Yöntem makalesi

Amniyotik membrandan Lumikan ekstraksiyonu ve depolama sıcaklığının belirlenmesi

DOI:

10.3791/64460

⸱

14 Ekim 2022

 ,  ,  , 
1Instituto de Oftalmologia Fundacion Conde de Valenciana IAP, 2Biochemistry Department, Medicine Faculty, Universidad Nacional Autónoma de Mexico

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, lumikanın amniyotik membrandan () ekstraksiyonunu ve depolama koşullarını, proteinlerini ve lumikan konsantrasyonunu ölçmek için -20 ° C, 4 ° C'de ekstraktı (AME) ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca oda sıcaklığında (RT) olarak tanımlamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lumikan, insan amniyotik membranında () kornea epitelizasyonunu ve kollajen liflerinin organizasyonunu teşvik eden, kornea saydamlığını koruyan küçük bir lösin bakımından zengin proteoglikandır. Bu çalışmada, lumikan elde etmek için'den protein ekstraksiyonu için bir yöntem önerilmiştir. Ek olarak, farklı sıcaklık ve zaman periyotlarında depolanan ekstraktındaki (AME) lumikanın stabilitesi değerlendirilir. 100 mg çözüldü ve mekanik olarak epitelden arındırıldı. Deepitelize edilmiş, proteaz inhibitörleri ile 2.5 mL salin tamponu ile çözündürülen ve protein ekstraksiyonu için santrifüj edilen ince bir toz elde edilene kadar donduruldu ve ezildi. Süpernatant toplandı ve 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca -20 ° C, 4 ° C ve oda sıcaklığında (RT) saklandı. Daha sonra, lumican her AME'de nicelleştirildi. Bu teknik,'den lumikan ekstraksiyonu için erişilebilir ve edinilebilir bir protokol sağlar. Lumikan konsantrasyonu depolama süresi ve sıcaklık koşullarından etkilendi. -20 ° C ve 4 ° C'de depolanan 12 günlük AME'deki Lumikan, diğer AME'lerden önemli ölçüde daha yüksekti. Bu lumican ekstraksiyonu, tedaviler ve farmasötik çözeltiler geliştirmek için yararlı olabilir. AME lumikan'ın reepitelizasyon ve yara iyileşme sürecindeki kullanımlarını belirlemek için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kornea etkileri için en çok kullanılan tedavilerden biri amniyotik membran transplantasyonudur; ancak son yıllarda amniyotik dokunun çeşitli bileşenlerinin alternatif ve adjuvan tedaviler olarak kullanılması için yeni öneriler ortaya çıkmıştır. 'nin en çok çalışılan bileşenleri arasında ekstraktından (AME) elde edilenler 1,2,3,4,5,6,7'dir. , antianjiyojenik proteinler, interlökinler (IL), metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'ler), nötrofil hücre dışı tuzaklarını inhibe eden TSG-6'nın aracılık ettiği anti-enflamatuar proteinler, büyüme faktörleri: epidermal büyüme faktörü (EGF), dönüştürücü büyüme faktörü (TGF) (alfa ve beta), keratinosit büyüme faktörü (KGF), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve kollajen fibrillogenezidüzenleyerek kornea saydamlığını koruyan lumikan gibi çoklu çözünür faktörler içerir 1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Lumikan, kornea stroma matriksindeki interstisyel kollajenazın ana hücre dışı bileşenlerinden biri olan, kollajen liflerinin organize edilmesinden ve kornea saydamlığının korunmasından sorumlu olan küçük lösin bakımından zengin bir proteoglikan (SLRP) 4,10,11'dir. Proteoglikanlar, hücre dışı matriksteki (ECM) moleküllerdir ve hücre içi sinyalizasyonun gerçekleştirilmesinde ve hücre içi homeostazın korunmasında ana moleküllerdir12. ECM proteinlerinin yara iyileşmesi sırasında proliferasyon, farklılaşma ve göçün hücresel süreçlerini yönlendirdiği bildirilmiştir11.

