Yöntem makalesi

Oreochromis spp. Çiftliklerinden Türetilen Patojenik Bir Escherichia coli Suşunun Karakterizasyonu Tüm Genom Dizilimini Kullanarak

DOI:

10.3791/64404

⸱

23 Aralık 2022

 ,  ,  , 
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, 2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Masaüstü cihazları kullanan tüm genom dizileme (WGS) stratejilerinin fizibilitesi, laboratuvar ortamında halk sağlığı ile ilgili her mikrobun genom sorgulamasını basitleştirmiştir. Bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlaması tanımlanmıştır ve analiz için bir biyoinformatik boru hattı da sunulmuştur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya çapında en hızlı büyüyen gıda üreten sektörlerden biridir ve tilapia (Oreochromis spp.) yetiştiriciliği, kültürlenen başlıca tatlı su balığı çeşidini oluşturmaktadır. Su ürünleri yetiştiriciliği uygulamaları antropojenik kaynaklardan kaynaklanan mikrobiyal kontaminasyona duyarlı olduğundan, yaygın antibiyotik kullanımına ihtiyaç duyulmakta ve bu da su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinin Escherichia coli (E. coli) gibi klinik açıdan önemli bir antibiyotiğe dirençli ve patojenik bakteri kaynağı haline gelmesine yol açmaktadır. Burada, iç kesimlerde yetiştirilen Oreochromis spp.'den elde edilen patojenik bir E. coli suşunun antimikrobiyal direnci, virülans ve mobilome özellikleri, tüm genom dizilimi (WGS) ve in silico analizi ile aydınlatılmıştır. Antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) ve WGS yapıldı. Ayrıca, filogenetik grup, serotip, multilokus sekans tiplemesi (MLST), edinilmiş antimikrobiyal direnç, virülans, plazmid ve profaj içeriği mevcut çeşitli web araçları kullanılarak belirlendi. E. coli izolatı sadece ampisilin için orta düzeyde duyarlılık sergiledi ve WGS tabanlı tipleme ile ONT: H21-B1-ST40 suşu olarak karakterize edildi. Sadece tek bir antimikrobiyal dirençle ilişkili gen [mdf(A)] tespit edilmesine rağmen, atipik enteropatojenik E. coli (aEPEC) patotipinden birkaç virülans ilişkili gen (VAG) tanımlanmıştır. Ek olarak, büyük plazmid gruplarından ve profaj ile ilişkili 18 bölgeden plazmid replikonlarının yükü tespit edildi. Sonuç olarak, Meksika'nın Sinaloa kentindeki bir balık çiftliğinden elde edilen bir aEPEC izolatının WGS karakterizasyonu, patojenik potansiyeli ve çiğ su ürünleri tüketmenin olası insan sağlığı riski hakkında bilgi sahibi olmayı sağlar. Çevresel mikroorganizmaları incelemek için yeni nesil dizileme (NGS) tekniklerinden yararlanmak ve sağlık sorunlarının nasıl ortaya çıktığını öğrenmek için tek bir sağlık çerçevesi benimsemek gerekir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Su ürünleri yetiştiriciliği, dünya çapında en hızlı büyüyen gıda üreten sektörlerden biridir ve üretim uygulamaları, insan tüketimi için artan gıda talebini karşılamayı amaçlamaktadır. Küresel su ürünleri yetiştiriciliği üretimi 1997 yılında 34 milyon tondan (Mt) 2017 yılında 112 Mt'ye üç katınaçıkmıştır 1. Üretimin yaklaşık% 75'ine katkıda bulunan ana tür grupları, deniz yosunu, sazan, çift kabuklu, yayın balığı ve tilapia (Oreochromis spp.) 1. Bununla birlikte, mikrobiyal varlıkların neden olduğu hastalıkların ortaya çıkması, yoğun balık yetiştiriciliği nedeniyle kaçınılmazdır ve potansiyel ekonomik kayıplara yol açmaktadır2.

