Yöntem makalesi

Bitkilerde protein-protein etkileşimi için AirID tabanlı yakınlık etiketlemesi

DOI:

10.3791/64428

⸱

16 Eylül 2022

 ,  ,  ,  , 
1College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, model olarak AT4G18020 (APRR2)-AirID proteini kullanarak salatalıkta (Cucumis sativus L.) yakınlık etiketleme (PL) deneyini gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sunuyoruz. Yöntem, bir vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla bir yapının dönüşümünü, biyotin infiltrasyonunu, protein ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin saflaştırılmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinde ve bitkilerinde, modifiye askorbat peroksidaz (APEX) veya Escherichia coli biotin ligaz BirA (BioID olarak bilinir) kullanan yakınlık etiketleme (PL) yaklaşımlarının, protein-protein etkileşimlerini (PPI'ler) tanımlamada başarılı olduğu kanıtlanmıştır. BioID'nin revize edilmiş bir versiyonu olan APEX, BioID ve TurboID, değerli teknolojiler olmalarının yanı sıra bazı kısıtlamalara sahiptir. Protein-protein etkileşimlerinde yakınlık tanımlaması için BioID'nin yeni bir versiyonu olan yakın zamanda geliştirilen AirID, bu kısıtlamaların üstesinden geldi. Daha önce, AirID hayvan modellerinde kullanılmışken, mevcut çalışma AirID'nin bitkilerde kullanıldığını göstermektedir ve sonuçlar, AirID'nin bitki sistemlerinde, protein etiketlemesi için BioID ve TurboID gibi diğer PL enzimlerine kıyasla daha iyi performans gösterdiğini doğrulamıştır. İşte model olarak AT4G18020 (APRR2) proteini kullanarak protein etkileşim ortaklarını belirlemek için adım adım bir protokol. Yöntemler, vektörün inşasını, agroinfiltrasyon yoluyla yapının dönüşümünü, biyotin dönüşümünü, proteinlerin ekstraksiyonunu ve afinite saflaştırma tekniği ile biyotin etiketli proteinlerin zenginleştirilmesini tanımlar. Sonuçlar, AirID'nin bitkilerdeki ÜFE'leri analiz etmek için yeni ve ideal bir enzim olduğu sonucuna varmıştır. Yöntem, bitkilerdeki diğer proteinleri incelemek için uygulanabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çeşitli hücresel proteinler biyolojik olarak düzenleyici sistem altında çalışır ve protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) bu sistemin bir parçasıdır ve birçok hücresel sürecin temelidir. ÜFE'lerin yanı sıra, doğal proteinlerin işlevi, kompleks oluşumu, ubikitinasyon ve fosforilasyon gibi çeşitli modifikasyonlar yoluyla translasyon sonrası olarak desteklenir. Bu nedenle, ÜFE'leri incelemek, hedef proteinlerin olası işlevini anlamak için önemlidir. PPI'lar, immünopresipitasyon sonrası kütle spektrometrisi analizi (IP-MS analizi)1, maya iki hibrit sistemi (Y2H)2 ve ayrıca hücresiz tabanlı diziler3 gibi çeşitli teknolojiler kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu yöntemler, araştırma alanındaki çeşitli hayati bulguları araştırdı. Ancak bu yöntemlerin bazı sakıncaları vardır; örneğin, Y2H, hedef türün Y2H kitaplığını oluşturmayı gerektiren zaman alıcı, pahalı bir stratejidir.

Ek olarak, Y2H tekniği, daha yüksek ökaryotik hücrelerin hücresel durumunu doğru bir şekilde yansıtamayan heterolog tek hücreli ökaryotik bir organizma olan mayayı kullanır. IP-MS, yüksek hidrofobikliğe sahip proteinler için uygun değildir ve zayıf ÜFE'leri yakalamada düşük verimlilik gösterir. Bitkilerde nükleotid bağlama alanı ve lösin açısından zengin tekrar içeren (NLR) proteinler ve reseptör benzeri kinazlar (RLK'ler) gibi çeşitli temel proteinler düşük bir seviyede eksprese edilir ve çoğunlukla diğer proteinlerle geçici olarak etkileşime girer; Bu nedenle, bu yöntemlerin kullanılması, bu proteinlerin düzenlenmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için yetersizdir3.

