İnsanlaştırılmış Bir Maya Modeli Kullanarak α-Sinüklein Toksisitesini ve Agregasyonunu İncelemek İçin Bir Yöntem

Parkinson hastalığı (PH) tüm dünyada yaşlanan toplumlar için ciddi bir sorundur. α-sinükleinin agregasyonu PD ile yakından ilişkilidir ve α-sinükleinin protein agregaları, hastalığın teşhisi için moleküler bir biyobelirteç olarak yaygın olarak kullanılmaktadır¹. α-sinüklein, N-terminal lipit bağlayıcı α-sarmal, amiloid bağlayıcı merkezi alan (NAC) ve C-terminal asidik kuyruk² olmak üzere üç alana sahip küçük bir asidik proteindir (140 amino asit uzunluğunda). α-sinükleinin yanlış katlanması kendiliğinden ortaya çıkabilir ve sonunda Lewy cisimleri³ adı verilen amiloid agregalarının oluşumuna yol açar. α-sinüklein, PD'nin patogenezine çeşitli şekillerde katkıda bulunabilir. Genel olarak, protofibriller adı verilen anormal, çözünür oligomerik formlarının, sinaptik fonksiyon³ de dahil olmak üzere çeşitli hücresel hedefleri etkileyerek nöronal hücre ölümüne neden olan toksik türler olduğu düşünülmektedir.

Nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanılan biyolojik modeller, genomları ve hücresel biyolojileri açısından insanlarla ilgili olmalıdır. En iyi modeller insan nöronal hücre hatları olacaktır. Bununla birlikte, bu hücre hatları, kültürlerin bakımındaki zorluklar, düşük transfeksiyon verimliliği ve yüksek masraf⁴ gibi çeşitli teknik sorunlarla ilişkilidir. Bu nedenlerle, bu araştırma alanındaki ilerlemeyi hızlandırmak için kolay ve güvenilir bir araç gereklidir. Önemli olarak, toplanan verileri analiz etmek için aracın kullanımı kolay olmalıdır. Bu perspektiflerden, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Danio rerio, maya ve kemirgenler⁵ dahil olmak üzere çeşitli model organizmalar yaygın olarak kullanılmıştır. Bunlar arasında maya en iyi model organizmadır, çünkü genetik manipülasyon kolaydır ve diğer model organizmalardan daha ucuzdur. En önemlisi, maya, insan ortologlarına% 60 dizi homolojisi ve% 25 insan hastalığına^{bağlı genlerle} yakın homoloji 6 gibi insan hücrelerine yüksek benzerliklere sahiptir ve ayrıca temel ökaryotik hücre biyolojisini paylaşırlar. Maya, insan hücrelerindekilere benzer dizilere ve benzer işlevlere sahip birçok protein içerir⁷. Gerçekten de, insan genlerini ifade eden maya, hücresel süreçleri aydınlatmak için model bir sistem olarak yaygın olarak kullanılmıştır⁸. Bu maya suşu insanlaştırılmış maya olarak adlandırılır ve insan genlerinin işlevini keşfetmek için yararlı bir araçtır⁹. İnsanlaştırılmış maya, genetik etkileşimleri incelemek için değerlidir, çünkü genetik manipülasyon mayada iyi kurulmuştur.

Bu çalışmada, Saccharomyces cerevisiae mayasını PD'nin patogenezini incelemek, özellikle α-sinüklein agrega oluşumunu ve sitotoksisiteyi araştırmak için model organizma olarak kullandık¹⁰. Tomurcuklanan mayada α-sinükleinin ekspresyonu için, W303a suşu, α-sinükleinin vahşi tip ve ailesel PD ile ilişkili varyantlarını kodlayan plazmidlerle transformasyon için kullanılmıştır. W303a suşu URA3 üzerinde oksotrofik bir mutasyona sahip olduğundan, URA3 ile plazmidler içeren hücrelerin seçimi için geçerlidir. Bir plazmidde kodlanmış α-sinüklein ekspresyonu, GAL1 promotörü altında düzenlenir. Böylece, α-sinükleinin ekspresyon seviyesi kontrol edilebilir. Ek olarak, yeşil floresan proteinin (GFP) α-sinükleinin C-terminal bölgesinde füzyonu, α-sinüklein odaklarının oluşumunun izlenmesini sağlar. α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantlarının özelliklerini anlamak için, bu varyantları mayada da ifade ettik ve hücresel etkilerini inceledik. Bu sistem, α-sinükleinin sitotoksisitesine karşı koruyucu rol oynayan bileşikleri veya genleri taramak için basit bir araçtır.

