Yöntem makalesi

İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

DOI:

10.3791/64418

⸱

25 Kasım 2022

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ajou University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve yanlış katlanmış ve agrega olmuş α-sinüklein içeren Lewy cisimlerinin oluşumunun neden olduğu ilerleyici hücre ölümü ile karakterizedir. α-sinüklein, sinaptik vezikül kaçakçılığını düzenleyen bol miktarda presinaptik bir proteindir, ancak proteinli inklüzyonların birikmesi nörotoksisiteye neden olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyel şaperonlar da dahil olmak üzere çeşitli genetik faktörlerin, in vitro α-sinüklein agregalarının oluşumunu azaltabileceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bunu hastalar için potansiyel bir tedavi olarak uygulamak için hücredeki anti-agregasyon etkisini izlemek de önemlidir. Nöronal hücreleri kullanmak ideal olacaktır, ancak bu hücrelerin ele alınması zordur ve anti-agregasyon fenotipini sergilemek uzun zaman alır. Bu nedenle, in vivo anti-agregasyon aktivitesinin daha fazla değerlendirilmesi için hızlı ve etkili bir in vivo araç gereklidir. Burada açıklanan yöntem, insan α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya Saccharomyces cerevisiae'deki anti-agregasyon fenotipini izlemek ve analiz etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, α-sinüklein kaynaklı hücresel toksisiteyi ve ayrıca hücrelerde α-sinüklein agregalarının oluşumunu izlemek için kullanılabilecek in vivo araçları göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk2 olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri3 adı verilen amiloid agregalarının oluşumuna yol açar. α-sinüklein, PD'nin patogenezine çeşitli şekillerde katkıda bulunabilir. Genel olarak, protofibriller adı verilen anormal, çözünür oligomerik formlarının, sinaptik fonksiyon3 de dahil olmak üzere çeşitli hücresel hedefleri etkileyerek nöronal hücre ölümüne neden olan toksik türler olduğu düşünülmektedir.

Nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılan biyolojik modeller, genomları ve hücresel biyolojileri açısından insanlarla ilgili olmalıdır. En iyi modeller insan nöronal hücre hatları olacaktır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, kültürlerin bakımındaki zorluklar, düşük transfeksiyon verimliliği ve yüksek masraf4 gibi çeşitli teknik sorunlarla ilişkilidir. Bu nedenlerle, bu araştırma alanındaki ilerlemeyi hızlandırmak için kolay ve güvenilir bir araç gereklidir. Önemli olarak, toplanan verileri analiz etmek için aracın kullanımı kolay olmalıdır. Bu perspektiflerden, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, maya ve kemirgenler5 dahil olmak üzere çeşitli model organizmalar yaygın olarak kullanılmıştır. Bunlar arasında maya en iyi model organizmadır, çünkü genetik manipülasyon kolaydır ve diğer model organizmalardan daha ucuzdur. En önemlisi, maya, insan ortologlarına% 60 dizi homolojisi ve% 25 insan hastalığınabağlı genlerle yakın homoloji 6 gibi insan hücrelerine yüksek benzerliklere sahiptir ve ayrıca temel ökaryotik hücre biyolojisini paylaşırlar. Maya, insan hücrelerindekilere benzer dizilere ve benzer işlevlere sahip birçok protein içerir7. Gerçekten de, insan genlerini ifade eden maya, hücresel süreçleri aydınlatmak için model bir sistem olarak yaygın olarak kullanılmıştır8. Bu maya suşu insanlaştırılmış maya olarak adlandırılır ve insan genlerinin işlevini keşfetmek için yararlı bir araçtır9. İnsanlaştırılmış maya, genetik etkileşimleri incelemek için değerlidir, çünkü genetik manipülasyon mayada iyi kurulmuştur.