Balık yetiştiriciliği uygulamalarında antibiyotik kullanımı, verimlilikteki ana sınırlayıcı faktör olan bakteriyel enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisi için iyi bilinmektedir 3,4. Bununla birlikte, artık antibiyotikler su ürünleri yetiştiriciliği çökeltilerinde ve suda birikir, seçici basınç uygular ve balıklarla ilişkili ve ikamet eden bakteri topluluklarını değiştirir 5,6,7,8. Sonuç olarak, su ürünleri yetiştiriciliği ortamı, antimikrobiyal direnç genleri (ARG'ler) ve çevredeki ortamda antibiyotiğe dirençli bakterilerin (ARB) daha fazla ortaya çıkması ve yayılması için bir rezervuar görevi görür9. Balık yetiştiriciliği uygulamalarını etkileyen yaygın olarak gözlenen bakteriyel patojenlere ek olarak, Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. ve Salmonella spp.10'un insan patojen suşları da dahil olmak üzere Enterobacteriaceae ailesinin üyelerine sıklıkla rastlanmaktadır. E. coli, balık yetiştiriciliğinde balık unu ve sudan izole edilen en yaygın mikroorganizmadır 11,12,13,14,15.

E. coli, memelilerin ve kuşların gastrointestinal sisteminde, bağırsak mikrobiyotalarının kommensal bir üyesi olarak yaşayan çok yönlü bir gram-negatif bakteridir. Bununla birlikte, E. coli, toprak, tortular, yiyecek ve su dahil olmak üzere farklı çevresel nişlerde kolonileşmek ve devam etmek için oldukça uyarlanabilir bir kapasiteye sahiptir16. Yatay gen transferi (HGT) fenomeni yoluyla gen kazancı ve kaybı nedeniyle, E. coli hızla insanlarda ve hayvanlarda geniş bir hastalık spektrumuna neden olabilen, iyi adapte olmuş antibiyotiğe dirençli bir patojene dönüşmüştür17,18. İzolasyon orijinine bağlı olarak, patojenik varyantlar intestinal patojenik E. coli (InPEC) veya ekstraintestinal patojenik E. coli (ExPEC) olarak tanımlanır. Ayrıca, InPEC ve ExPEC, hastalık tezahürüne, genetik arka plana, fenotipik özelliklere ve virülans faktörlerine (VF'ler) göre iyi tanımlanmış patotipler halinde alt sınıflara ayrılmıştır 16,17,19.

Patojenik E. coli suşları için geleneksel kültür ve moleküler teknikler, farklı patotiplerin hızlı bir şekilde tespit edilmesine ve tanımlanmasına izin vermiştir. Bununla birlikte, zaman alıcı, zahmetli olabilirler ve sıklıkla yüksek teknik eğitim gerektirebilirler19. Ayrıca, genetik geçmişlerinin karmaşıklığı nedeniyle E. coli'nin tüm patojenik varyantlarını güvenilir bir şekilde incelemek için tek bir yöntem kullanılamaz. Şu anda, bu dezavantajlar, yüksek verimli dizileme (HTS) teknolojilerinin ortaya çıkmasıyla aşılmıştır. Tüm genom dizileme (WGS) yaklaşımları ve biyoinformatik araçlar, mikrobiyal DNA'nın araştırılmasını uygun fiyatlı ve büyük ölçekte geliştirerek, yakından ilişkili patojenik varyantlar20,21,22 dahil olmak üzere mikropların tek bir çalışmada derinlemesine karakterizasyonunu kolaylaştırmıştır. Biyolojik sorulara bağlı olarak, veri analizi yapmak için çeşitli biyoinformatik araçları, algoritmalar ve veritabanları kullanılabilir. Örneğin, asıl amaç ARG'lerin, VF'lerin ve plazmidlerin varlığını değerlendirmekse, ResFinder, VirulenceFinder ve PlasmidFinder gibi araçlar, ilişkili veritabanlarıyla birlikte iyi bir başlangıç noktası olabilir. Carriço ve ark.22, ham veri ön işlemeden filogenetik çıkarıma kadar mikrobiyal WGS analizi için uygulanan farklı biyoinformatik yazılımlarına ve ilgili veritabanlarına ayrıntılı bir genel bakış sağlamıştır.