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

1. Medya hazırlama
   1. YPD ortamını hazırlamak için, sterilizasyon için 1 L. Otoklav nihai hacmi yapmak üzere 50 g YPD tozunu dH₂O'da çözün. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.
   2. YPD agar ortamı yapmak için, sterilizasyon için 50 g YPD tozu ve 20 g agar'ı 1 L dH₂O. Otoklav içinde çözün. Soğuduktan sonra Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
   3. SC'yi rafinoz (SRd)-Ura ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfatla ve amino asitler olmadan sterilizasyon için 795 mL dH₂O. Otoklav içinde çözün. Kullanmadan önce 100 mL% 20 rafinoz, 5 mL% 20 glikoz ve 100 mL 10x -Ura bırakma ekleyin.
   4. SD-Ura agar ortamını yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfat ile ve amino asitler olmadan ve 20 g agar'ı 800 mL dH 2 O. Otoklav içinde₂L'nin üzerinde hacimli bir şişede çözün. İyice karıştırın ve Petri yemeklerinin üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
   5. SC'yi galaktoz (SG)-Ura agar ortamı ile yapmak için, 6.7 g maya azot bazını amonyum sülfat ile ve amino asitler olmadan ve 20 g agar'ı 800 mL dH 2 O. Otoklav içinde₂L'nin üzerinde hacimli bir şişede çözün. İyice karıştırın ve Petri bulaşıklarının üzerine dökün. 4 °C'de saklayın.
2. SD medya ile kullanılacak stok çözümleri
   1. % 20'lik bir karbon kaynağı (glikoz, galaktoz ve rafinoz) yapmak için, 500 mL'lik bir son hacim yapmak için dH₂O'da 100 g glikoz, galaktoz veya rafinoz çözün. RT'de otoklav ve mağaza.
   2. Urasilsiz 10x maya sentetik bırakma orta takviyeleri yapmak için (10x-Ura bırakma), 19.2 g "urasilsiz maya sentetik bırakma orta takviyeleri" ni dH₂O'da çözün ve 1 L. Otoklav son hacmini yapın ve RT'de saklayın.
      NOT: Agar içeren bir ortamın hazırlanması için, Petri kaplarına dökmeden önce tüm çözeltileri iyice karıştırmak için şişeye manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.

2. Maya dönüşümü

NOT: pRS426 plazmid, α-sinüklein genini klonlamak için kullanıldı ve seçilebilir bir belirteç olarak URA3 genini içeriyordu. Ciddi hastalık fenotiplerine (örneğin, sitotoksisite) sahip olan α-sinükleinin ailesel PD ile ilişkili varyantları vardır. Bu varyantlar burada sitotoksisitelerini ve agrega odakları oluşumunu izlemek için de kullanılmıştır. Tutarlı sonuçlar elde etmek için tüm deneyler için aynı maya dönüştürücü kolonisini kullanın.

1. Maya ekspresyon plazmidlerinin transformasyonu için, kontrol ve α-sinüklein içeren plazmidler olarak boş bir vektör (pRS426) kullanın. Standart lityum asetat (LiAc) yöntemi^11'e atıfta bulunarak, altı yetkin hücre ve her plazmidin 0.5 μg'sini hazırlayın ve dönüşümü gerçekleştirin.
2. Plazmidler içeren maya dönüştürücüleri seçmek için, urasilsiz (SD-Ura) sentetik tanımlı ortamı (SD ortam) kullanın ve plakaları 2-3 gün boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
3. Daha ileri deneyler için plazmid içeren hücrelerin seçimi için üç tek koloni bir SD-Ura agar plakasına yama yapın.
   NOT: Doğru ve güvenilir sonuçlar elde etmek için, suş başına en az üç biyolojik kopyayı inceledik.

