolü, bu yumurtalık hücrelerini izole etmek ve bunları tek hücreli dizileme kullanarak analiz etmek, ardından farklı gelişim aşamalarındaki foliküllerde spesifik boyama yapmak için kullandık. Protokol, tekrarlanabilir ve yumurtalık fizyolojisinin ve patolojisinin yüksek çözünürlüklü analizini sağlayacak basit bir metodoloji sağlar.

Fareleri içeren tüm prosedürler, Weill Cornell Medicine'deki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Yumurtalık dokusu kullanılarak yapılan tüm ksenotransplantasyon deneyleri, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak gerçekleştirildi. Her iki yumurtalık da radyo/kemoterapi öyküsü olmayan ve belgelenmiş endokrin veya üreme koşulları öyküsü olmayan 14 yaşındaki beyin ölümü gerçekleşmiş organ bağışçısından izole edildi. Weill Cornell Medicine'in kurumsal inceleme kurulu (IRB) Komitesi, doku toplanmasını onayladı ve doku kullanımıyla ilgili bilgilendirilmiş onamın ardından organ bağışçısının ailesinden onay alındı.

1. Yumurtalık dokusunun toplanması ve taşınması

1. Tüm yumurtalıkları ve ilgili dokuyu toplayın ve steril tuzlu su çözeltisinde durulayın.
2. Steril cımbız kullanarak yumurtalıkları steril bir kaba koyun. Steril, tamponlanmış, soğuk çözeltiyi (örneğin, Leibovitz'in L-15 ortamı) kabın içine dökün. Dokunun tamamen sıvı ile kaplandığından emin olun.
3. Kabı kapatın ve steril plastik torbalar kullanarak iki kez torbalayın. Kabı buz üzerinde izole edilmiş bir kutu içinde taşıyın (örneğin, Strafor). Örnekleri, yumurtalıkları mümkün olan en kısa sürede, tercihen 5 saat ^3,4'ü geçmeyen bir sürede işleyecek laboratuvara aktarın.

2. Yumurtalık dokusunun işlenmesi

NOT: İskemik aralığı mümkün olduğunca azaltmak için doku laboratuvara gelmeden önce tüm reaktiflerin ve aletlerin hazırlandığından emin olun. Tamponlar donmadan 1 hafta öncesine kadar hazırlanabilir ve kullanıma kadar soğutulabilir.

1. Yumurtalık işleme ve dondurma için preparatlar
   1. Doku işlemeye hazırlık için biyogüvenlik kabinine sterilize edilmiş cerrahi aletler yerleştirin: bir numara 21 neşter; bir numara 11 neşter; keskin ince kavisli makas; bir uzun forseps (~ 150 mm uzunluğunda); ve iki orta forseps (~ 110 mm uzunluğunda).
   2. 100 mL doku işleme ortamı hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız): Leibovitz'in antibiyotik-antimikotik çözelti içeren ve 0.2 μm filtre kullanılarak filtrelenen L-15 ortamı. Ortamı soğutulmuş halde tutun.
   3. Kriyovyalleri etiketleyin, her şişeye 1,5 mL dondurma çözeltisi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 4 ° C'de saklayın.
   4. Kullanım için elinizde 6 delikli bir plaka bulundurun.
2. Dokunun varışında
   1. Kabı %70 etanol çözeltisi ile püskürtün, iyice silin ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin.
   2. Steril eldiven giyerek kabı açın. Yumurtalıkları steril bir Petri kabına yerleştirin ve dokuyu nemlendirmek için soğutulmuş ortamı (adım 2.1.2'den itibaren) dökün. Yumurtalığın ortama yarı batırılmış olduğundan emin olun.
   3. Herhangi bir dikişi veya başka bir materyali çıkarın ve kalan çevre dokuyu yumurtalıktan uzaklaştırın.

3. Antral foliküllerin izolasyonu

1. İzolasyon için bireysel folikülleri tanımlayın. Sağlıklı folikülleri seçerken, kan dolu, koyu veya simetrik olmayan folikülleri hariç tutun, çünkü bunların atretik olması muhtemeldir.
2. Seçilen antral folikülleri neşter kullanarak tüm yumurtalıktan izole edin, folikülü çevreleyen kortikal dokuyu eksize ederek antrumu sağlam tutun.
3. Eksize edilmiş her sağlam antral folikülü 6 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Tanımlayıcı amaçlar için gerekirse, folikül çapını belirlemek için çanağın altına yerleştirilmiş bir cetvel kullanın.
4. Bir neşter kullanarak, antral boşluğa erişmek için bozulmamış antral folikülü ikiye bölün ve 4 mL enzimatik hücre ayrılma ortamı ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
5. Gerektiğinde ek antral foliküllerin ekstraksiyonunu tekrarlayın.