Birçok çalışma, WGS'nin antimikrobiyal direnç özellikleri, patojenik potansiyel ve farklı kökenlerden elde edilen E. coli'nin klinik olarak ilgili varyantlarının ortaya çıkışının ve evrimsel ilişkilerinin izlenmesi ile ilgili genom sorgulaması için geniş yararlılığını göstermiştir23,24,25,26 . WGS, nadir veya karmaşık direnç mekanizmaları da dahil olmak üzere antimikrobiyallere karşı fenotipik direncin altında yatan moleküler mekanizmaların tanımlanmasını sağlamıştır. Bu, edinilmiş ARG varyantlarını, ilaç hedef genlerindeki yeni mutasyonları veya promotör bölgeleri 27,28'i tespit ederek gerçekleşir. Dahası, WGS, bir bakteri suşu29'un direnç fenotipi hakkında önceden bilgi gerektirmeden antimikrobiyal direnç profilleri çıkarma potansiyeli sunar. Alternatif olarak, WGS, hem antimikrobiyal direnç hem de virülans özellikleri taşıyan mobil genetik elementlerin (MGE'ler) karakterizasyonuna izin vermiş ve bu da mevcut patojenlerin bakteriyel genom evrimini yönlendirmiştir. Örneğin, 2011 yılında Alman E. coli salgınının araştırılması sırasında WGS'nin uygulanması, görünüşte yeni bir E. coli patotipinin benzersiz genomik özelliklerinin ortaya çıkarılmasıyla sonuçlandı; İlginç bir şekilde, bu salgın suşları, Shiga toksinini kodlayan profajı enterohemorajik E. coli (EHEC) patotip30'dan alan enteroagregatif E. coli (EAEC) grubundan kaynaklanmıştır.

Bu çalışma, bir tezgah üstü sıralayıcı kullanarak bakteriyel WGS için iş akışının metodolojik bir uyarlamasını sunmaktadır. Ayrıca, ortaya çıkan dizileri analiz etmek ve sınırlı biyoinformatik uzmanlığı olan veya hiç biyoinformatik uzmanlığı olmayan araştırmacıları daha fazla desteklemek için web tabanlı araçlar kullanılarak bir biyoinformatik boru hattı sağlanmaktadır. Açıklanan yöntemler, 2011 yılında Sinaloa, Meksika'daki iç çiftlik Oreochromis spp.'den izole edilen patojenik bir E. coli suşu ACM5'in antimikrobiyal direncinin, virülansının ve mobilome özelliklerinin aydınlatılmasına izin verdi12.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: E. coli suşu ACM5, fekal koliform (FC) tayini12 için balık örneğinin işlenmesi ve kültürlenmesiyle geri kazanılmıştır. Balık örneklemesi sırasında, balıklar hastalık, bakteriyel veya mantar enfeksiyonunun klinik belirtilerini göstermedi ve ortalama 22.3 ° C'lik bir sıcaklık hakimdi. İzolasyondan sonra, E. coli izolatı biyokimyasal testlere tabi tutuldu ve kriyoprotektif bir ajan olarak DMSO (% 8 v / v) ile beyin kalp infüzyonu (BHI) suyunda kriyokorundu.

1. Dondurulmuş E. coli ACM5 stok kültürünün yeniden etkinleştirilmesi

  1. Dondurulmuş bakteri stoğundan, tüpü açın ve dondurulmuş bakteri kültürünün yüzeyini kazımak için steril bir döngü, pipet ucu veya kürdan kullanın.
  2. Bakterileri bir Luria-Bertani (LB) agar plakasına yerleştirin ve 24 saat boyunca 37 ± 2 ° C'de inkübe edin.

