Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Pankaj Chandley; Priyanka Subba; Soma Rohatgi

doi:10.3791/64425

Yöntem makalesi

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

DOI:

10.3791/64425

⸱

16 Eylül 2022

Pankaj Chandley^*¹ , Priyanka Subba^*¹ , Soma Rohatgi¹

¹Department of Biosciences and Bioengineering, Indian Institute of Technology Roorkee

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida türleri sistemik hastane enfeksiyonlarının dördüncü en yaygın nedenidir. Sistemik veya invaziv kandidiyazis sıklıkla implante edilen cihazlarda veya kateterlerde biyofilm oluşumunu içerir ve bu da artmış virülans ve mortalite ile ilişkilidir. Farklı Candida türleri tarafından üretilen biyofilmler, çeşitli antifungal ilaçlara karşı gelişmiş direnç gösterir. Bu nedenle, Candida biyofilmlerine karşı etkili immünoterapiler veya yardımcı tedaviler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Hücresel bağışıklığın rolü anti-Candida korumasında iyi kurulmuş olsa da, humoral bağışıklığın rolü daha az çalışılmıştır.

Biyofilm oluşumunun ve olgunlaşmasının inhibisyonunun koruyucu antikorların ana işlevlerinden biri olduğu ve Candida albicans germ tüpü antikorlarının (CAGTA) daha önce C. albicans'ın in vitro büyümesini ve biyofilm oluşumunu baskıladığı gösterilmiştir. Bu yazıda, antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki rolünü değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir. Bu protokolün metodolojisi, 96 kuyucuklu mikrotitre plakalarında C. tropicalis biyofilm oluşumunu içerir, bunlar daha sonra antijene özgü antikorların varlığında veya yokluğunda inkübe edilir, ardından biyofilmdeki mantar hücrelerinin metabolik aktivitesini ölçmek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanilid-2H-tetrazolyum (XTT) testi yapılır.

Özgüllük, Sap2'ye özgü antikor tükenmiş serum da dahil olmak üzere uygun serum kontrolleri kullanılarak doğrulandı. Sonuçlar, bağışıklanmış hayvanların serumunda bulunan antikorların in vitro Candida biyofilm olgunlaşmasını inhibe edebileceğini göstermektedir. Özetle, bu yazıda invaziv kandidiyazis sırasında biyofilmlere karşı yeni immünoterapiler ve sinerjik veya yardımcı tedaviler geliştirmede antikorların potansiyeli hakkında önemli bilgiler verilmektedir. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sistemik kandidiyazis, tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkili olan hastane enfeksiyonlarının dördüncü majör nedenidir. Küresel olarak, sistemik kandidiyaz yaklaşık 700.000 kişiyi etkilemektedir¹. Candida türleri, yani C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata ve C. auris, invaziv Candida enfeksiyonlarının en yaygın nedenidir². Candida türleri, biyofilm üreten fırsatçı patojenlerdir³. Biyofilmler ağırlıklı olarak Candida virülansı ile ilişkilidir ve Candida, biyofilm oluşumunu in....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BALB / c fareleri, IIT Roorkee'deki Küçük Hayvan Tesisi'nde barındırıldı. Tüm hayvanlar 25 ° C'de 12 saat: 12 saat aydınlık: karanlık döngüde tutuldu ve bir pelet diyeti ve su ad libitum ile sağlandı. Tüm hayvan prosedürleri, IIT Roorkee'nin Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC) tarafından onaylanmıştır.

1. C. tropicalis'in hazırlanması

NOT: Candida tropicalis mantarı Risk Grubu 2 patojenlerine aittir ve BSL2 mikroorganizması olarak sınıflandırılır. Candida türleriyle çalışırken her zaman sertifikalı Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabinleri kullanın. C. tropical....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida tropicalis biyofilmleri 96 kuyucuklu mikrotiter plakalarda yetiştirildi ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te görüntülendi (Şekil 1A). Biyofilm kristal menekşe kullanılarak daha da boyandı ve ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak 40x'te gözlendi (Şekil 1B). Taramalı elektron mikroskobu, C. tropicalis biyofilminin temsili bir görüntüsünü göstermektedir (Şekil 1C). Biyofilm inhibisyon testin.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida türlerinin neden olduğu mantar enfeksiyonları tüm dünyada yüksek morbidite ve mortalite oranları ile ilişkilidir. İnvaziv mantar enfeksiyonunun artan tehdidi, hayatı tehdit eden bu tür hastalıkların erken yönetimini gerektirir. Çoğu Candida enfeksiyonu, çeşitli tıbbi cihazlara yapışan ve hastane ortamlarında mantar enfeksiyonlarının kalıcılığından ve nüksünden sorumlu olan biyofilmlerin oluşumunu içerir³¹. Biyofilmler maya veya hifal hücrelerinden oluşur ve geleneksel ant.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ramalingaswami hibesi DBT-843-BIO (Hindistan Hükümeti Biyoteknoloji Bölümü) ve Erken Kariyer Araştırma Ödülü SER-1058-BIO (Bilim ve Mühendislik Araştırma Kurulu, Hindistan Hükümeti) tarafından S.R.'ye desteklenmiştir. Yazarlar, PS'ye ICMR-JRF hibesini ve PS'ye DBT-JRF hibesini kabul etmektedir. Yazarlar, Dr. Ravikant Ranjan'a, SEM sırasında Pradeep Singh Thakur'un el yazması ve teknik yardımı hakkındaki önerileri için teşekkür eder.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik santrifüj tüpleri	BD Falcon	546021
1x PBS-Laboratuvarda		hazırlanmış	NaCl : 4 g KCl: 0.1 g Na_{2_{HPO₄: 0.72 g KH₂PO₄ : 0.12 g Su 500 mL. PH'ı 7,4'e ayarlayın}}
50 mL konik santrifüj tüpleri	BD Falcon	546041
96 oyuklu mikrotitre plakaları	Nunc	442404
İnkübatörü	Jenerik
Menadione	Sigma	M5625
Mikrotitre Plaka Okuyucu	Jenerik Çok
kanallı pipet ve uçlar	Jenerik
Petri kapları	Tarson	460090
Ringers Laktat-Laboratuvarda		hazırlanmış	sodyum klorür 0.6 g sodyum laktat 0.312 g potasyum klorür 0.035 g kalsiyum klorür 0.027 g Su 100 mL. pH 7.0 'ye ayarlayın;
RPMI 1640 MOPS	Himedia	AT180
Sabouraud dekstroz Agar	SRL	24613
Sabouraud dekstroz Et suyu	SRL	24835
XTT	Canlandırıcı	X6493

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Pri....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Candida Biyofilmleri Antikor nhibisyonu XTT Analizi Biyofilm Olu umu Antifungal Ajanlar Serum Kontrolleri Mikrotiter Plaka Biyofilm Olgunla mas A Adaylar

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler