Method Article

Domateste Tohum Geliştirme Çalışması için Verimli Bir Takas Protokolü (Solanum lycopersicum L.)

DOI:

10.3791/64445

⸱

September 7th, 2022

 ,  , 
1Key Laboratory of Plant Molecular Physiology, Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, 2College of Life Science, University of Chinese Academy of Sciences, 3Innovative Academy of Seed Design, Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bu protokol, daha ince embriyonik yapıyı gözlemlemek için farklı gelişim aşamalarında domates tohumlarının temizlenmesi için yararlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domates (Solanum lycopersicum L.) dünya çapında en büyük nakit mahsullerinden biridir. Domates tohumu, bitki üremesi sırasında genetik ve gelişim biyolojisini incelemek için önemli bir modeldir. Bir domates tohumu içindeki daha ince embriyonik yapının görselleştirilmesi genellikle tohum kabuğu müsilajı, çok hücreli katmanlı bütünlük ve zahmetli gömme bölümleme ile çözülmesi gereken kalın duvarlı bir endosperm tarafından engellenir. Daha basit bir alternatif, kimyasal maddeler kullanarak tohumu neredeyse şeffaf hale getiren doku temizleme teknikleri kullanmaktır. Geleneksel temizleme prosedürleri, daha ince bir tohum kabuğuna sahip daha küçük tohumlara derinlemesine bilgi vermesine rağmen, domates tohumlarının temizlenmesi, özellikle geç gelişim aşamalarında, teknik olarak zor olmaya devam etmektedir.

Burada, embriyonik morfolojinin neredeyse tamamlandığı çiçeklenmeden 3 ila 23 gün sonra domates tohumu gelişimini gözlemlemek için hızlı ve emek tasarrufu sağlayan bir temizleme protokolü sunulmaktadır. Bu yöntem, Arabidopsis'te yaygın olarak kullanılan kloral hidrat bazlı temizleme çözeltisini, Formalin-Aseto-Alkol (FAA) fiksasyonunun ihmal edilmesi, tohumların sodyum hipoklorit muamelesinin eklenmesi, yumuşatılmış tohum kabuğu müsilajının çıkarılması ve yıkama ve vakum işlemi dahil olmak üzere diğer modifikasyonlarla birleştirir. Bu yöntem, domates tohumlarının farklı gelişim aşamalarında verimli bir şekilde temizlenmesi için uygulanabilir ve mutant tohumların gelişim sürecinin iyi mekansal çözünürlükle tam olarak izlenmesinde yararlıdır. Bu temizleme protokolü, Solanaceae'deki ticari olarak önemli diğer türlerin derin görüntülenmesine de uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domates (S. lycopersicum L.), 2020 yılında 5,1 milyon hektardan 186,8 milyon ton etli meyve üretimi ile dünyadaki en önemli sebze mahsullerinden biridir1. Patlıcan, biber, patates ve tütün gibi ticari açıdan önemli birçok ürün de dahil olmak üzere yaklaşık 2.716 tür2 ile büyük Solanaceae familyasına aittir. Ekili domates, genom boyutu yaklaşık 900 Mb3 olan bir diploid türüdür (2n = 2x = 24). Uzun süredir, yabani Solanum spp'den arzu edilen özellikleri seçerek domates evcilleştirme ve ıslahına yönelik büyük çaba sarf edilmiştir. Domates Genetiği Kaynak Merkezi'nde listelenen 5.000....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Çözeltilerin hazırlanması