Bu çalışmada, Saccharomyces cerevisiae mayasını PD'nin patogenezini incelemek, özellikle α-sinüklein agrega oluşumunu ve sitotoksisiteyi araştırmak için model organizma olarak kullandık10. Tomurcuklanan mayada α-sinükleinin ekspresyonu için, W303a suşu, α-sinükleinin vahşi tip ve ailesel PD ile ilişkili varyantlarını kodlayan plazmidlerle transformasyon için kullanılmıştır. W303a suşu URA3 üzerinde oksotrofik bir mutasyona sahip olduğundan, URA3 ile plazmidler içeren hücrelerin seçimi için geçerlidir. Bir plazmidde kodlanmış α-sinüklein ekspresyonu, GAL1 promotörü altında düzenlenir. Böylece, α-sinükleinin ekspresyon seviyesi kontrol edilebilir. Ek olarak, yeşil floresan proteinin (GFP) α-sinükleinin C-terminal bölgesinde füzyonu, α-sinüklein odaklarının oluşumunun izlenmesini sağlar. α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantlarının özelliklerini anlamak için, bu varyantları mayada da ifade ettik ve hücresel etkilerini inceledik. Bu sistem, α-sinükleinin sitotoksisitesine karşı koruyucu rol oynayan bileşikleri veya genleri taramak için basit bir araçtır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

  1. Medya hazırlama
    1. YPD ortamını hazırlamak için, sterilizasyon için 1 L. Otoklav nihai hacmi yapmak üzere 50 g YPD tozunu dH2O'da çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
    2. YPD agar ortamı yapmak için, sterilizasyon için 50 g YPD tozu ve 20 g agar'ı 1 L dH2O. Otoklav içinde çözün. Soğuduktan sonra Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
    3. SC'yi rafinoz (SRd)-Ura ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfatla ve amino asitler olmadan sterilizasyon için 795 mL dH2O. Otoklav içinde çözün. Kullanmadan önce 100 mL% 20 rafinoz, 5 mL% 20 glikoz ve 100 mL 10x -Ura bırakma ekleyin.
    4. SD-Ura agar ortamını yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfat ile ve amino asitler olmadan ve 20 g agar'ı 800 mL dH 2 O. Otoklav içinde2L'nin üzerinde hacimli bir şişede çözün. İyice karıştırın ve Petri yemeklerinin üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
    5. SC'yi galaktoz (SG)-Ura agar ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfat ile ve amino asitler olmadan ve 20 g agar'ı 800 mL dH 2 O. Otoklav içinde2L'nin üzerinde hacimli bir şişede çözün. İyice karıştırın ve Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
  2. SD medya ile kullanılacak stok çözümleri
    1. % 20'lik bir karbon kaynağı (glikoz, galaktoz ve rafinoz) yapmak için, 500 mL'lik bir son hacim yapmak için dH2O'da 100 g glikoz, galaktoz veya rafinoz çözün. RT'de otoklav ve mağaza.
    2. Urasilsiz 10x maya sentetik bırakma orta takviyeleri yapmak için (10x-Ura bırakma), 19.2 g "urasilsiz maya sentetik bırakma orta takviyeleri" ni dH2O'da çözün ve 1 L. Otoklav son hacmini yapın ve RT'de saklayın.
      NOT: Agar içeren bir ortamın hazırlanması için, Petri kaplarına dökmeden önce tüm çözeltileri iyice karıştırmak için şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.

2. Maya dönüşümü

NOT: pRS426 plazmid, α-sinüklein genini klonlamak için kullanıldı ve seçilebilir bir belirteç olarak URA3 genini içeriyordu. Ciddi hastalık fenotiplerine (örneğin, sitotoksisite) sahip olan α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantları vardır. Bu varyantlar burada sitotoksisitelerini ve agrega odakları oluşumunu izlemek için de kullanılmıştır. Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm deneyler için aynı maya dönüştürücü kolonisini kullanın.

  1. Maya ekspresyon plazmidlerinin transformasyonu için, kontrol ve α-sinüklein içeren plazmidler olarak boş bir vektör (pRS426) kullanın. Standart lityum asetat (LiAc) yöntemi11'e atıfta bulunarak, altı yetkin hücre ve her plazmidin 0.5 μg'sini hazırlayın ve dönüşümü gerçekleştirin.
  2. Plazmidler içeren maya dönüştürücüleri seçmek için, urasilsiz (SD-Ura) sentetik tanımlı ortamı (SD ortam) kullanın ve plakaları 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
  3. Daha ileri deneyler için plazmid içeren hücrelerin seçimi için üç tek koloni bir SD-Ura agar plakasına yama yapın.
    NOT: Doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için, suş başına en az üç biyolojik kopyayı inceledik.

3. Tespit testi

NOT: GFP etiketli α-sinükleinin yüksek kopya numaralı plazmidlerde ekspresyonunun, maya10'daki sitotoksisite ile ilişkili olduğu bilinmektedir.

