Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ube3a Varyantlarının İşlevsel Değerlendirmesi için Ölçeklenebilir, Hücre Tabanlı Bir Yöntem

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64454

⸱

10 Ekim 2022

 , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

Bu makalede

Özet

Fonksiyon kaybı ve kazancı hem Angelman sendromu hem de otizm spektrum bozukluğu ile bağlantılı olan bir gen olan Ube3a'daki yanlış anlam varyantlarının fonksiyonel önemini değerlendirmek için basit ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirilmiştir.

Özet

Tıpta dizilemenin artan kullanımı, insan genomunda milyonlarca kodlama varyantı tanımlamıştır. Bu varyantların birçoğu nörogelişimsel bozukluklarla ilişkili genlerde görülür, ancak varyantların büyük çoğunluğunun fonksiyonel önemi bilinmemektedir. Mevcut protokol, hem otizm hem de Angelman sendromuna bağlı bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a için varyantların incelenmesini açıklamaktadır. Ube3a'nın çoğaltılması veya çoğaltılması otizmle güçlü bir şekilde bağlantılıdır, oysa silinmesi Angelman sendromuna neden olur. Bu nedenle, UBE3A protein aktivitesindeki değişikliklerin değerini anlamak, klinik sonuçlar için önemlidir. Burada, Ube3a varyantlarını bir Wnt yol muhabiri ile eşleştiren hızlı, hücre tabanlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu basit tahlil ölçeklenebilir ve herhangi bir Ube3a varyantındaki aktivite değişikliklerinin değerini ve büyüklüğünü belirlemek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemin tesisi, UBE3A'nın enzimatik mekanizmaları hakkında derin bilgiler edinmek için kullanılabilecek çok sayıda yapı-işlev bilgisinin üretilmesine izin verir.

Giriş

Son teknolojik gelişmeler, ekzomların ve genomların dizilimini klinik ortamlarda rutin hale getirmiştir 1,2. Bu, tipik olarak bir proteindeki bir amino asidi değiştiren milyonlarca yanlış anlam varyantı da dahil olmak üzere çok sayıda genetik varyantın keşfedilmesine yol açmıştır. Bu varyantların fonksiyonel önemini anlamak bir zorluk olmaya devam etmektedir ve bilinen yanlış anlam varyantlarının sadece küçük bir kısmı (~% 2) klinik bir yoruma sahiptir 1,3.

Bu sorunun belirgin bir örneği, yıkım için substrat proteinlerini hedef alan bir E3 ubikitin ligazını kodlayan bir gen olan Ube3a'dır 4. Ube3a, kromozom 15q11-13 içinde bulunur ve sadece maternal kalıtsal alel 5,6,7'den eksprese edilir. Hastalık genetiğinden yapılan gözlemler, UBE3A enziminin yetersiz veya aşırı aktivitesinin farklı nörogelişimsel bozukluklara neden olduğunu kuvvetle göstermektedir. Maternal kromozom 15q11-13'ün silinmesi, ciddi zihinsel engellilik, motor bozukluklar, nöbetler, sık sık gülümseyen mutlu bir tavır ve dismorfik yüz özellikleri 8,9,10 ile karakterize bir bozukluk olan Angelman sendromuna (AS) 8'e neden olur. Buna karşılık, maternal kromozom 15q11-13'ün çoğaltılması veya çoğaltılması, otizmin en yaygın sendromik formlarından biri olarak kabul edilen heterojen bir durum olan Dup15q sendromuna neden olur11,12,13. Ek olarak, Ube3a'da tanımlanan yüzlerce yanlış anlam varyantı vardır, bunların çoğu, fonksiyonel ve klinik önemi bilinmediğinden, belirsiz öneme sahip varyantlar (VUS) olarak kabul edilir. Bu nedenle, nörogelişimsel hastalığa katkıda bulunup bulunmadıklarını belirlemek için Ube3a varyantlarını ampirik olarak değerlendirebilecek yöntemler geliştirmeye büyük ilgi vardır.