4. Folikül yerleşik hücrelerinin izolasyonu

1. İnkübasyonu takiben,% 20 FBS içeren 4 mL kullanılabilir ortam ekleyin ve ortamın tekrarlanan, kuvvetli pipetlenmesiyle iki parçalı foliküller üzerinde bir P1.000 mikropipet ile yıkayın.
2. Ortamı toplayın ve 100 μm'lik bir filtreden geçirin.
3. Filtrelenmiş süpernatantı 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj edin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini (GC'lerle zenginleştirilmiş) etiketleme ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) için buz üzerinde ayırın.
4. Kalan dokuyu dengeli bir tuzlu su çözeltisi (örneğin, Hanks) içinde seyreltilmiş bir kollajenaz (100 U / mL) ve dispaz (1 U / mL) karışımına yerleştirin ve% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin, 10 dakika ve 20 dakika sonra iki kez tritürasyon ve kuvvetli pipetleme (yani, pipet ucundan 10-15 geçiş) ile dokuyu mekanik olarak bozar.
5. Dokuyu içeren ortamları geri kazanın, P1.000 mikropipet ucundan pipetle yıkayın ve 100 μm filtreden geçirin.
6. 3 dakika boyunca 300 × g ve 4 ° C'de santrifüj. Süpernatanı aspire edin ve etiketleme ve FACS için buz üzerindeki hücre peletini (TC'ler ve stroma hücreleri ile zenginleştirilmiş) bir kenara koyun.

5. Floresan ile aktive hücre sıralama

1. Hücre peletlerini bloke edici çözelti içinde (PBS +% 0.1 FBS) tekrar askıya alın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
2. 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı aspire edin.
3. Hücre peletlerini doğrudan konjuge antikorlar içeren bloke edici çözeltide yeniden askıya alın (GC'leri ve TC'leri tanımlamak için uygun antikor kombinasyonları için Tablo 1'e bakınız) ve buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.
4. Hücreleri 300 × g ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca yıkayın ve santrifüj edin. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren FACS tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın ve gating için florofor konjuge antikorların floresan yoğunluğunu kullanarak hücrelerin küçük bir popülasyonunu (500-1.000) yakalamak için hücre süspansiyonunu bir FACS cihazından geçirin.
5. Benzersiz alt popülasyonların tanımlanması için, aşağıdaki geçit stratejilerini kullanın:
   1. GC'lerin saflaştırılması için, CD45+ hücrelerinin etrafına bir kapı çizin (Şekil 1B) ve bu popülasyonu CD99⁺ popülasyonundan hariç tutun (Şekil 1A ve Şekil 1C); daha sonra, kalan CD99+ fraksiyonunu PVRL^+/- fraksiyonlarına bölün (Şekil 1A ve Şekil 1C).
   2. TC'lerin ve stromanın saflaştırılması için, CD34 + endotel fraksiyonunu (Şekil 1E) dışlamak ve steroidojenik (ANPEP +) ve steroidojenik olmayan (ANPEP^-) hücreleri ayırt etmek için toplam ENG + (Şekil 1A) veya CD55 ⁺ (Şekil 1D) popülasyonunu açın. Emisyon spektrumlarında yakın olan floroforlar arasındaki kanamayı telafi etmeye dikkat edin.
6. Sıralanmış hücre fraksiyonunun saflığını doğrulamak için, yakalanan toplam hacmin %5'ini FACS cihazı aracılığıyla çalıştırın ve hücrelerin beklenen kapıları doldurduğundan ve %>95 saflıkta bulunduğundan emin olun.

6. Yumurtalık kortikal dokusunun işlenmesi

1. Yumurtalığın geri kalanını ikiye bölün ve yumurtalık korteksine zarar vermemek için dikkatli olarak kavisli ince makas ve neşterler kullanarak medullayı eksize edin.
2. Minimal medulla kalana kadar yumurtalık korteksi hafifçe kazıyarak işlemeye ve inceltmeye devam edin. Gereken minimum kuvveti kullandığınızdan emin olun.
   NOT: Kortikal doku kalınlığı 1 mm ile 1,5 mm arasında olmalıdır.
3. Kortikal dokuyu yumurtalık uzunluğu boyunca 2-3 mm genişliğinde şeritlere bölün.