2. Antibakteriyel duyarlılığın belirlenmesi

NOT: Burada açıklanan antimikrobiyal duyarlılık testi, Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) kılavuzlarına (M02 Ed13:2018)31 dayanan disk difüzyon yöntemine karşılık gelir. E. coli Kalite kontrol amacıyla ATCC 25922 suşu gereklidir.

  1. Koloni süspansiyon yöntemi ile inokülum hazırlanması
    1. Adım 1.2'de inkübe edilen LB plakasından, bir veya iki koloni bir Mueller-Hinton (MH) agar plakasına çizgi çizin ve 18-24 saat boyunca 37 ± 2 ° C'de inkübe edin.
    2. MH agar plakası üzerindeki taze alt kültürlenmiş E. coli izolatından iki veya üç koloni seçmek için steril bir döngü kullanın ve bunları 3 mL steril MH suyu veya% 0.85 (w / v) tuzlu su çözeltisinde yeniden askıya alın, düzgün bir bakteri süspansiyonu elde etmek için vorteksleme ile iyice karıştırın.
    3. UV tarafından görülebilen bir spektrofotometre kullanarak ( bkz. Malzeme Tablosu), bakteriyel süspansiyonu 0,5 MacFarland standardıyla karşılaştırılabilir bulanıklığa ayarlayın (yaklaşık 1-2 x 108 hücre / mL'ye eşdeğer). Bakteriyel süspansiyon çok hafif veya çok ağırsa, uygun şekilde daha fazla E. coli kolonisi veya MH suyu ekleyin. Hazırlanan inokulumu, hazırlıktan sonraki 15 dakika içinde kullanın.
  2. Test agar plakalarının aşılanması
    1. Steril bir pamuklu çubuğu ayarlanmış bakteriyel süspansiyona batırın. Çubuğu birkaç kez döndürün ve çubuktan fazla sıvıyı çıkarmak için tüpün iç duvarına sıkıca bastırın.
    2. Çubuğu tüm agar yüzeyi boyunca 3x çizerek ve plakayı her seferinde 60 ° döndürerek bir MH agar plakasını aşılayın. İnokulumun eşit dağılımını sağlamak için agarın kenarını da sürün.
    3. Nemin buharlaşması için Petri kabının kapağını 3-5 dakika bekletin.
  3. Antimikrobiyal diskin aşılanmış agar plakalarına uygulanması
    1. Eşit olarak dağıtın ve tam teması sağlamak için her bir antimikrobiyal diski ( Malzeme Tablosuna bakınız) aşılanmış agar plakalarının yüzeyine bastırın. Disk uygulamasından sonra plakaları 15 dakika içinde ters çevirin ve 16-18 saat boyunca 35 ± 2 °C'de inkübe edin.
      NOT: Petri çanaklarında sırasıyla 150 mm ve 100 mm'lik maksimum 12 ve altı disk kullanılmalıdır.
  4. Kuluçkadan sonra, bir Vernier kaliperi kullanarak inhibisyon boyutlarının bölgesini ölçün ve elde edilen çapları CLSI kesme noktası kriterlerine göre yorumlayın (M100 - Tablo 2A)32.