Yakınlık biyotinilasyonu (PB) adı verilen yeni bir teknik, araştırmacıların ÜFE'leri tanımlamasına yardımcı olur. PB, ilgilenilen proteine (POI) bağlanan PL enzimlerine bağlıdır ve ortak protein POI'ye yaklaştığında, PL, ortak proteine kimyasal bir biyotin etiketi ekler. Ayrıca, etiketli protein tanımlanabilir ve hangi ortak proteinin hedef proteine5 bağlandığını hızlı bir şekilde bilebilir. Önceki çalışmalar, BioID ve TurboID'nin özellikle bitkilerde ÜFE'ler için başarılı araçlar olduğunu kanıtladı, ancak belirli sınırlamaları var4. BioID, ortak proteinleri etiketlemek için yüksek düzeyde biyotine ihtiyaç duyar ve bu da 16 saatten fazla sürer. BioID ile karşılaştırıldığında, TurboID, proteini 10 dakikada etiketlediği ve ortak proteini oda sıcaklığında (RT) etiketleyebildiği için daha faydalıdır. Aynı zamanda belirli koşullarda hücreler için toksiktir ve ilgilenilen protein ile etkileşim göstermeyen proteinleri etiketler.

Bu sorunların üstesinden gelmek için, Kido ve arkadaşları tarafından geliştirilen AirID, BioID ve AirID5 arasındaki dizi benzerliği% 82 olmasına rağmen, etiketleme enzimlerinin geri kalanından daha verimlidir. AirID'nin verimliliğini kontrol etmek için, bilinen ortaklarla bir POI kullanarak bir deney yaptık. Bu deney, AirID'nin şüphesiz bitki hücrelerindeki ilişkili proteinleri etiketleyebileceğini doğruladı. AirID, in vitro ve hücrelerde ÜFE'leri analiz etmek için değerli bir enzimdir. Daha az toksisite yaratır ve ortak olmayanları etiketlemek için TurboID'den daha az zaman alan işlemlerde daha az hatalıdır ve hücrenin öldürülmesine yol açar. AirID'nin yakınlık biyotinilasyonu için diğer etiketleme enzimlerinden daha rekabetçi olduğunu göstermektedir. Daha doğrudur, zaman alan süreçlerde daha fazla potansiyele sahiptir ve in vitro ve canlı hücrelerde daha az toksiktir. Mevcut protokol, AirID'yi bir PL enzimi olarak kullanarak APRR2'nin etkileşimli proteinlerinin tanımlanmasını açıklar; ayrıca yöntem, bitki türlerinde ÜFE'leri araştırmak için diğer proteinlere de uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bitki materyalinin hazırlanması

  1. Deneysel analiz için Cucumis sativus (Salatalık) kullanılır. Tohumları suya koyun, 50 °C'de 20 dakika inkübe edin ve ardından tohumları 12-16 saat boyunca bir Petri plakası üzerindeki filtre kağıdına koyun.
  2. Daha sonra, tohumları toprak içeren saksılara aktarın (ticari olarak satın alınır) ve 23 ° C sıcaklıkta ve 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta bir iklim odasında büyütün.
  3. Başarılı bir agroinfiltrasyon için bitkileri 3 veya 4 yaprak aşamasına ulaşana kadar 3-4 hafta iklim odasında tutun.

2. AirID yapısının yapılması

  1. APRR2'yi hedef protein olarak kullanın ve Karnabahar mozaik virüsü 35S promotörü (p35S: APRR2-AirID) altında APRR2-AirID oluşturun. Bunu, Ağ Geçidi uyumlu ikili vektör pEarleyGate1006'ya (Kansas Eyalet Üniversitesi'nden Dr. Kathrin Schrick tarafından sağlanmıştır) ekleyin ve PL enzimini Ek Dosya 1'de sağlanan diziye göre doğrudan sentezleyin.

3. Yetkili hücrelerin hazırlanması

  1. DH5α yetkin hücrelerin hazırlanması
    1. 2 mL LB'yi (10 g/L tripton, 5 g/L maya özütü ve 10 g/L NaCl; pH = 7.0.) E.Coli DH5α hücreleri (çözülmeden doğrudan donmuş stoktan) ile aşılayın ve gece boyunca büyütün (O/N) 37 ° C'de.
    2. O / N kültüründen% 0.1 -% 0.5 inokulumu 100 mL LB Ortamına taze olarak aşılayın ve OD600 0.4-0.6 arasına ulaşana kadar hücreleri büyütün ve ardından kültürü 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    3. Kültürü iki adet 50 mL'lik santrifüj tüpüne alın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'de döndürün.
    4. Süpernatanı atın, hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2'de yeniden süspanse edin ve 15 dakika boyunca buzda bekletin. Hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 2500 x g'lık bir dönüşle peletleyin.
    5. Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 0.1 M CaCl2 +% 20 gliserol, her 1.5 mL tüpe 100 μL alikot içinde yeniden süspanse edin ve hemen -80 ° C'de saklayın.
  2. GV3101 yetkili hücrelerin hazırlanması
    1. 2 mL LB (50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin içerir) tek bir GV3101 kolonisi ile aşılayın. 250 rpm'de çalkalarken kültür O/N'sini 28 °C'de inkübe edin.
    2. 200 mL LB'yi 1 mL doymuş gece kültürü ile aşılayın. OD 600 0,5'e eşit olana kadar 28 °C'de inkübe ederken kültürü250 rpm'de çalkalayın.
    3. Kültürü dört adet önceden soğutulmuş steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika buz üzerinde bekletin.
    4. Hücreleri 2500 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve peletleri buzun üzerine yerleştirin.
    5. Hücreleri 10 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Hücreleri önceden soğutulmuş 50 mL'lik bir Oakridge tüpünde bir araya getirin.
    6. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin. 30 dakika buz üzerinde bekletin.
    7. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da pelet haline getirin. Süpernatanı atın ve hücreleri 2 mL 0.1 M buz gibi soğuk CaCl2 çözeltisinde yeniden süspanse edin.
    8. Hücreleri önceden soğutulmuş steril polipropilen tüplerde 50 μL'lik bir alikot içine dağıtın. Hücreleri -80 °C'de saklayın.

4. Agroinfiltrasyon

  1. İlk olarak, plazmiti agrobacterium'a aktarın
    1. Adım 2.1'den üretilen plazmitin 2.5 μL'sini agrobacterium tumefaciens GV3101 suşunun yetkili hücrelerine aktarın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
    2. Plazmidi ve yetkin hücreleri içeren tüpü 3 dakika boyunca sıvı nitrojene aktarın.
    3. Bir inkübatörde 5 dakika boyunca 37 ° C'de ısı şoku ve ardından tüpü 2 dakika boyunca buza koyun.
    4. Agrobakteriye 1.000 μLof LB ortamı (10 g / L tripton, 5 g / L maya özü ve 10 g / L NaCl; pH = 7.0) ekleyin ve 30 ° C ve 118 rpm'de 1 saat inkübe edin.
    5. 4 °C'de 2 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
    6. Çözeltinin üst 800 μL'sini atın ve kalan çözeltiyi karıştırın. Daha sonra, LB üzerine kaplayın (adım 4.1.4'te belirtildiği gibi, acar ve plazmit için 50 μg/mL Kanamisin ve GV3010 yetkin hücreler için 50 μg/mL gentamisin ve 25 μg/mL rifampisin ile eklenmiştir). Plakaları 30 °C'de 48 saat inkübe edin.
      NOT: İlgilenilen geni doğrulamak için bazı kolonileri seçmek ve PCR yapmakdaha iyidir 7.
  2. Plakalardan bazı bakteri kolonilerini alın ve bunları LB ortamına ve uygun antibiyotiklere koyun (bkz. adım 4.1.6). 30 °C ve 218 rpm'de 36-48 saat inkübe edin.
  3. Hücreleri 2 dakika 4 ° C'de 3.000 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri Agroinfiltrasyon tamponunda (10 mM MgCl2, 10 mM MES, pH = 5.6, 250 μM asetosiringon) OD600 = 1.0'a yeniden süspanse edin.
  4. 1 mL iğnesiz bir şırınga kullanarak (abaksiyal) epidermisteki aşıya (adım 4.3'ten üretilen) sızın.
    NOT: Tüm yaprağın içine sızmak ve çoğaltmayı seçmek daha iyidir. 4-5 bitki için bir yapı kullanın. Her yaprak için 1.5 mL yeniden süspanse edilmiş agrobakteri yeterlidir.
  5. Bitkileri iklim odasında 36 saat boyunca 16 saat ışık (yaklaşık 75 μmol·m-2·s-1) ve 8 ° C'de 23 saat karanlık fotoperiyot ile koruyun.
  6. 36 saatlik yapı sızmasından sonra, yapının zaten filtrelenmiş yapraklarına 1 mL 5 μM Biotin (10 mM MgCl2 çözeltisi içinde) sızın.
  7. Yaprak dokusunu hasat etmeden önce işlenmiş bitkileri 4-12 saat daha koruyun.
    NOT: Önceki çalışmaya göre, hedef protein 36 saatte zirve yapar, bu nedenle 36 hpi biyotin infiltrasyonunuseçin 4,6. Biyotin için inkübasyon süresi hedef çalışmaya bağlıdır, ancak mevcut deneye göre, proteinlerin etiketlenmesi için 8 saatlik bir inkübasyon süresi daha uygundur.