3. Tespit testi

NOT: GFP etiketli α-sinükleinin yüksek kopya numaralı plazmidlerde ekspresyonunun, maya^10'daki sitotoksisite ile ilişkili olduğu bilinmektedir.

1. GAL1 promotörü ve% 0.1 glikoz altında α-sinükleinin indüksiyonunun inhibisyonu için% 2 rafinoz ile plazmidleri içeren mayanın seçici büyümesi için suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın. Hücre kültürünü 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de inkübe edin.
   NOT: Tüm deneylerin farklı kolonilerle tekrarlanması önemlidir. Aynı sonuçların üçten fazla bağımsız koloniden elde edilmesi, sonucun güvenilir olduğu anlamına gelir.
2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 3 mL taze SRd-Ura'ya 0.2'lik bir OD 600'e aşılayın ve₂₀₀ rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
3. OD₆₀₀ 0.6-0.8'e ulaştığında, lekelenme testi için hücreleri 96 delikli plakalarda aşağıdaki gibi seyreltin.
   1. Tüm numunelerin OD 600'ünü ölçün ve her kültürdeki hücre sayısını eşitlemek için numuneleri₉₆ delikli bir plakanın 1. şeridinde steril dH₂O (karışık hacim 100 μL) ile 0,5 OD_600'e seyreltin.
   2. Sonraki beş şeride 160 μL steril dH₂O ekleyerek maya hücrelerinin beş kat seri seyreltilmesini gerçekleştirin. Her şeritteki hücreleri seri olarak seyreltirken toplam 40 μL hacim sağlayın.
      NOT: Düşük seyreltme faktörleri, numuneler arasında daha büyük farklılıklar yaratabilir. Seri seyreltmeler gerçekleştirilirken homojen karıştırma sağlamak için yeterli pipetleme gereklidir. Pipet ucu her seyreltme noktasında değiştirilmelidir. Aksi takdirde, ucun yüzeyine tutturulmuş hücreler bir sonraki kuyucuğa aktarılabilir ve hücre sayısını etkileyebilir.
4. Kontroller için SD-Ura agar plakalarındaki numuneleri ve toksisiteyi izlemek için SG-Ura agar plakalarındaki numuneleri tespit etmek üzere her bir kuyucuktan 10 μL aktarmak için çok kanallı bir pipet kullanın.
   NOT: Benekli numuneler plakalara tamamen emilene kadar plakalar kurutulmalıdır.
5. Benekli plakaları 4 gün boyunca 30 ° C'de baş aşağı inkübe edin.
6. 4. güne kadar her 24 saatte bir plakaların görüntülerini alın ve ardından gözle tespit edilen suşlar arasındaki büyüme farklılıklarını karşılaştırarak verileri analiz edin. En seyreltilmiş numunedeki bireysel kolonileri sayın, her bir suş için orijinal kültürdeki canlı hücrelerin sayısını hesaplayın veya tek kolonilerin boyutunu karşılaştırın.

4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak maya büyümesinin ölçülmesi

1. Suş başına üç yamalı maya dönüştürücüsünü 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın ve gece boyunca 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de inkübe edin.
   NOT: α-sinükleini ifade eden insanlaştırılmış maya suşunun her koloni fenotipini anlamak için, tüm deneyler için aynı dönüştürücüleri kullanın.
2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda toplam 200 μL taze SD-Ura ve SG-Ura'ya aşılayın. Hücreler de dahil olmak üzere son ses seviyesini 200 μL'ye ayarlayın ve başlangıç hücresi OD_600'ü 0,05'e ayarlayın.
   1. Mikrotitre plakasındaki Program ayarlarını aşağıdaki gibi yapın: hedef sıcaklığı 30 ° C'ye ayarlayın, sarsıntı (Doğrusal) süresini 890 s'ye ayarlayın, sarsıntı (Doğrusal) genliğini 5 mm'ye ayarlayın, aralık süresini 00:15:00'e ayarlayın ve ölçümü 600 nm emici olarak ayarlayın.
   2. Tüm suşların bir mikroplaka okuyucuda sabit faza ulaşması için plakayı 2-3 gün boyunca inkübe edin.
3. Büyüme eğrisini çizerek verileri analiz edin (örneğin, Çalışma Kitabı'nı kullanarak). Üç biyolojik kopyadan absorbans değerlerinin ortalamasını alarak veri noktalarını elde edin ve hata çubuklarını belirtin. Kontrol olarak yalnızca ortamdan absorbans değerini kullanın ve bunu kültürlenmiş hücrelerden alınan değerlerden çıkarın (isteğe bağlı).

5. Floresan mikroskobu

1. Yamalı maya dönüştürücülerini 3 mL SRd-Ura'ya aşılayın ve 200 rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de gece boyunca kültürleyin.
   NOT: Fenotipin sitotoksisite ve odak oluşumu ile korelasyonunu belirlemek için, deney için aynı kolonileri kullanın.
2. Ertesi gün, gece kültürlenmiş hücreleri 3 mL taze SRd-Ura'ya 0.003'lük bir OD_600'e yeniden aşılayın. OD_{600, 200} rpm'de (~ 18 saat) ajitasyon altında 30 ° C'de 0,2'ye ulaşana kadar kültürü inkübe edin.
3. 0.2'lik bir OD 600 elde edildiğinde, 300 μL% 20 galaktoz ekleyin ve daha sonra₂₀₀ rpm'de ajitasyon altında 30 ° C'de 6 saat daha inkübe edin.
4. Hücreleri 5 dakika boyunca 800 x g'de santrifüjleme ile toplayın ve süpernatanı atın.
5. Hücre peletini 30 μL damıtılmış suda nazikçe yeniden askıya alın.
6. Askıya alınan hücrelerin 5 μL'sini bir sürgülü cama yükleyin. Bir agaroz jel ped¹² hazırlayın ve eşit şekilde yayılmasını sağlamak için yüklü hücrelere koyun.
7. Hem parlak alan hem de GFP-floresan filtreleri kullanarak 100x objektifle mikroskobik görüntüleme gerçekleştirin.
   1. İlk olarak, daldırma yağı kullanarak hücreyi 100x hedefle odaklamak için brightfield kullanın. Programı kullanarak görüntüleri oluşturmak için ekran yakalama seçeneğini kullanın.
   2. GFP-floresan filtresine geçin. Sinyal-parazit oranını dengeleyerek net bir görüntü elde etmek için görüntü pozlama süresini 50 ms ile 300 ms arasında ayarlayın. Ekran programı kullanarak görüntüyü yakalar .
   3. Birçok hücreyi tek bir noktadan ziyade birden fazla noktadan görüntüleyin.
8. Analitik yazılım kullanarak α-sinüklein agregalarının odaklarını içeren hücrelerin yüzdesini sayarak görüntüleri analiz edin. Çözünür GFP protein sinyali ile odaklar tarafından oluşturulan GFP sinyali arasındaki farkları ve GFP'nin α-sinükleinin A30P varyant formu ile difüzyonunu gözlemleyin.
   NOT: Odaklar oluşumu, α-sinükleinin vahşi tip, E46K ve A53T varyantları ile gözlenecektir.