UBE3A enzimi, E2 enzimlerinden aktive ubikitini kabul etmek ve substrat proteinlerine aktarmak için gerekli biyokimyasal makineleri içeren isimsiz HECT alanına sahip olan E3 ubikitin ligazlarının HECT (E6-AP C-terminus'a homolog) alan ailesine aittir14. Tarihsel olarak, E3 enzimlerinin karakterizasyonu,saflaştırılmış proteinlerin bir topluluğunu gerektiren yeniden yapılandırılmış in vitro sistemlere dayanmaktadır 4,15,16. Bu tür yöntemler yavaş ve emek yoğundur ve çok sayıda varyantın aktivitesini değerlendirmeye uygun değildir. Önceki çalışmalarda, UBE3A'nın, β-katenin17'nin bozulmasını yavaşlatmak için proteazomun işlevini modüle ederek HEK293T hücrelerinde Wnt yolunu aktive ettiği tespit edildi. Bu içgörü, Wnt yol muhabirlerinin Ube3a18'in hem işlev kaybı hem de kazanç değişkenlerini tanımlamak için verimli ve hızlı bir yöntem olarak kullanılmasına izin verir. Aşağıdaki protokol, Ube3a varyantlarının aktivitesindeki değişiklikleri değerlendirmek için Lusiferaz tabanlı bir muhabirin yanı sıra Ube3a varyantlarını üretmek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Ube3a varyantları üretmek için mutagenez klonlaması

  1. Tüm Ube3a varyantlarını, EGFP ekspresyonu19 için bir tavuk-β-aktin promotörü ve bir iç ribozom giriş bölgesi (IRES) içeren bir bisistronik vektör olan pCIG2 plazmidine (Şekil 1A) klonlayın. Tam uzunluktaki Ube3a yapıları bir N-terminal Myc-tag dizisi içerir ve 5' SacI sitesi ve 3' XmaI sitesi kullanılarak pCIG2'ye klonlanır. Ek olarak, Ube3a kodlama dizisindeki doğal olarak oluşan EcoRI, EcoRV ve PstI siteleri de parçaları alt klonlamak için kullanılır.
    NOT: Ube3a için tanımlanmamış varyantlar, literatür aracılığıyla ve ClinVar veritabanı1 gibi kamuya açık depolarda elde edilebilir. Bildirilmemiş ek varyantlar, tıp merkezleriyle kişisel iletişim yoluyla elde edilebilir.
  2. Ube3a okuma çerçevesine mutasyonlar eklemek için uyarlanmış iki aşamalı megaprimer mutagenez yöntemi20 kullanın. İlk adımda, istenen mutasyonu içeren mutajenik oligonükleotidi tasarlayın (bu protokolde gösterilen örnek, mutasyona en az 30 baz çifti (bp) homoloji 5′ ve 3′ ile çevrili bir UBE3A Q588E varyantı oluşturmaktır (Şekil 1B ve Tablo 1).
  3. Mutasyonu içeren 200-400 bp'lik bir megaprimer oluşturmak için ilk tur PCR için tamamlayıcı bir oligonükleotid ile birlikte mutajenik oligonükleotidi kullanın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). % 1'lik bir jel ve müteakip jel saflaştırması (Malzeme Tablosu) kullanarak agaroz jel elektroforezi için PCR reaksiyon hacminin 50 μL'sinin tamamını kullanın. PCR ürününü aşağıdaki ikinci tur PCR adımında kullanılmak üzere 30 μL deiyonize H2O (diH2O) içinde süzün.
  4. İkinci tur PCR'yi belirtildiği gibi ayarlayın (Şekil 1C; Tablo 2 ve Tablo 3). Bu adım, alt klonlama için uygun mutasyon ve terminal kısıtlama bölgelerini içeren daha büyük DNA fragmanları (tipik olarak ~ 1-1.5 kb uzunluğunda) üretecektir (Şekil 1C).
  5. PCR reaksiyonunun tamamlanmasından sonra, elde edilen ürünü bir PCR saflaştırma kiti (Malzeme Tablosu) kullanarak saflaştırın. 30 μL'de salınım yapın ve saflaştırılmış tüm ürünü ve pCIG2 Ube3a WT yapısını uygun kısıtlama enzimleri ile sindirin (örnek EcoRI ve XmaI ile sindirimi gösterir).
  6. 37 °C'de 2 saatlik sindirimden sonra, sindirim ürünlerini agaroz jel elektroforezi (% 1 jel) ile çözün ve uygun ürünleri jel saflaştırın. Üreticinin protokolüne (Malzeme Tablosu) göre ligasyonlar kurun, ligasyon ürünlerini DH10B bakteri suşuna (Malzeme Tablosu) dönüştürün ve ardından ampisilin (100 μg / mL) seçimi ile plaka.
  7. Ertesi gün, Luria Broth (LB) ve 100 μg / mL ampisilin içeren 3 mL kültürleri aşılamak için iki ila dört koloni seçin. Kültürlerin bir gecede 37 ° C'de bir yörüngesel inkübatörde sallanarak (225 rpm) büyümesine izin verin.
  8. Ertesi gün, plazmid DNA'sını en aza indirmek için 1-1.5 mL bakteri kültürü kullanın (Malzeme Tablosu). Kalan kültürü 4 °C'ye yerleştirerek kaydedin. Miniprepped plazmidleri, istenen mutasyondan ~ 200 bp'ye bağlanan bir oligonükleotid kullanarak Sanger dizilimi ile tarayın.
  9. Doğru plazmidin midiprep edilmesi için 50 mL kültürleri yeniden aşılamak için 4 ° C'de kaydedilen bakteri kültürlerini kullanın (Malzeme Tablosu). DNA'nın doğru dizisini doğrulamak için Ube3a kodlama dizisini tam olarak sıralayın.
  10. Sonraki transfeksiyon adımları için steril H 2 O kullanarak Ube3a varyantı plazmidlerinin yanı sıra β-katenin aktive edilmiş muhabir (BAR)21, TK-Renilla lusiferaz, ligaz-ölü Ube3a (UBE3A C820A mutasyonu) vepCIG2boş vektörünün çalışma stoklarını oluşturun.

2. İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK293T) hücrelerinin hazırlanması ve transfeksiyonu

  1. Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) yetiştirilen HEK293T hücrelerinde glutamin,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve daha önce tarif edildiği gibi antibiyotik-antimikotik ajan ile önceden desteklenmiş HEK293T hücrelerinde tahlilleri gerçekleştirin17. Steril, nemlendirilmiş bir inkübatördeki hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de büyütün.
  2. Bir biyogüvenlik kabini kullanarak, ilk önce askıya alınmış HEK293T hücrelerini, 100 μL kültür ortamında kuyu başına 2.2 × 104 hücre yoğunluğunda doku kültürü ile muamele edilmiş 96 kuyucuklu düz tabanlı plakalara yerleştirin ve bir gecede büyümelerini sağlayın.
  3. İkinci gün, bir biyogüvenlik kabinindeki hücreleri Firefly ve Renilla lusiferaz muhabir plazmidleri (Tablo 4) ve Ube3a plazmidleri üçlü olarak transfekte edin. Transfeksiyonları, daha önce tarif edildiği gibi 10: 1: 8 plazmid oranı (sırasıyla 50 ng BAR, 5 ng TK-Renilla ve kuyu başına 40 ng Ube3a plazmid) kullanarak kuyu başına toplam hacmin 10 μL'sinde gerçekleştirin18 ve 0.4 μL transfeksiyon reaktifi (Tablo 4).
    NOT: Her deney için, boş bir vektör (yalnızca GFP) ve bir plazmid kodlama ligaz ölü Ube3a da negatif kontroller olarak hizmet etmek üzere transfekte edilir.
  4. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde (Tablo 4) her varyant için transfeksiyonlar için bir ana karışım oluşturun ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüpe dokunarak transfeksiyon karışımını hafifçe çalkalayın ve ardından transfeksiyon karışımının 10 μL'sini doğrudan kuyucuklardaki mevcut büyüme ortamına ekleyin.
  5. Daha sonra, hücreleri inkübatöre geri döndürün ve plazmidlerin 48 saat boyunca eksprese olmasına izin verin. Büyüme ortamının değiştirilmesi gerekli değildir.
  6. Bir floresan mikroskobu kullanarak GFP floresan ile transfeksiyon verimliliğini izleyin. HEK293T hücreleri bu yöntemle verimli bir şekilde transfekte edilir ve hücrelerin% >80'i 48 saat sonra GFP eksprese etmelidir.

3. Lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi

NOT: Luciferaz aktivitesi, üreticinin protokolüne göre hem Firefly hem de Renilla luciferase'i (Malzeme Tablosu) test eden ticari olarak temin edilebilen bir sistem kullanılarak değerlendirilir.

  1. Kültür ortamını transfekte HEK293T hücrelerinden dikkatlice aspire edin ve ardından hücreleri soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 25 μL denatüre olmayan lizis tamponu ekleyerek hücreleri lize edin ve buz üzerinde hafifçe sallanarak 15 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Daha sonra, elde edilen lizatın 20 μL'sini (santrifüjleme gerekmez) 100 μL Firefly lusiferaz substrat reaktifi içeren yeni bir 96 kuyulu tahlil plakasına ekleyin. Plakayı hafifçe dokunarak karıştırın.
  3. Plakayı bir plaka okuyucuya yükleyin ve 1 mm okuma yüksekliğine ve 1 s entegrasyon süresine sahip bir üst dedektör kullanarak parlaklığı ölçün.
    NOT: Dedektörün kazancının, sinyalin gücüne göre ayarlanması gerekebilir.
  4. Firefly lusiferaz lüminesansını okuduktan hemen sonra, kuyucuklara 100 μL Renilla lusiferaz substratı ekleyin. Bu adım, Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirirken aynı zamanda Firefly lusiferaz aktivitesini söndürür. Numuneleri plakanın nazikçe çalkalanması ile karıştırın ve Renilla lusiferaz aktivitesini değerlendirmek için lüminesansı tekrar ölçün.
    NOT: Bu test için başka plakalar da kullanılabilirken, siyah çerçeveli ve beyaz kuyucuklu plakaların kullanılması, gürültüyü en aza indirirken lusiferaz sinyalini yükselttiği için en hassas sonuçları sağlayacaktır.
  5. Muhabirin yanıtlarını Firefly luciferase - Renilla luciferase oranı (Firefly / Renilla) olarak ölçün ve üçlü ölçümlerin değerlerinin ortalamasını alın. Daha sonra, varyant proteinlerin göreceli aktivitesini karşılaştırmak için her varyant için Firefly / Renilla değerini, vahşi tip (WT) Ube3a eksprese eden hücrelerin değerlerine karşı normalleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ube3a yanlış anlam varyantlarının büyük ölçekli fonksiyonel taraması, fonksiyon kaybı ve kazancı mutasyonlarının geniş bir manzarasını tanımlar.
Ube3a mutantları ile yapılan önceki çalışmalar, Wnt yanıtının hücresel UBE3A protein aktivitesinin bir muhabiri olarak hizmet edebileceğini öne sürdü. Bu gözlemler genişletildi ve BAR testinin hücredeki bir dizi UBE3A aktivitesini rapor etmek için uygun olup olmadığını araştırmak için ek doğrulama deneyleri yapıldı. İlk olarak, HEK293T hücre...