  1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2,5 mL% 37 formaldehit, 2,5 mL buzul asetik asit ve 45 mL% 70 etanol ekleyerek FAA fiksatif hazırlayın. Vorteks yapın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan hemen önce FAA fiksatif hazırlayın.
    DİKKAT: %37 formaldehit aşındırıcıdır ve maruz kalırsa veya solunduğunda potansiyel olarak kanserojendir. Fiksatif, uygun kişisel koruyucu ekipman giyerken bir duman başlığında yapılmalıdır.
  2. Kalay folyo ile sarılmış 100 mL'lik bir cam şişeye 5 mL% 100 gliserol, 40 g kloral hidrat ve 10 mL damıtılmış su ekleyerek temizleme çözeltisi hazırlayın. Oda sıcaklığında gece boyunca manyetik bir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domates tohumları Arabidopsis'te olduğu gibi geleneksel bir yöntem kullanılarak temizlendiğinde, yoğun endosperm hücreleri erken domates embriyolarının 3 DAF ve 6 DAF'ta görselleştirilmesini engelledi (Şekil 3A, B). Embriyonun toplam hacmi arttıkça, küresel bir embriyo 9 DAF'ta zar zor ayırt edilebildi (Şekil 3C). Bununla birlikte, tohum büyüklüğü artmaya devam ettikçe, geçirgenliği azaldı ve 12 DAF'ta bulanık bir kalp embriyosu ile son.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mekanik kesitleme ile karşılaştırıldığında, temizleme teknolojisi, bitki dokularının veya organlarının bütünlüğünü koruduğu için üç boyutlu görüntüleme için daha avantajlıdır16. Geleneksel temizleme protokolleri, kimyasal çözeltilerin daha kolay nüfuz etmesi nedeniyle genellikle küçük numunelerle sınırlıdır. Domates tohumu, doku temizliği için sorunlu bir örnektir, çünkü boyut olarak bir Arabidopsis tohumundan yaklaşık 70 kat daha büyüktür ve daha fazla geçirgenlik bariyerine sahiptir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, sırasıyla diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ve geleneksel temizleme yöntemi hakkındaki yararlı önerileri için Dr. Jie Le ve Dr. Xiufen Song'a minnettardır. Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31870299) ve Çin Bilimler Akademisi Gençlik İnovasyon Teşvik Derneği tarafından finanse edildi. Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.000 ve mikro; L pipetGILSONFA10006M
; L pipet uçlarıCorningT-1000-B
2 ml santrifüj tüpüAxygenMCT-200-C
%37 formaldehitDAMAO685-2013
5.000 & mikro; L pipetEppendorf3120000275
5.000 & mikro; L pipet uçlarıbiosharpBS-5000-TL
50 ml santrifüj tüpüCorning430829
Mutlak EtanolBOYUAN678-2002
Şişe camıFisherFB800-100
Kloral HidratMeryerM13315-100G
LamelLeica384200
DIC mikroskobuZeissAxio Görüntüleyici A110x, 20x ve 40x büyütme
DezenfektanQIKELONGAN17-9185
Diseksiyon iğnesiBioroyee17-9140
Çiçek besin toprağıFANGJIE
ForsepsHAIOU4-94
Buzul Asetik AsitBOYUAN676-2007
GliserolSolarbioG8190
Manyetik karıştırıcıIKARET basic
Micro-TomDomates Genetiği Kaynak MerkeziLA3911
Orbital çalkalayıcıQILINBEIERQB-206
Tohumlama substratıPINDSTRUPLV713/018-LV252Tarama:0-10 mm
Tek içbükey slaytHUABODEYI
SlaytLeica3800381
StereomikroskopLeicaS8 APO1x ila 4x büyütme
Kalay folyoZAOWUFANG613
Tween 20SigmaP1379
Vakum pompasıSHIDESHB-III
Vorteks ölçerSilogexMX-S
1.000 & mikroHBDY1895

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. FAOSTAT. , Available from: https://www.fao.org/faostat/en/#data/QCL (2022).
  2. Olmstead, R. G., Bohs, L. A summary of molecular systematic research in Solanaceae: 1982-2006. Acta Horticulturae. 745, 255-268 (2007).
  3. Consortium, T. G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tomato Seed ClearingSeed DevelopmentTissue ClearingSodium Hypochlorite TreatmentSeed Coat MucilageEmbryo VisualizationDifferential Interference ContrastVacuum TreatmentEndosperm CellsSolanum Lycopersicum

Related Articles