α-sinükleinin yüksek ekspresyonunun, PD'nin model sistemlerinde nöronal hücre ölümü ve PD ile bağlantılı olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada, α-sinükleinin sitotoksisitesini ve mayada agrega α-sinükleinin odak oluşumunu izlemek için üç yöntem açıklanmaktadır. Burada, α-sinüklein mayada aşırı eksprese edildi ve vahşi tip α-sinükleinin fenotipleri ve PD'nin ailesel mutantları olarak bilinen üç α-sinüklein varyantı incelendi (Şekil 1 ve Malzeme Tablosu).

pRS426 vektöründeki GAL1 promotörü altındaki α-sinüklein ekspresyonu, indükleyici olarak galaktoz içeren agar plakasında önemli büyüme geriliği gösterdi (Şekil 2). α-sinüklein ekspresyonuna göre büyümedeki fark sıvı kültürlerde de gözlenmiştir (Şekil 3). Her iki kültür koşulunda da, vahşi tip α-sinüklein ve E46K veya A53T mutasyonlu varyantlar, α-sinüklein toksisitesine bağlı büyüme kusurları göstermiştir. Bununla birlikte, agrega oluşturmayan α-sinüklein A30P varyantı, toksik olmayan bir fenotip göstermiştir.

Sitotoksisite ile α-sinükleinin agregasyonu arasındaki ilişkiyi anlamak için, mayadaki α-sinükleinin durumunu izlemek için bir yöntem gereklidir. α-sinüklein, floresan mikroskobu kullanarak GFP sinyalini tespit ederek canlı maya hücrelerinde α-sinükleinin durumunu izlemek için C-terminusunda bir GFP proteini tarafından etiketlendi. Şiddetli sitotoksisite sergileyen suşlar, α-sinüklein agregalarının odaklarını gösterdi, ancak A30P varyantında, hücreler boyunca daha az toksik bir α-sinüklein formu yayıldı (Şekil 4).

Şekil 1: α-sinüklein alanları ve bu çalışmada kullanılan yapılar . (A) İnsan α-sinükleinin yapısı üç ayrı alanla - N-terminal alanı, NAC alanı ve C-terminal alanı. Amino asit kalıntıları altta belirtilmiştir. Turuncu çizgiler mutasyona uğramış bölgeleri gösterir. (B) Bu çalışmada kullanılan rekombinant plazmid yapıları. pRS426 plazmid omurga olarak kullanıldı. α-sinüklein, C-terminusunda bir GFP etiketi ile kaynaştırıldı ve ifadesi GAL1 promotörü tarafından kontrol edildi. Kısaltmalar: NAC = amiloid olmayan β bileşen; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mayada yüksek kopya sayısı plazmidlerinin ekspresyonu nedeniyle agar üzerinde α-sinükleinin sitotoksisitesi. pRS426 plazmidlerinde GAL1 güdümlü α-sinüklein-GFP varyantlarını eksprese eden maya hücreleri,% 2 glikoz veya% 2 galaktoz içeren seçici bir maya ortamında beş kat seyreltmede tespit edildi. Hücreler 30 ° C'de 3 gün boyunca inkübe edildi ve plakalar fotoğraflandı. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; EV = boş vektör; WT = vahşi tip; α-Syn = α-sinüklein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mayada yüksek kopya sayısı plazmidlerinin ekspresyonu nedeniyle sıvı ortamda α-sinükleinin sitotoksisitesi. GAL1 güdümlü α-sinüklein-GFP varyantlarını eksprese eden maya hücreleri, 2 gün boyunca 30 ° C'de 96 delikli bir plakada sıvı ortamda kültürlendi ve büyüme bir mikroplaka okuyucu kullanılarak izlendi. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; EV = boş vektör; WT = vahşi tip; α-Syn = α-sinüklein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: α-sinüklein-GFP'yi eksprese eden maya hücrelerinin floresan mikroskopisi ile analizi. α-sinüklein-GFP varyantları, galaktoz eklenerek ve 6 saat boyunca inkübe edilerek indüklendi. α-sinüklein-GFP'nin doğrulanması floresan mikroskobu ile yapıldı. Ölçek çubuğu = 10 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; EV = boş vektör; WT = vahşi tip; α-Syn = α-sinüklein. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İnsanlaştırılmış maya kullanarak sitotoksisiteyi ve α-sinükleinin agrega oluşumunu ölçmek için bu yöntemin özeti. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.