5. Örneklerin toplanması

NOT: Keratin kontaminasyonunu önlemek için numune toplama için tüm malzemeler steril olmalı ve tüm protokol adımları kontaminasyonsuz bir ortamda gerçekleştirilmelidir.

  1. Sızan yaprakları kesin ve protein bozulmasını önlemek için bunları hızla sıvı nitrojene aktarın.
  2. İmmünoblot analizleri ile proteinin ön tespitini gerçekleştirin6; bu, Ko-immünopresipitasyondan (Co-IP) önce şiddetle tavsiye edilir.

6. Yapraktan toplam protein ekstraksiyonu

  1. Yaprakları havanda ve havanda öğütün, hızlıca 2 mL 1x PBS-BSA PH 7.4 ekleyin ve yavaşça öğütün.
  2. 15 mL'lik konik bir tüp alın, konik tüpün üzerine hızlı bir filtrasyon malzemesi filtresi yerleştirin, numune karışımını hızlı filtrasyon malzemesi filtresinden tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun.
  3. Numuneleri 2 mL'lik bir tüpe aktarın ve% 1 protein inhibitörü kokteyli ekleyin.
  4. İçeriği 7-8 kez yukarı ve aşağı çevirerek karıştırın ve 1,000 x g'da 4 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
  5. Numunelerin üst çözücüsünü yeni 2 mL'lik tüplere aktarın,% 10 β-D-maltosit (β-DM) ekleyin ve 5 dakika boyunca buz üzerine koyun. 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin.

7. Tuzdan arındırma kolonunu dengeleyin

  1. Kolonu 1,000 °C'de 1 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Tüm santrifüj işlemleri sırasında kolonun bir tarafını işaretleyin ve işaretli tarafın dışa baktığından emin olun.
  2. Kolonun üst ve alt kapağını çıkarın ve 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  3. Sıvı çözeltiyi kolonun toplama tüpünden atın ve yıkama için 5 mL 1x PBS tamponu ekleyin.
  4. Kolonu 1,000 °C'de 2 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
  5. 7.3 ve 7.4 adımlarını en az beş kez tekrarlayın.

8. Manyetik boncuk yıkama

  1. 1.5 mL'lik bir tüp alın ve 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuk ekleyin.
  2. Yıkamak için 1 mL 1x PBS-BSA ekleyin, iyice karıştırın ve 3 dakika boyunca mıknatıs standına koyun. Süpernatanı atın.
  3. Adım 8.2'yi en az üç kez tekrarlayın.
  4. Her yıkamadan sonra, yıkama tamponunu çıkarmak için boncukları tüpün bir tarafına doğru adsorbe etmek için tüpü manyetik rafa yerleştirin.

