Parkinson hastalığının patogenezini incelemek ve anlamak için α-sinükleinin in vivo fizyolojik modeli gereklidir. İnsanlaştırılmış bir maya modeli kullanarak α-sinükleinin sitotoksisitesini ve agrega oluşumunu izlemek için bir yöntem tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Parkinson hastalığı ikinci en sık görülen nörodejeneratif hastalıktır ve yanlış katlanmış ve agrega olmuş α-sinüklein içeren Lewy cisimlerinin oluşumunun neden olduğu ilerleyici hücre ölümü ile karakterizedir. α-sinüklein, sinaptik vezikül kaçakçılığını düzenleyen bol miktarda presinaptik bir proteindir, ancak proteinli inklüzyonların birikmesi nörotoksisiteye neden olur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, bakteriyel şaperonlar da dahil olmak üzere çeşitli genetik faktörlerin, in vitro α-sinüklein agregalarının oluşumunu azaltabileceğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, bunu hastalar için potansiyel bir tedavi olarak uygulamak için hücredeki anti-agregasyon etkisini izlemek de önemlidir. Nöronal hücreleri kullanmak ideal olacaktır, ancak bu hücrelerin ele alınması zordur ve anti-agregasyon fenotipini sergilemek uzun zaman alır. Bu nedenle, in vivo anti-agregasyon aktivitesinin daha fazla değerlendirilmesi için hızlı ve etkili bir in vivo araç gereklidir. Burada açıklanan yöntem, insan α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya Saccharomyces cerevisiae'deki anti-agregasyon fenotipini izlemek ve analiz etmek için kullanılmıştır. Bu protokol, α-sinüklein kaynaklı hücresel toksisiteyi ve ayrıca hücrelerde α-sinüklein agregalarının oluşumunu izlemek için kullanılabilecek in vivo araçları göstermektedir.
Giriş
Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır1. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk2 olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri3 adı verilen amiloid agregala....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması
- Medya hazırlama
- YPD ortamını hazırlamak için, sterilizasyon için 1 L. Otoklav nihai hacmi yapmak üzere 50 g YPD tozunu dH2O'da çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
- YPD agar ortamı yapmak için, sterilizasyon için 50 g YPD tozu ve 20 g agar'ı 1 L dH2O. Otoklav içinde çözün. Soğuduktan sonra Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
- SC'yi rafinoz (SRd)-Ura ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfatla ve amino asitler olmadan sterilizasyon için 795 mL dH2O. Otoklav içinde çözün. Kullanmadan önce 100 mL% 20 rafinoz,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
α-sinükleinin yüksek ekspresyonunun, PD'nin model sistemlerinde nöronal hücre ölümü ve PD ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, α-sinükleinin sitotoksisitesini ve mayada agrega α-sinükleinin odak oluşumunu izlemek için üç yöntem açıklanmaktadır. Burada, α-sinüklein mayada aşırı eksprese edildi ve vahşi tip α-sinükleinin fenotipleri ve PD'nin ailesel mutantları olarak bilinen üç α-sinüklein varyantı incelendi (Şekil 1 ve Malzeme Tablosu).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İnsanlardaki çeşitli hücresel sistemlerin karmaşıklığı göz önüne alındığında, mayayı insan nörodejeneratif hastalıklarını incelemek için bir model olarak kullanmak avantajlıdır. İnsan beyninin karmaşık hücresel etkileşimlerini maya kullanarak araştırmak neredeyse imkansız olsa da, tek hücreli bir bakış açısıyla, maya hücreleri, genomik dizi homolojisi ve temel ökaryotik hücresel süreçler açısından insan hücrelerine yüksek düzeyde benzerliğe sahiptir 8,13. Dahası,.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
James Bardwell ve Tiago F. Outeiro'ya α-sinüklein içeren plazmidleri nazikçe paylaştıkları için teşekkür ederiz. Changhan Lee, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF) (hibe 2021R1C1C1011690), Eğitim Bakanlığı tarafından finanse edilen NMG aracılığıyla Temel Bilim Araştırma Programı'ndan (hibe 2021R1A6A1A10044950) ve Ajou Üniversitesi'nin yeni fakülte araştırma fonundan fon aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 kuyulu plaka | SPL | 30096 | |
| Agarose | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Nefes almayı kolaylaştıran | çeşitlendirilmiş biyoteknoloji | BEM-1 | Mikrotitre plakaları için gaz geçirgen sızdırmazlık membranı |
| kapak camları | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Kültür tüpü | SPL | 40014 | |
| Küvet | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galaktoz | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glikoz | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Rafinoz pentahidrat | Daejung | 6638-4105 | |
| Kuluçka makinesi (sallama) | Labtron | modeli: SHI1 | |
| Kuluçka makinesi (statik) | Vizyon bilimsel | Model: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Mikroplaka okuyucu | Tecan | 30050303 01 | Model: Infinite 200 pro |
| çok kanallı pipet 20-200 ve mikro; L | gilson | FA10011 | |
| çok kanallı pipet 2-20 & mikro; L | gilson | FA10009 | |
| Olympus mikroskobu | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | ortalama mol ağırlık 3,350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Çok fonksiyonlu maya yüksek kopya sayılı mekik vektörleri. Gen. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotör &alfa;-sinüklein WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Maya hücreleri, alfa-sinüklein biyolojisi ve patobiyolojisi hakkında bilgi sağlar. Bilim. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Rezervuar | SPL | 23050 | |
| Spektrofotometre | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | James Bardwell'den mevcut | ||
| Maya nitrojen bazı, amino asitler olmadan | Difco | 291940 | |
| sigma | Y1501 | ||
| YPD | Condalab | 1547.00 |
Kaynaklar
- Khurana, V., Lindquist, S. Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: Why cook with baker's yeast. Nature Reviews Neuroscience. 11 (6), 436-449 (2010).
- Surguchov, A. Intrac....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