3. Genomik DNA (gDNA) ekstraksiyonu ve nicelleştirmesi

  1. Genomik DNA ekstraksiyonu
    1. 5 mL LB suyunda taze kültürlenmiş bir E. coli kolonisi döngüsünü yeniden askıya alın ve 37 ± 2 ° C'de sallanan bir inkübatörde (180 rpm) gece boyunca inkübe edin.
    2. Bakteriyel süspansiyonu 5 dakika boyunca 3.500 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı dikkatlice atın.
    3. DNA ekstraksiyon kiti kılavuzlarını izleyerek gDNA'yı ekstrakte edin (bkz.
    4. UV tarafından görülebilen bir spektrofotometre kullanarak optik yoğunluğu 260/280 nm (oran: >1,8) ve 260/230 nm (oran: 2,0-2,2) olarak ölçerek gDNA'nın saflığını kontrol edin. GDNA bütünlüğünü doğrulamak için% 0.8 agaroz jel elektroforezi uygulayın.
  2. Genomik DNA nicelleştirme
    NOT: Yalnızca floresan tahlil kiti üreticisi tarafından onaylanmış ince duvarlı, şeffaf, 0,5 mL PCR tüpleri kullanın (bkz.
    1. Numuneler ve tahlil standartları için gerekli sayıda tüp ayarlayın. Üreticinin yönergelerini izleyerek, kitte sağlanan bileşen A ve bileşen B'yi karıştırarak çalışma tahlili çözümünü hazırlayın.
    2. Uygun tüpe çalışma çözeltisinin 190 μL'sini ve her standardın 10 μL'sini ekleyerek tahlil standartlarını hazırlayın (iki standart gereklidir).
    3. Uygun tüpe çalışma çözeltisinin 198 μL'sini ve DNA örneğinin 2 μL'sini ekleyin. Tüm tüpleri 5 s boyunca vortekleyerek kuvvetlice karıştırın. Kabarcık oluşturmamaya dikkat edin.
    4. Tüm tüpleri oda sıcaklığında, ışıktan korunarak 2 dakika boyunca inkübe edin. Florometreyi kullanarak üreticinin yönergelerine göre tüm tüplerin floresansını ölçün (bkz.
    5. Sıralama işlemi için gDNA numune konsantrasyonunu uygun şekilde ayarlayın.

4. DNA kütüphanesi hazırlama

NOT: DNA kütüphanesi hazırlama ve dizileme, üreticinin kılavuzları ve protokolleri izlenerek gerçekleştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Başlangıç gDNA konsantrasyonu 4.0 ng'dir.

  1. Etiketleme, PCR amplifikasyonu ve indeksleme
    1. 0.2 mL'lik bir tüpte, 2.5 μL etiketleme tamponu ve 2 μL giriş gDNA'sı (2.0 ng / μL) ekleyin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın.
    2. 1 μL amplifikasyon tamponu ekleyin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 280 x g'de döndürün.
    3. Numuneleri bir termosikler içine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve aşağıdaki PCR programını çalıştırın: 5 dakika boyunca 55 °C, ardından 10 °C'de tutun. Numuneler 10 ° C'ye ulaştığında, reaksiyonu nötralize etmek için hemen devam edin.
    4. Numune tüplerine 1 μL nötrleştirici tampon ekleyin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın. 1 dakika boyunca 280 x g'de döndürün ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. Her indeks adaptöründen 1,7 μL (yani, i7 ve i5 indeksleri) ve 3 μL indeksleme PCR ana karışımı ekleyin. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 280 x g'de döndürün.
    6. Numuneleri termosikler içine yerleştirin ve aşağıdaki gibi ikinci bir PCR reaksiyonu gerçekleştirin: 3 dakika boyunca 72 °C, 30 s için 95 °C, 10 s için 95 °C'lik 18 döngü, 30 s için 55 °C, 30 s için 72 °C, 5 dakika boyunca 72 °C ve 10 °C'de tutun.
  2. Güçlendirilmiş kütüphane temizliği
    1. Ticari manyetik boncuk çözeltisini vorteks yaparak karıştırın (bkz. Malzeme Tablosu) üreticinin yönergelerine dayanarak.
    2. Etiketlenmiş / indekslenmiş gDNA örneğini yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın ve gDNA örneğinin son hacminin (≈13 μL) her μL'si için 0.6 μL manyetik boncuk ekleyin. Pipetleyerek hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Numune tüplerini, süpernatant temizlenene kadar 2 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
    4. Karıştırmadan 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ekleyin. Elüat temizlenene kadar 30 s boyunca inkübe edin ve boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın ve atın.
    5. İkinci bir yıkama adımı uygulayın. Boncuklara 200 μL% 80 etanol ekleyin ve 30 saniye boyunca kuluçkaya yatırın. Seyreltme temizlendikten sonra, süpernatantı çıkarın ve atın ve boncukları 10 dakika boyunca havayla kurutun.
    6. Boncuklara 15 μL 10 mM tris tamponu (pH 8) ekleyin ve pipetleyerek, hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın. Numune tüplerini 2 dakika boyunca manyetik rafa tekrar yerleştirin ve süpernatantın temizlenmesini sağlayın.
    7. Süpernatantın 14 μL'sini numune tüpünden yeni bir 0,2 mL tüpe dikkatlice aktarın. Bu temizlenmiş kütüphanedir.
      NOT: Bu noktada, temizlenen kütüphane -20 °C'de 7 güne kadar saklanabilir.
  3. Kitaplık normalleştirme
    1. Adım 3.2.5 hariç, adım 3.2'de açıklandığı gibi floresan testi ile temizlenmiş kitaplıkları ölçmeye devam edin.
    2. Ortalama parça boyutlarını belirlemek için temizlenmiş kütüphaneleri% 1'lik bir agaroz jel elektroforezi üzerinde görselleştirin.
    3. Aşağıdaki denklemi kullanarak kitaplığın molarite değerini hesaplayın:
      figure-protocol-1
    4. Molarite değerini kullanarak, tek tek kütüphaneyi 10 nM'lik bir başlangıç konsantrasyonunda seyreltmek için uygun miktarda resuspension tamponu (RSB) ve temizlenmiş kütüphaneleri hesaplayın.