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, Ube3a varyantlarının enzimatik aktivitesini değerlendirmek için verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem sağlar. Bu tahlili kullanırken dikkatli bir şekilde düşünülmesini gerektiren birkaç teknik ayrıntı vardır. Bir husus, bu tahlilde kullanılan Wnt muhabir plazmidlerinin seçimidir. Burada açıklanan protokol, özellikle TCF bağlanma bölgelerinin rekombinasyonunu ve kaybını en aza indirmek için özel olarak tasarlanmış bağlayıcı dizileriyle ayrılmış 12 T-hücresi faktörü (TCF) yanıt elemanında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Simons Vakfı Bağımsızlık Köprüsü Ödülü (SFARI Ödülü #387972; J.J.Y.), Beyin ve Davranış Araştırma Vakfı'ndan (J.J.Y.) NARSAD Genç Araştırmacı Ödülü, Alfred P. Sloan Vakfı'ndan (J.J.Y.) Araştırma Bursu ve Angelman Sendromu Vakfı (J.J.Y.), Whitehall Vakfı (J.J.Y.) ve NIMH'den (R01MH122786; J.J.Y.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.05 Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısıGibco25300-054
1 Kb DNA merdiveniLambda BiotechM108-S
100 bp DNA MerdiveniLambda BiotechM107
10 mM ATP ile T4 DNA Ligaz için 10x TamponNew England BioLabsB0202A
5x Phusion HF Reaksiyon TamponuNew England BioLabsB0518S
Antibiyotik-AntimikotikÇözelti Corning30004CI
Siyah/Beyaz Isoplate-96 Siyah Çerçeve Beyaz Kuyu plakasıPerkinElmer6005030
Karbenisilin Disodyum TuzuMidwest ScientificKCC46000-5
Kontes hücre sayma odası ve slaytlarC10283tarafından Invitrogen
Otomatik Hücre Sayacı yaşam teknolojileriHücre sayma makinesi
Özel DNA oligolarıEntegre DNA Teknolojileri (IDT)
Deoksinükleotid (dNTP) Çözelti KarışımıNew England BioLabsN0447S
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvatGibco10569044HEK293T hücre hattının büyümesini desteklemek için bazal ortam
DPBS (1x)Gibco14190-136
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1910
EcoRI-HF New England BioLabsR3101SRestriksiyon enzimi
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, ısıyla inaktiveGibco16140071Fetal sığır serumu
Fisherbrand Yüzey İşlem Görmüş Doku Kültürü YemekleriFisherbrandFB012924
FuGENE 6 Transfeksiyon ReaktifiPromegaE2691
Jel Yükleme Boyası Mor (6x)New England BioLabsB7024A
HEK293T hücreleriATCCCRL-3216
Yüksek Verimlilik ig 10B Kimyasal Olarak Yetkin HücrelerBozulmamış Genomik1011-12E. coli DH10B hücreleri
HiSpeed Plazmid Midi KitiQiagen12643Midi hazırlık
pCIG2 plazmit
pGL3 BAR plazmit
Phusion HF DNA PolimerazNew England BioLabsM0530LDNA polimeraz
ProFlex 3 x 32 kuyulu PCR SistemiYaşam teknolojileriThermocycler
pTK Renilla plazmid
QIAprep Spin Miniprep Kiti (250)Qiagen27106Mini hazırlık
QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti (250)Qiagen28706Jel saflaştırma
QIAquick PCR Arıtma Kiti (250)Qiagen28106PCR saflaştırma
rCutSmart TamponuNew England BioLabsB6004S
SacI-HFNew England BioLabsR3156SKısıtlama enzimi
Sinerji HTX Çok Modlu OkuyucuBioTek  Plaka okuyucu Gen5 yazılımı v3.08 (BioTek)
T4 DNA LigaseNew England BioLabsM0202LLigase
TAE Tamponu, Tris-Asetat-EDTA, 50x Çözelti, ElektroforezFisher ScientificBP13324
Doku Kültürü Plakası 96 kuyu, Düz TabanlıFisherbrandFB012931
Thermo Fisher ScientificUltraPure Etidyum Bromür Çözeltisi
XmaINew England BioLabsR0180SKısıtlama enzimi
Thermo Fisher Scientific Kontes II edilmiş tarafından uygulanan biyosistemler tarafından İnvitrojeni çalıştırır 15585011