9. Biyotinile proteinlerin zenginleştirilmesi

  1. Kolona 2 mL numune ekleyin ve 4 °C'de 8 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin.
  2. Dengelemek için 50 μL streptavidin-C1 konjuge manyetik boncuklara 1 mL tuzdan arındırılmış protein özü ekleyin.
  3. Tüpü döndürücüye normal hızda yerleştirin, böylece çözelti iyice karışır ve oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe eder.
  4. Süpernatanı nazikçe çıkarmak için boncukları RT'de 3 dakika veya tüpün bir tarafında toplanana kadar manyetik rafa yerleştirin.
  5. 1 mL yıkama tamponu I (suda% 2 SDS) ekleyin, bir döndürücüde 2 dakika boyunca RT'de döndürün ve 9.4 adımını tekrarlayın.
  6. 1 mL yıkama tamponu II (50 mM HEPES: pH = 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h] ve %1 Triton X-100) ekledikten sonra tüpü RT'de 2 dakika döndürücüye yerleştirin. Adım 9.4'ü tekrarlayın.
  7. 1 mL yıkama tamponu III (10 mM Tris-HCl: pH = 7.4, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolik asit [a/h], %1 NP40 [v/v]) ekleyin ve RT'de 2 dakika çalkalayıcı kullanarak döndürün. Ardından, 9.4 adımını tekrarlayın.
  8. Deterjanı çıkarmak için 1,7 mL 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5) ekleyin ve 9.4 adımını tekrarlayın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
  9. Boncukları RT'de 1 mL 50 mM amonyum bikarbonat tamponunda her biri 2 dakika boyunca altı kez yıkayın ve 9.4 adımını tekrarlayın.
  10. Boncuklara 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), %12 (a/h) sükroz (Suc), %2 (a/h) lityum lauril sülfat ve %1.5 (a/h) ditiotreitol içeren 50 μL protein özütü ekleyin, inkübatörde 100 °C'de 5 dakika boyunca ısı şoku uygulayın ve 9.4 adımını izleyin. Süpernatanı LC-MS/MS analizi için -80 °C'de saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki araştırmalara göre, salatalık geni APRR2 , beyaz olgunlaşmamış meyve rengini kontrol eden aday gendir8. Burada, salatalıkta APRR2'nin etkileşimli ortak proteinini bulmak için yakınlık etiketleme enzimi olarak AirID kullanılarak bir protokol geliştirildi. Yapı salatalık yapraklarına aktarıldı ve infiltrasyondan 36 saat sonra biyotin aktarıldı. 48 saat sonra, başarılı dönüşümü doğrulamak için western blot analizi için örnekler alındı. Proteinler, western blot protokolünde yu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut deneyde, Kido ve ark. büyük bir genom veri seti ve beş geleneksel BirA enzimi5 kullanarak atalardan kalma enzim rekonstrüksiyonu algoritması aracılığıyla geliştirdi. Rastgele mutasyonlar dinamik dizi değişiklikleri üretemediğinden, geleneksel evrimsel protein mühendisliğindeaktivite 9,10'u geliştirmek için rastgele mutasyonlar kullanıldı. Diğer PL enzimleriyle karşılaştırıldığında, AirID'nin çeşitli avantajları vardır. Daha önce bu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemişlerdir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 32000197 - X.H.), Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı'ndan Özel Mali Hibe (Hibe No. 2019T120467 - KH) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AsetosiringonPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdS1519
Akrilik / Bis% 30 çözeltiSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd1510KA4528
AgarBioFroxx GmbHD64683
Agarosetsingke (Şangay) Co.LtdTSJ001
Amonyum bikarbonatSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd
BiotinBBI yaşam BilimleriG908BA0012
CaCl2BBI yaşam BilimleriE209BA0008
Yetkili hücreler GV3101Mevcut deneyde
Tuzdan arındırma sütunuTermo bilimselWC321753
Deoksikolik asitSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd
DH5 & alfa; yetkin hücrelerMevcut deneydeE.coli DH5 & alpha;
β-D-maltosidePekin Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS818
EDTASangon Biotech (Şangay) Co.LtdE104BA0029
GlisinSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd161BA0031
HEPESPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdH8090
LiClSangon Biotech (Şangay) Co.LtdH209BA0003
MESPekin solaribo bilim ve teknoloji Co.LtdM8019
MiraClothEMD Milipore Corp / MERCK kgAa Darmstadt, Germenay3429963Hızlı filtrasyon malzeme filtresi
MgCl2< / sub>Pekin solaribo bilim ve teknoloji Co.Ltd20200819
NaClSangon Biotech (Şangay) Co.Ltd H324BA0003
NP40Sangon Biotech (Şangay) Co.LtdN8030
Protein inhibitörü kokteyliBeijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS3450
PVDFBIO-RAD
SDSBeijing Scolario Bilim ve Teknoloji Co.LtdS1015
SilwetSangon Biotech (Şangay) Co.LtdS9430
Streptavidin-C1-konjuge manyetik boncuklarZenginleştirici Biyoteknoloji7E511E1Manyetik boncuklar
TEMEDServicebioG2056
Triton X-100Sangon Biotech (Şangay) Co.LtdGB03BA007
Tris-HClSangon Biotech (Şangay) Co.LtdF828BA0020
TriptonTermo bilimselLP0042
G313BA0018yapılmıştırG818BA0029 yapılan 5820172