5. Kütüphane havuzlaması, doğallıktan çıkarma ve sıralayıcı başlatma

  1. Reaktif kartuşunu üreticinin talimatlarını izleyerek çözün. Akış hücresini buzdolabından (4 ° C) çıkarın ve sıralamadan önce oda sıcaklığına getirin.
  2. Her normalleştirilmiş kütüphanenin (10 nM) 5 μL'sini düşük bağlanmış 1,5 mL'lik bir tüpe dönüştürün. Havuza alınmış kitaplığı 4 nM'de uygun RSB hacmiyle seyreltin.
  3. Havuza alınmış kütüphanenin 5 μL'sini (4 nM) ve 5 μL'lik 0,2 N NaOH'yi yeni bir düşük bağlamalı 1,5 mL tüpe ekleyin. Girdap yaparak kısaca karıştırın, 1 dakika boyunca 280 x g'de aşağı doğru döndürün ve havuzlanmış kütüphaneyi tek iplikçiklere ayırmak için oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  4. 10 μL denatüre havuzlanmış kütüphane ve 990 μL önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponunu pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve sıralayıcı yüklemesi için son seyreltme yapılana kadar buzun üzerine yerleştirin. Denatüre havuzlanmış kütüphanenin konsantrasyonu 14:00'tür.
  5. 2 μL kontrol kütüphanesi (10 nM) ve 3 μL nükleaz içermeyen suyu karıştırarak 4 nM konsantrasyonda bir kontrol kütüphanesini (bakınız Malzeme Tablosu) çözün ve hazırlayın.
  6. Kontrol kütüphanesinin 5 μL'sini (4 nM) ve taze hazırlanmış 0,2 N NaOH'nin 5 μL'sini karıştırın. Vorteks yaparak kısaca karıştırın, 1 dakika boyunca 280 x g'de aşağı doğru döndürün ve kontrol kütüphanesini tek iplikçiklere ayırmak için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  7. 10 μL denatüre kontrol kütüphanesi ve 990 μL önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponunu pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve sıralayıcı yüklemesi için son seyreltme tamamlanana kadar buzun üzerine yerleştirin. Denatüre kontrol kütüphanesinin konsantrasyonu 20 pM'dir.
  8. Yeni bir düşük bağlantılı 1,5 mL tüpte, 20:00'de denatüre edilmiş havuzlanmış kütüphanenin 594 μL'sini ve 20:00'de denatüre kontrol kütüphanesinin 6 μL'sini birleştirin. Düzgün karıştırın.
  9. Önceden soğutulmuş hibridizasyon tamponunu kullanarak son kütüphane karışımını (20 pM) 600 μL'lik bir hacimde 1,2 pM'lik bir son yükleme konsantrasyonuna kadar seyreltin.
  10. Son kütüphane karışımını reaktif kartuşuna yüklemeden önce, akış hücresine verimli yükleme sağlamak için ek bir termal ön işlem gerçekleştirin. Son kütüphane karışımını 96 °C'de 2 dakika boyunca inkübe edin. Karıştırmak için tüpü ters çevirin ve tüpü 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  11. Son kütüphane karışımının 500 μL'sini reaktif kartuşu üzerindeki tasarlanmış hazneye yükleyin. Yönergeleri izleyerek sıralamayı başlatın. Akış hücresini ve reaktif kartuşunu yükleyin ve sıralama çalışmasını ayarlayın.