Kaynaklar

  1. Landrum, M. J., et al. ClinVar: Public archive of relationships among sequence variation and human phenotype. Nucleic Acids Research. 42, 980-985 (2014).
  2. Lek, M., et al. Analysis of protein-coding genetic variation in 60,706 humans. Nature. 536 (7616), 285-291 (2016).
  3. Starita, L. M., et al. Variant interpretation: Functional assays to the rescue. American Journal of Human Genetics. 101 (3), 315-325 (2017).
  4. Scheffner, M., Huibregtse, J. M., Vierstra, R. D., Howley, P. M. The HPV-16 E6 and E6-AP complex functions as a ubiquitin-protein ligase in the ubiquitination of p53. Cell. 75 (3), 495-505 (1993).
  5. Albrecht, U., et al. Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nature Genetics. 17 (1), 75-78 (1997).
  6. Rougeulle, C., Glatt, H., Lalande, M. The Angelman syndrome candidate gene, UBE3A/E6-AP, is imprinted in brain. Nature Genetics. 17 (1), 14-15 (1997).
  7. Vu, T. H., Hoffman, A. R. Imprinting of the Angelman syndrome gene, UBE3A, is restricted to brain. Nature Genetics. 17 (1), 12-13 (1997).
  8. Kishino, T., Lalande, M., Wagstaff, J. UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nature Genetics. 15 (1), 70-73 (1997).
  9. Jiang, Y. H., et al. Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 21 (4), 799-811 (1998).
  10. Mabb, A. M., Judson, M. C., Zylka, M. J., Philpot, B. D. Angelman syndrome: Insights into genomic imprinting and neurodevelopmental phenotypes. Trends in Neuroscience. 34 (6), 293-303 (2011).
  11. Hogart, A., Wu, D., LaSalle, J. M., Schanen, N. C. The comorbidity of autism with the genomic disorders of chromosome 15q11.2-q13. Neurobiology of Disease. 38 (2), 181-191 (2010).
  12. Urraca, N., et al. The interstitial duplication 15q11.2-q13 syndrome includes autism, mild facial anomalies and a characteristic EEG signature. Autism Research. 6 (4), 268-279 (2013).
  13. de la Torre-Ubieta, L., Won, H., Stein, J. L., Geschwind, D. H. Advancing the understanding of autism disease mechanisms through genetics. Nature Medicine. 22 (4), 345-361 (2016).
  14. Scheffner, M., Staub, O. HECT E3s and human disease. BMC Biochemistry. 8, Suppl 1 (2007).
  15. Cooper, E. M., Hudson, A. W., Amos, J., Wagstaff, J., Howley, P. M. Biochemical analysis of Angelman syndrome-associated mutations in the E3 ubiquitin ligase E6-associated protein. Journal of Biological Chemistry. 279 (39), 41208-41217 (2004).
  16. Yi, J. J., Barnes, A. P., Hand, R., Polleux, F., Ehlers, M. D. TGF-beta signaling specifies axons during brain development. Cell. 142 (1), 144-157 (2010).
  17. Yi, J. J., et al. The autism-linked UBE3A T485A mutant E3 ubiquitin ligase activates the Wnt/beta-catenin pathway by inhibiting the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 292 (30), 12503-12515 (2017).
  18. Weston, K. P., et al. Identification of disease-linked hyperactivating mutations in UBE3A through large-scale functional variant analysis. Nature Communications. 12 (1), 6809(2021).
  19. Hand, R., Polleux, F. Neurogenin2 regulates the initial axon guidance of cortical pyramidal neurons projecting medially to the corpus callosum. Neural Development. 6, 30(2011).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nature Biotechnology. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Biechele, T. L., Moon, R. T. Assaying beta-catenin/TCF transcription with beta-catenin/TCF transcription-based reporter constructs. Methods in Molecular Biology. , 99-110 (2008).
  22. Yi, J. J., et al. An Autism-linked mutation disables phosphorylation control of UBE3A. Cell. 162 (4), 795-807 (2015).
  23. Kuhnle, S., et al. Angelman syndrome-associated point mutations in the Zn(2+)-binding N-terminal (AZUL) domain of UBE3A ubiquitin ligase inhibit binding to the proteasome. Journal of Biological Chemistry. 293 (47), 18387-18399 (2018).
  24. Yamamoto, Y., Huibregtse, J. M., Howley, P. M. The human E6-AP gene (UBE3A) encodes three potential protein isoforms generated by differential splicing. Genomics. 41 (2), 263-266 (1997).
  25. Avagliano Trezza, R., et al. Loss of nuclear UBE3A causes electrophysiological and behavioral deficits in mice and is associated with Angelman syndrome. Nature Neuroscience. 22 (8), 1235-1247 (2019).
  26. Bossuyt, S. N. V., et al. Loss of nuclear UBE3A activity is the predominant cause of Angelman syndrome in individuals carrying UBE3A missense mutations. Human Molecular Genetics. 30 (6), 430-442 (2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ubikitin LigazAngelman SendromuOtizm SpektrumuHücre Tabanlı AnalizHEK293T HücreleriLüsiferaz ReporterıBAR AnaliziMutasyonel Analiz
Ube3a Varyantlarının İşlevsel Değerlendirmesi için Ölçeklenebilir, Hücre Tabanlı Bir Yöntem
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.