  1. GAL1 promotörü ve% 0.1 glikoz altında α-sinükleinin indüksiyonunun inhibisyonu için% 2 rafinoz ile plazmidleri içeren mayanın seçici büyümesi için suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın. Hücre kültürünü 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Tüm deneylerin farklı kolonilerle tekrarlanması önemlidir. Aynı sonuçların üçten fazla bağımsız koloniden elde edilmesi, sonucun güvenilir olduğu anlamına gelir.
  2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 3 mL taze SRd-Ura'ya 0.2'lik bir OD 600'e aşılayın ve200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
  3. OD600 0.6-0.8'e ulaştığında, lekelenme testi için hücreleri 96 delikli plakalarda aşağıdaki gibi seyreltin.
    1. Tüm numunelerin OD 600'ünü ölçün ve her kültürdeki hücre sayısını eşitlemek için numuneleri96 delikli bir plakanın 1. şeridinde steril dH2O (karışık hacim 100 μL) ile 0,5 OD600'e seyreltin.
    2. Sonraki beş şeride 160 μL steril dH2O ekleyerek maya hücrelerinin beş kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin. Her şeritteki hücreleri seri olarak seyreltirken toplam 40 μL hacim sağlayın.
      NOT: Düşük seyreltme faktörleri, numuneler arasında daha büyük farklılıklar yaratabilir. Seri seyreltmeler gerçekleştirilirken homojen karıştırma sağlamak için yeterli pipetleme gereklidir. Pipet ucu her seyreltme noktasında değiştirilmelidir. Aksi takdirde, ucun yüzeyine tutturulmuş hücreler bir sonraki kuyucuğa aktarılabilir ve hücre sayısını etkileyebilir.
  4. Kontroller için SD-Ura agar plakalarındaki numuneleri ve toksisiteyi izlemek için SG-Ura agar plakalarındaki numuneleri tespit etmek üzere her bir kuyucuktan 10 μL aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
    NOT: Benekli numuneler plakalara tamamen emilene kadar plakalar kurutulmalıdır.
  5. Benekli plakaları 4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
  6. 4. güne kadar her 24 saatte bir plakaların görüntülerini alın ve ardından gözle tespit edilen suşlar arasındaki büyüme farklılıklarını karşılaştırarak verileri analiz edin. En seyreltilmiş numunedeki bireysel kolonileri sayın, her bir suş için orijinal kültürdeki canlı hücrelerin sayısını hesaplayın veya tek kolonilerin boyutunu karşılaştırın.

4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak maya büyümesinin ölçülmesi

  1. Suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın ve gece boyunca 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de inkübe edin.
    NOT: α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya suşunun her koloni fenotipini anlamak için, tüm deneyler için aynı dönüştürücüleri kullanın.
  2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda toplam 200 μL taze SD-Ura ve SG-Ura'ya aşılayın. Hücreler de dahil olmak üzere son ses seviyesini 200 μL'ye ayarlayın ve başlangıç hücresi OD600'ü 0,05'e ayarlayın.
    1. Mikrotitre plakasındaki Program ayarlarını aşağıdaki gibi yapın: hedef sıcaklığı 30 ° C'ye ayarlayın, sarsıntı (Doğrusal) süresini 890 s'ye ayarlayın, sarsıntı (Doğrusal) genliğini 5 mm'ye ayarlayın, aralık süresini 00:15:00'e ayarlayın ve ölçümü 600 nm emici olarak ayarlayın.
    2. Tüm suşların bir mikroplaka okuyucuda sabit faza ulaşması için plakayı 2-3 gün boyunca inkübe edin.
  3. Büyüme eğrisini çizerek verileri analiz edin (örneğin, Çalışma Kitabı'nı kullanarak). Üç biyolojik kopyadan absorbans değerlerinin ortalamasını alarak veri noktalarını elde edin ve hata çubuklarını belirtin. Kontrol olarak yalnızca ortamdan absorbans değerini kullanın ve bunu kültürlenmiş hücrelerden alınan değerlerden çıkarın (isteğe bağlı).