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Han, J., et al. The identification of novel protein-protein interactions in liver that affect glucagon receptor activity. PloS One. 10 (6), 0129226(2015).
  2. Zhao, S., et al. Screening and identification of host proteins interacting with Theileria annulata cysteine proteinase (TaCP) by yeast-two-hybrid system. Parasites & Vectors. 10 (1), 536(2017).
  3. Zhang, Y., et al. A highly efficient agrobacterium-mediated method for transient gene expression and functional studies in multiple plant species. Plant Communications. 1 (5), 100028(2020).
  4. Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments. (159), e60728(2020).
  5. Kido, K., et al. AirID, a novel proximity biotinylation enzyme, for analysis of protein-protein interactions. eLife. 9, 54983(2020).
  6. Hu, X., et al. Overexpressing 7-hydroxymethyl chlorophyll a reductase alleviates non-programmed cell death during dark-induced senescence in intact Arabidopsis plants. Biomolecules. 11 (8), 1143(2021).
  7. Ammiraju, J., et al. The Oryza bacterial artificial chromosome library resource: construction and analysis of 12 deep-coverage large-insert BAC libraries that represent the 10 genome types of the genus Oryza. Genome Research. 16 (1), 140-147 (2006).
  8. Liu, C., et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice. Journal of Experimental Botany. 67 (18), 5339-5347 (2016).
  9. Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
  10. Nakano, S., Niwa, M., Asano, Y., Ito, S. Following the evolutionary track of a highly specific l-Arginine oxidase by reconstruction and biochemical analysis of ancestral and native enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 85 (12), 00459(2019).
  11. Gingras, A. -C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
  12. Odeh, H. M., Coyaud, E., Raught, B., Matunis, M. J. The SUMO-specific isopeptidase SENP2 is targeted to intracellular membranes via a predicted N-terminal amphipathic α-helix. Molecular Biology of the Cell. 29 (15), 1878-1890 (2018).
  13. Motani, K., Kosako, H. Activation of stimulator of interferon genes (STING) induces ADAM17-mediated shedding of the immune semaphorin SEMA4D. Journal of Biological Chemistry. 293 (20), 7717-7726 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

AirID Yak nl k EtiketlemesiBitki Proteini EtiketlemesiBiyotinize Protein Zenginle tirmeStreptavidin Manyetik BoncuklarAgroinfiltrasyon Tekni iWestern Blot AnaliziLCMS MS AnaliziAfinite TemizlemeSalatal k Proteini Ekstraksiyonu

İlgili makaleler