Yöntem makalesi

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

DOI:

10.3791/64428

⸱

16 Eylül 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinde ve bitkilerinde, modifiye askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak bilinir) kullanan yakınlık etiketleme (PL) yaklaşımlarının, protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) tanımlamada başarılı olduğu kanıtlanmıştır. BioID'nin revize edilmiş bir versiyonu olan APEX, BioID ve TurboID, değerli teknolojiler olmalarının yanı sıra bazı kısıtlamalara sahiptir. Protein-protein etkileşimlerinde yakınlık tanımlaması için BioID'nin yeni bir versiyonu olan yakın zamanda geliştirilen AirID, bu kısıtlamaların üstesinden geldi. Daha önce, AirID hayvan modellerinde kullanılmışken, mevcut çalışma AirID'nin bitkilerde kullanıldığını göstermektedir ve sonuçlar, AirID'nin bitki sistemlerinde, protein etiketlemesi için BioID ve TurboID gibi diğer PL enzimlerine kıyasla daha iyi performans gösterdiğini doğrulamıştır. İşte model olarak AT4G18020 (APRR2) proteini kullanarak protein etkileşim ortaklarını belirlemek için adım adım bir protokol. Yöntemler, vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla yapının dönüşümünü, biyotin dönüşümünü, proteinlerin ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin zenginleştirilmesini tanımlar. Sonuçlar, AirID'nin bitkilerdeki ÜFE'leri analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varmıştır. Yöntem, bitkilerdeki diğer proteinleri incelemek için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli hücresel proteinler biyolojik olarak düzenleyici sistem altında çalışır ve protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) bu sistemin bir parçasıdır ve birçok hücresel sürecin temelidir. ÜFE'lerin yanı sıra, doğal proteinlerin işlevi, kompleks oluşumu, ubikitinasyon ve fosforilasyon gibi çeşitli modifikasyonlar yoluyla translasyon sonrası olarak desteklenir. Bu nedenle, ÜFE'leri incelemek, hedef proteinlerin olası işlevini anlamak için önemlidir. PPI'lar, immünopresipitasyon sonrası kütle spektrometrisi analizi (IP-MS analizi)1, maya iki hibrit sistemi (Y2H)2 ve ayrıca hücresiz tabanlı diziler....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bitki materyalinin hazırlanması

  1. Deneysel analiz için Cucumis sativus (Salatalık) kullanılır. Tohumları suya koyun, 50 °C'de 20 dakika inkübe edin ve ardından tohumları 12-16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına koyun.
  2. Daha sonra, tohumları toprak içeren saksılara aktarın (ticari olarak satın alınır) ve 23 ° C sıcaklıkta ve 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta bir iklim odasında büyütün.
  3. Başarılı bir agroinfiltrasyon için bitkileri 3 veya 4 yaprak aşamasına ulaşana kadar 3-4 hafta iklim odasında tutun.

2. AirID yapısının yapılması

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki araştırmalara göre, salatalık geni APRR2 , beyaz olgunlaşmamış meyve rengini kontrol eden aday gendir8. Burada, salatalıkta APRR2'nin etkileşimli ortak proteinini bulmak için yakınlık etiketleme enzimi olarak AirID kullanılarak bir protokol geliştirildi. Yapı salatalık yapraklarına aktarıldı ve infiltrasyondan 36 saat sonra biyotin aktarıldı. 48 saat sonra, başarılı dönüşümü doğrulamak için western blot analizi için örnekler alındı. Proteinler, western blot protokolünde yu.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut deneyde, Kido ve ark. büyük bir genom veri seti ve beş geleneksel BirA enzimi5 kullanarak atalardan kalma enzim rekonstrüksiyonu algoritması aracılığıyla geliştirdi. Rastgele mutasyonlar dinamik dizi değişiklikleri üretemediğinden, geleneksel evrimsel protein mühendisliğindeaktivite 9,10'u geliştirmek için rastgele mutasyonlar kullanıldı. Diğer PL enzimleriyle karşılaştırıldığında, AirID'nin çeşitli avantajları vardır. Daha önce bu .......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32000197 - X.H.), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'ndan Özel Mali Hibe (Hibe No. 2019T120467 - KH) tarafından desteklenmiştir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetosiringonPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdS1519
Akrilik / Bis% 30 çözeltiSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarosetsingke (Şangay) Co.LtdTSJ001
Amonyum bikarbonatSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd
BiotinBBI yaşam BilimleriG908BA0012
CaCl2BBI yaşam BilimleriE209BA0008
Yetkili hücreler GV3101Mevcut deneyde
Tuzdan arındırma sütunuTermo bilimselWC321753
Deoksikolik asitSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd
DH5 & alfa; yetkin hücrelerMevcut deneydeE.coli DH5 & alpha;
β-D-maltosidePekin Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Şangay) Co.LtdE104BA0029
GlisinSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd161BA0031
HEPESPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Şangay) Co.LtdH209BA0003
MESPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp / MERCK kgAa Darmstadt, Germenay3429963Hızlı filtrasyon malzeme filtresi
MgCl2< / sub>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd H324BA0003
NP40Sangon Biotech (Şangay) Co.LtdN8030
Protein inhibitörü kokteyliBeijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD
SDSBeijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Şangay) Co.LtdS9430
Streptavidin-C1-konjuge manyetik boncuklarZenginleştirici Biyoteknoloji7E511E1Manyetik boncuklar
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Şangay) Co.LtdGB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Şangay) Co.LtdF828BA0020
TriptonTermo bilimselLP0042
G313BA0018yapılmıştırG818BA0029 yapılan 5820172

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
  2. Zhao, S., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AirID Yak nl k EtiketlemesiBitki Proteini EtiketlemesiBiyotinize Protein Zenginle tirmeStreptavidin Manyetik BoncuklarAgroinfiltrasyon Tekni iWestern Blot AnaliziLCMS MS AnaliziAfinite TemizlemeSalatal k Proteini Ekstraksiyonu

İlgili makaleler