5. Floresan mikroskobu

  1. Yamalı maya dönüştürücülerini 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın ve 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de gece boyunca kültürleyin.
    NOT: Fenotipin sitotoksisite ve odak oluşumu ile korelasyonunu belirlemek için, deney için aynı kolonileri kullanın.
  2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 3 mL taze SRd-Ura'ya 0.003'lük bir OD600'e yeniden aşılayın. OD600, 200 rpm'de (~ 18 saat) ajitasyon altında 30 ° C'de 0,2'ye ulaşana kadar kültürü inkübe edin.
  3. 0.2'lik bir OD 600 elde edildiğinde, 300 μL% 20 galaktoz ekleyin ve daha sonra200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de 6 saat daha inkübe edin.
  4. Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
  5. Hücre peletini 30 μL damıtılmış suda nazikçe yeniden askıya alın.
  6. Askıya alınan hücrelerin 5 μL'sini bir sürgülü cama yükleyin. Bir agaroz jel ped12 hazırlayın ve eşit şekilde yayılmasını sağlamak için yüklü hücrelere koyun.
  7. Hem parlak alan hem de GFP-floresan filtreleri kullanarak 100x objektifle mikroskobik görüntüleme gerçekleştirin.
    1. İlk olarak, daldırma yağı kullanarak hücreyi 100x hedefle odaklamak için brightfield kullanın. Programı kullanarak görüntüleri oluşturmak için ekran yakalama seçeneğini kullanın.
    2. GFP-floresan filtresine geçin. Sinyal-parazit oranını dengeleyerek net bir görüntü elde etmek için görüntü pozlama süresini 50 ms ile 300 ms arasında ayarlayın. Ekran programı kullanarak görüntüyü yakalar .
    3. Birçok hücreyi tek bir noktadan ziyade birden fazla noktadan görüntüleyin.
  8. Analitik yazılım kullanarak α-sinüklein agregalarının odaklarını içeren hücrelerin yüzdesini sayarak görüntüleri analiz edin. Çözünür GFP protein sinyali ile odaklar tarafından oluşturulan GFP sinyali arasındaki farkları ve GFP'nin α-sinükleinin A30P varyant formu ile difüzyonunu gözlemleyin.
    NOT: Odaklar oluşumu, α-sinükleinin vahşi tip, E46K ve A53T varyantları ile gözlenecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

α-sinükleinin yüksek ekspresyonunun, PD'nin model sistemlerinde nöronal hücre ölümü ve PD ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, α-sinükleinin sitotoksisitesini ve mayada agrega α-sinükleinin odak oluşumunu izlemek için üç yöntem açıklanmaktadır. Burada, α-sinüklein mayada aşırı eksprese edildi ve vahşi tip α-sinükleinin fenotipleri ve PD'nin ailesel mutantları olarak bilinen üç α-sinüklein varyantı incelendi (Şekil 1 ve Malzeme Tablosu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsanlardaki çeşitli hücresel sistemlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, mayayı insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanmak avantajlıdır. İnsan beyninin karmaşık hücresel etkileşimlerini maya kullanarak araştırmak neredeyse imkansız olsa da, tek hücreli bir bakış açısıyla, maya hücreleri, genomik dizi homolojisi ve temel ökaryotik hücresel süreçler açısından insan hücrelerine yüksek düzeyde benzerliğe sahiptir 8,13. Dahası,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