6. Veri analizini sıralayın

NOT: Genel WGS veri ön işleme, yazılım, parametre ayarları ve E. coli genomunun dizi analizinin daha ayrıntılı açıklaması için Ek Dosya 1'e bakın.

  1. Sıralama veri sunucusuna bağlanın ve FASTQ dosyalarını indirin.
  2. Üçüncü taraf yazılımlarla ham dizi verilerinin başlangıç kalitesini değerlendirin. Kalan bağdaştırıcı dizilerini, düşük kaliteli tabanları (Ek Dosya 1).
  3. Kalite kontrollü sıralama verilerini, üçüncü taraf yazılımları kullanarak contig veya iskele düzeyinde birleştirin (bkz. Ek Dosya 1).
  4. Toplanan genomu içeren FASTA dosyasını RAST sunucusuna göndererek genom ek açıklamasını gerçekleştirin (https://rast.nmpdr.org/).
  5. Epidemiyolojik özellikleri, ARG'leri, VAG'leri ve plazmidleri tanımlamak için FASTA dosyasını Genom Epidemiyolojisi Merkezi (CGE) (http://www.genomicepidemiology.org/services/) ve ClermonTyping (http://clermontyping.iame-research.center/index.php) web platformlarına yükleyin (Ek Dosya 1'e bakın).
  6. Profaj dizilerini (https://phaster.ca/) tanımlamak için FASTA dosyasını PHASTER sunucusuna yükleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antimikrobiyal duyarlılık disk difüzyon yöntemi ile belirlendi ve altı ayrı antimikrobiyal sınıfı kapsayan 12 antibiyotik için CLSI kesme noktası kriterleri ile yorumlandı, yani aminoglikozitler, β-laktamlar, florokinolonlar, nitrofuranlar, fenikoller ve folat yolu antagonistleri. E. coli ACM5, bir β-laktam ilacı hariç tüm antibiyotiklere duyarlılık gösterdi. Dört β-laktam ilaç test edildi: ampisilin, karbenisilin, sefalotin ve sefotaksim. Bunlar arasında, ampisilin için 14 mm'lik bir inhibisyon halesi ölçüldü. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, patojenik bir E. coli varyantının genomik karakterizasyonu için bir tezgah üstü sıralayıcı ve bir boru hattı kullanılarak bakteriyel WGS iş akışının bir adaptasyonunu sunmaktadır. Kullanılan dizileme platformuna bağlı olarak, ıslak laboratuvar prosedürleri (bakteri kültürü, gDNA ekstraksiyonu, kütüphane hazırlama ve dizileme) ve dizi analizi için geri dönüş süreleri (TAT'lar), özellikle yavaş büyüyen bakteriler incelenirse değişebilir. Yukarıda açıklanan WGS protokolünü takiben, TAT 4 gün içinde idi,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

José Antonio Magaña-Lizárraga'ya verilen Doktora bursu için Meksika Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi'ne (İspanyolca'daki kısaltmasıyla CONACyT) [No. 481143].