Kanıtlar, lumikanın kornea reepitelizasyonu sürecine olası katılımını göstermektedir. Saika ve ark., bir çalışmada, kornea yaralanmasından sonra, kornea keratositlerinde lumikanın ilk 8 saat ile yaralanmadan sonraki 3 gün arasında tespit edilebileceğini göstermiştir. İkinci ve üçüncü günde en yüksek lumikan konsantrasyonunu sunan bu proteoglikan daha sonra yedinci gün13'te tespit edilemez. Bu veriler, lumikanın kornea reepitelizasyon sürecinin aktivasyonuna katılımını göstermektedir. Öte yandan, başka bir çalışmada, lumikan yokluğunun yeniden epitelizasyonu geciktirdiği; İlginçtir ki, lumikan eklenmesi yeniden epitelizasyon sürecini hızlandırabilir 4,11,13. Benzer şekilde, yakın tarihli bir çalışma, lumikanın kornea limbus fibroblastlarının14'ünün enflamatuar fonksiyonlarını modüle edebildiğini bildirmiştir, bu da lumikanın enflamatuar, antifibrotik ve yeniden epitelleştirici yanıtın bir modülatörü olarak rol oynadığını düşündürmektedir. Benzer şekilde, lumikan, Fas-FasL gibi sinyal molekülleriyle etkileşime girerek kornea tepkisini modüle edebilir. Ayrıca, nakavt bir Lum-/- fare modelinde lumikanın bulunmaması, lumikan sinyalinin eksikliğinin yeterli kornea onarımını engellediğini göstermiştir15.

Öncelikle, bu yöntem lumikanı'den çıkarmanın uygulanabilir ve ulaşılabilir bir yolunu göstermeyi amaçlamaktadır. Bu avantajlı lumikan ekstraksiyonu yöntemiyle, benzer konsantrasyonlarda protein elde etmek, işlem süresini azaltmak ve önceki çalışmalara kıyasla araştırmacılar için daha uygun hale getirmek mümkündür16. Ayrıca, bu AME lumikanı kornea onarımı ve yeniden epitelizasyon işlemleri için bir adjuvan olarak kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler Kurumsal Gözden Geçirme Kurulu tarafından onaylanmıştır (Proje No. CEI-2020/06/04). , Chavez-García ve ark.17 tarafından tanımlandığı gibi hazırlanan Instituto de Oftalmologia Conde de Valenciana amniyon bankasından (tanımlanmamış insan deneklerden) elde edilmiştir.