James Bardwell ve Tiago F. Outeiro'ya α-sinüklein içeren plazmidleri nazikçe paylaştıkları için teşekkür ederiz. Changhan Lee, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF) (hibe 2021R1C1C1011690), Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı'ndan (hibe 2021R1A6A1A10044950) ve Ajou Üniversitesi'nin yeni fakülte araştırma fonundan fon aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
96 kuyulu plakaSPL30096
AgaroseTAESHIN0158
Bacto AgarBD Difco214010
Nefes almayı kolaylaştırançeşitlendirilmiş biyoteknolojiBEM-1Mikrotitre plakaları için gaz geçirgen sızdırmazlık membranı
kapak camlarıMarienfeld24 x 60 mm
Kültür tüpüSPL40014
Küvetratiolab2712120
D-(+)-GalaktozsigmaG0625
D-(+)-GlikozsigmaG8270
D-(+)-Rafinoz pentahidratDaejung6638-4105
Kuluçka makinesi (sallama)Labtronmodeli: SHI1
Kuluçka makinesi (statik)Vizyon bilimselModel: VS-1203PV-O
LiAcsigmaL6883
Mikroplaka okuyucuTecan30050303 01Model: Infinite 200 pro
çok kanallı pipet 20-200 ve mikro; LgilsonFA10011
çok kanallı pipet 2-20 & mikro; LgilsonFA10009
Olympus mikroskobuOlympusIX-53
PEGsigmaP4338ortalama mol ağırlık 3,350
PetridishSPL10090
pRS426Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Çok fonksiyonlu maya yüksek kopya sayılı mekik vektörleri. Gen. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein A30POuteiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein A53TOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein E46KOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein WTOuteiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
RezervuarSPL23050
Spektrofotometreeppendorf6131 05560
W303aJames Bardwell'den mevcut
Maya nitrojen bazı, amino asitler olmadanDifco291940
sigmaY1501
YPDCondalab1547.00
Urasil içermeyen maya sentetik bırakma ortamı takviyeleri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
  2. Surguchov, A. Intracellular dynamics of synucleins: "Here, there and everywhere". International Review of Cell and Molecular Biology. 320, 103-169 (2015).
  3. Soto, C., Pritzkow, S. Protein misfolding, aggregation, and conformational strains in neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1332-1340 (2018).
  4. Gordon, J., Amini, S. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 2311, 1-8 (2021).
  5. Dawson, T. M., Golde, T. E., Lagier-Tourenne, C. Animal models of neurodegenerative diseases. Nature Neuroscience. 21 (10), 1370-1379 (2018).
  6. Bassett, D. E., Boguski, M. S., Hieter, P. Yeast genes and human disease. Nature. 379 (6566), 589-590 (1996).
  7. Koteliansky, V., Glukhova, M., Bejanian, M., Surguchov, A., Smirnov, V. Isolation and characterization of actin-like protein from yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters. 102 (1), 55-58 (1979).
  8. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  9. Kachroo, A. H., Vandeloo, M., Greco, B. M., Abdullah, M. Humanized yeast to model human biology, disease and evolution. Disease Models & Mechanisms. 15 (6), (2022).
  10. Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast cells provide insight into alpha-synuclein biology and pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
  11. Dunham, M., Gartenberg, M., Brown, G. Methods in Yeast Genetics and Genomics. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Woodbury, New York. (2015).
  12. Skinner, S. O., Sepúlveda, L. A., Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nature Protocols. 8 (6), 1100-1113 (2013).
  13. Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration. Journal of Neurochemistry. 127 (4), 438-452 (2013).
  14. Nielsen, J. Yeast systems biology: Model organism and cell factory. Biotechnology Journal. 14 (9), 1800421(2019).
  15. Eleutherio, E., et al. Oxidative stress and aging: learning from yeast lessons. Fungal Biology. 122 (6), 514-525 (2018).
  16. Rencus-Lazar, S., DeRowe, Y., Adsi, H., Gazit, E., Laor, D. Yeast models for the study of amyloid-associated disorders and development of future therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 15(2019).
  17. Franco, R., Rivas-Santisteban, R., Navarro, G., Pinna, A., Reyes-Resina, I. Genes implicated in familial Parkinson's disease provide a dual picture of nigral dopaminergic neurodegeneration with mitochondria taking center stage. International Journal of Molecular Sciences. 22 (9), 4643(2021).
  18. Wan, O. W., Chung, K. K. The role of alpha-synuclein oligomerization and aggregation in cellular and animal models of Parkinson's disease. PLoS One. 7 (6), 38545(2012).
  19. Xu, L., Pu, J. Alpha-synuclein in Parkinson's disease: From pathogenetic dysfunction to potential clinical application. Parkinson's Disease. 2016, 1720621(2016).
  20. Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein α-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
  21. Sampson, T. R., et al. A gut bacterial amyloid promotes α-synuclein aggregation and motor impairment in mice. Elife. 9, 53111(2020).
  22. Evans, M. L., et al. The bacterial curli system possesses a potent and selective inhibitor of amyloid formation. Molecular Cell. 57 (3), 445-455 (2015).
  23. Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease models. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 194-208 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alpha Synuclein AggregationYeast ModelParkinson s DiseaseSynuclein ToxicityHumanized YeastProtein AggregationFluorescence MicroscopyWestern BlottingGenetic ScreeningSynaptic Vesicle Trafficking

İlgili makaleler