7. Yumurtalık dokusu yavaş donma

1. Donma için hazırlık
   1. Dondurma çözeltisi içeren her soğutulmuş kriyojenik şişeye bir kortikal şerit yerleştirin.
   2. Kortikal şeritleri içeren kriyojenik şişeleri dönen bir plaka üzerinde 4 ° C'de 20 dakika çalkalayın.
2. Yumurtalık dokusunun yavaş donması⁵
   1. Yumurtalık dokusu içeren kriyovyalleri 0 °C'de başlayacak şekilde programlanabilir bir dondurucuya yerleştirin.
   2. −7 °C'ye kadar 2 °C/dak hızında soğutun.
   3. Kriyovialları bu sıcaklıkta 10 dakika boyunca tutun.
   4. Her kriyoviyal sıvı azota (LN₂) kısa bir süre batırılmış bir pamuk ucu ile dokunarak buz kristali oluşumunu nüklee edin.
   5. Numune sıcaklığı −40°C'ye ulaşana kadar 0,3 °C/dak hızında soğutun.
   6. Numune sıcaklığı −140 °C'ye ulaşana kadar soğutma hızını 10 °C/dk'ya yükseltin.
   7. Kriyovyalleri LN_2'de depolamak için aktarın.

Folikülleri yumurtalık yüzeyinden izole ettik ve GC'lerin yanı sıra antral boşluğu çevreleyen theca ve stroma hücrelerini izole etmek için enzimatik olarak tedavi ettik. Hücreler toplandı ve hücre fraksiyonları antral foliküllerden (0.5 mm ile 4 mm arasında değişen çaplar) FACS tarafından% >95 saflığa kadar sıralandı (Şekil 1).

İnsan antral foliküllerindeki benzersiz hücresel fraksiyonları etiketlemek ve saflaştırmak için, enzimatik sindirimi akış sitometrik sıralama ile birleştirdik. Daha önce folikül yerleşik fraksiyonları2'yi özel olarak işaretleyen yüzey proteinlerini tanımladık. CD99'un (Şekil 1A'da kırmızı) özellikle GC'leri etiketlediğini ve PVRL1'in (Şekil 1A'da sarı) antral foliküllerboyut 2'de arttıkça ooforlu GC bölmesine giderek daha fazla lokalize olduğunu gösterdik. Ayrıca, endoglin (ENG, Şekil 1A'da yeşil) veya CD55'e (Şekil 1D) karşı antikorların tüm stroma ve TC'leri spesifik olarak sınırladığını ve alanin aminopeptidazın (ANPEP, Şekil 1E) özellikle androjenik TC'ler 2,6 ile eksprese edildiğini gösterdik.

Hücreler, GC'leri tanımlamak için CD99'a yönelik bir antikor ile etiketlendi ve hematopoetik hücreleri dışlamak için CD45'e karşı antikorlar kullanıldı (Şekil 1B, C). PVRL1'e karşı antikorlar, GC popülasyonunun ooforlu ve duvar kompartmanlarına ayrılmasını sağlamıştır (Şekil 1C). Kollajenaz / dispaz ile enzimatik sindirimi takiben, CD55 (veya alternatif olarak ENG), CD34 ve ANPEP'e karşı antikorlarla etiketlenmiş hücre preparatları, endotel hücrelerinin (CD34 +) TC popülasyonlarından dışlanmasıyla tüm stroma / TC'lerin (CD55 +) ve / veya androjenik TC'lerin (ANPEP +) yakalanmasını sağlamıştır (Şekil 1D, E). Bu paneli ve kademeli bir enzimatik ayrışma protokolünü kullanarak, hematopoietik, endotelyal, granüloza (ooforlu ve duvar resmi) ve theca (stromal ve androjenik) hücrelerini taze rezeke edilmiş yumurtalıkların antral foliküllerinden etiketledik ve saflaştırdık.

Şekil 1: İnsan antral foliküllerinden soya özgü hücrelerin etiketlenmesi ve saflaştırılması. (A) Antral aşamada insan folikülleri içindeki GC (CD99+ PVRL+/-) ve TC (ENG+) bölmelerini gösteren temsili mikrograf; Beyaz kontur kutuları sağa doğru büyütülür. (B-E) GC'leri CD45- CD99+ PVRL1+/- hücreleri (a ve b) ile jenerik (CD34- CD55+) ve androjenik (CD34- CD55+, ANPEP+) TC'ler (C,D) olarak tanımlayan temsili sıralama grafikleri. Kapılı popülasyonlar (B,C) ve (D,E) arasında paylaşılır; lekesiz kontroller solda (B-E) içinde gösterilir. Ölçek çubuğu = (A) 100 μm. Kısaltmalar: GC = granulosa cell; TC = teka hücresi; PVRL = nektin; ANPEP = alanin aminopeptidaz; Nuc = çekirdekler; SSC = yan saçılma; PE = fikoeritrin; APC = allofikosiyanin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: GC'leri, TC'leri ve yumurtalık stromasını tanımlamak için kullanılabilecek antikorların listesi. Kısaltmalar: GC = granulosa cell; TC = theca hücresi.

Tüm yazarlar birbiriyle çelişen çıkarları olmadığını beyan ederler.