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Accublock Mini dijital kuru banyoLabnetD0100Tüplerin inkübasyonu için kuru banyo
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881DNA kütüphanesi saflaştırması için çözelti içinde manyetik boncuklar
DeNovix DS-11DeNovix Inc.gDNA ekstrakte edilen DNA'nın kalitesini kontrol etmek için UV-Vis spektofotometresi
LoBindTüpleri Eppendorf0030108418DNA kütüphanesi havuzu için 1.5 mL PCR tüpleri
DynaMag-2 MagnetInvitrogen, Thermo Fisher Scientific12321DManyetik boncuk bazlı DNA saflaştırması sırasında kullanılan manyetik mikrotüp raf
Gram-negatif Multibac IDTanısal araştırma (Meksika)PT-35Antimikrobiyal duyarlılık testi için ticari standart antibiyotik diskler
MiniSeq Orta Çıkış Kiti (300 döngü)IlluminaFC-420-1004Eşleştirilmiş uç dizileme için reaktif kartuşu (2x150)
MiniSeq Sistem EnstrümanıIlluminaSY-420-1001Yeni nesil dizileme
Eppendorf5452000816Tüpler için standart santrifüj
Nextera XT DNA Kütüphanesi Hazırlama KitiIlluminaFC-131-1024Dizileme için DNA kitaplıklarını gerçekleştirmek için reaktifler. 24 numune için Kutu 1 ve Kutu 2 reaktifleri içerir
Nextera XT Dizin Kiti v2IlluminaFC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004İndeks seti A, B, C, D
PhiX Kontrolü v3Dizileme için IlluminaFC-110-3001DNA kitaplığı kontrolü
Hassas su banyosuLabCare America51221081Bakteri kültürü için kullanılan su banyosu çalkalayıcı
Qubit 1X dsDNA HS Test KitiInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ33231Floresan bazlı DNA kantifikasyon testi için reaktifler
Qubit 2.0 FlorometreInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32866Floresan tahlili için kullanılan florometre ve nbsp;
Qubit Test tüpleriInvitrogen, Thermo Fisher ScientificQ32856floresan bazlı DNA kantifikasyon testi için 0.5 mL PCR tüpleri 
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems, Thermo Fisher ScientificA24811DNA kütüphanesi amplifikasyonu için kullanılan Thermocycler
Spectronic GENESYS 10 VisThermo335900Antimikrobiyal duyarlılık testinde bakteriyel süspansiyon için kullanılan spektofotometre
ZymoBIOMICS DNA Miniprep KitiZymo Research Inc.Genomik DNA ekstraksiyonu içinD4300
MiniSpin santrifüj için kullanılan tezgah üstü sıralayıcı Kiti (50 hazırlık)

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
  2. Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
  3. Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
  4. Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160(2017).
  5. Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
  6. Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854(2021).
  7. Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173(2022).
  8. Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626(2020).
  9. Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
  10. Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128(2017).
  11. Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
  12. Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
  13. Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
  14. Liao, C. -Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653(2021).
  15. Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136(2022).
  16. Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
  17. Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
  18. Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
  19. Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
  20. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
  21. Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
  22. Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
  23. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
  24. Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
  25. Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782(2020).
  26. Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662(2022).
  27. Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437(2021).
  28. Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957(2020).
  29. Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
  30. Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
  31. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018).
  32. CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute. , Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021).
  33. Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
  34. Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
  35. Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204(2013).
  36. Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
  37. Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
  38. Ménard, L. -P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
  39. Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
  40. Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23(2019).
  41. Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38(2021).
  42. FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016).
  43. Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing
Posted by JoVE Editors on 2/02/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Characterization of a Pathogenic Escherichia coli Strain Derived from Oreochromis spp. Farms Using Whole-Genome Sequencing. The Authors section was updated from:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

to:

José Antonio Magaña-Lizárraga1,
Bruno Gómez-Gil2,
Julissa Enciso-Ibarra2,
María Elena Báez-Flores1
1Unidad de Investigaciones en Salud Pública “Dra. Kaethe Willms”, Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa
2Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD), Unidad Mazatlán en Acuicultura y Manejo Ambiental

Etiketler

Escherichia ColiWhole Genome SequencingAntimicrobial ResistanceTilapia FarmingPathogenic BacteriaNext Generation SequencingAquaculture MicrobiologyPlasmid AnalysisVirulence GenesProphage Detection

İlgili makaleler