1. Amniyotik membran ekstraktının hazırlanması

  1. Amniyon bankasından 100 mg alın.
    NOT: Önceki bir rapora göre, 50 mg toplam 10 ng / mL lumican14 salgılar. Daha yüksek bir lumikan konsantrasyonu elde etmek için, toplam 32cm2'lik bir alana eşdeğer 100 mg kullanın.
  2. donmuşsa, oda sıcaklığında çözün.
    NOT: Laminer davlumbaz sınıf II B altında aşağıdaki prosedürleri uygulayın.
  3. 'yi 10 mL steril dengeli tuz çözeltisi (BSS, Malzeme Tablosuna bakınız) ile bir Petri kabında 2 dakika boyunca yıkayın.
    1. BSS'yi bir beherin içine dökün.
    2. 3. adımı tekrarlayın ve Petri kabı BSS'de gliserol ortamının bulunmadığını görsel olarak onaylayın.
      NOT: 3. adımı yineleyin. Petri kabı BSS'de gliserol ortamı bulunmayana kadar gerektiği gibi.
  4. 'yi 37 °C'de 10 mL dispase II (1.7 IU / mL, bakınız Malzeme Tablosu) ile inkübe edin, 30 dakika boyunca% 5 CO2 .
    NOT: Dispase II, epitel hücreleri üzerinde nazik aktiviteye sahip nötr bir proteazdır. Bu enzim, sağlam epidermisi dermisten etkili bir şekilde ayırır ve sağlam epitel tabakalarını izole eder18.
  5. Dispase inkübasyonundan sonra, bir lastik polis memuru ile mekanik bir deepitelizasyon14 gerçekleştirin (bkz. Mikroskopi görselleştirme ile deepitelizasyonu onaylayın.
    NOT: Epitelizasyonun giderilmesi işlemi, 4x ve 20x hedefleri kullanılarak ters çevrilmiş bir mikroskopta doğrulanır. Herhangi bir hücresel tabakanın varlığını dışlamak için dokuyu görselleştirin.
  6. 'yi 2 dakika boyunca 10 mL BSS içeren bir Petri kabında yıkayın. BSS'yi bir beherin içine dökün.
  7. Epitelize edilmiş'yi (dAM) 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. dAM'yi 40 dakika boyunca sıvı azot içine batırın.
  8. Dondurulmuş dAM'yi, ince bir toz elde edilene kadar -85 ° C'de önceden soğutulmuş bir harçta 2-3 dakika boyunca manuel olarak topraklayın.
  9. Harçta, dAM tozunu 2.5 mL proteaz inhibitörü çözeltisi (proteaz inhibitörleri ile BSS) ile çözün.
    NOT: Her proteaz inhibitörü tableti aşağıdaki enzim karışımından oluşur: pankreas ekstresi (0.02 mg / mL), termolizin (metalloproteaz) (0.0005 mg / mL), kimotripsin (0.002 mg / mL), tripsin (0.02 mg / mL) ve papain (0.33 mg / mL) (bkz.
  10. Karışımı bir mikropipetle toplayın ve harç duvarlarını bir neşter bıçağı yardımıyla temizleyin. Karışımı 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
  11. 30 s boyunca vorteks ile iyice karıştırın.
  12. Doku karışımını 4 °C'de 20 dakika boyunca 34 x g'de santrifüj yaparak homojenize edin ve 4 °C'de 20 dakika boyunca 3360 x g'de hemen santrifüj yapın.
  13. Toplanan süpernatant AME'dir (Şekil 1). Her bir AME'nin 0,7 mL'sini farklı 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde 6, 12, 20 ve 33 gün boyunca -20 °C, 4 °C ve oda sıcaklığındaki (RT) farklı sıcaklık koşullarında saklayın.

figure-protocol-1
Şekil 1: AME hazırlama ve lumikan konsantrasyonu ölçümü işlemi . 100 mg, 30 dakika boyunca 37 ° C'de dispase II ile inkübe edildi ve mekanik olarak epitelden arındırıldı. Epitelden arındırılmış yıkandı ve 40 dakika boyunca sıvı azota batırıldı ve daha sonra proteaz inhibitörleri ile 2.5 mL salin tamponu ile çözündürülen ve santrifüj edilen ince bir toz elde edilene kadar ezildi. Süpernatant, toplam protein ve lumikan kantitasyonuna kadar 6, 12, 20 ve 32 gün boyunca -20 ° C, 4 ° C ve RT'de toplandı ve saklandı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. AME protein niceliği

NOT: AME'deki toplam proteinin miktarı, obtensiyondan hemen sonra yapılmalıdır. Lowry protein tahlili kullanarak proteinleri ölçün ve üreticinin talimatlarını izleyin (bkz. Tüm standartların ve numunelerin üçlü olarak test edilmesi önerilir.

  1. Her bir AME örneğinin 40 μL'sini 96 delikli bir mikro plakaya pipetleyin.
    1. 0-1.500 μg/mL'lik (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1.000 ve 1.500 μg/mL) nihai BSA konsantrasyonu için sığır serum albümini (BSA) standardını kullanarak aynı mikroplakaya standart bir eğri hazırlayın.
  2. Her bir kuyucuğa modifiye edilmiş Lowry reaktifinin 200 μL'lik pipeti. Hemen 30 s boyunca bir plaka karıştırıcı üzerinde karıştırın.
  3. Mikro plakayı alüminyum folyo ile örtün ve RT'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Her bir kuyucuğa 20 μL 1x Folin-Ciocalteu reaktifi pipeti. Hemen 30 s boyunca bir plaka karıştırıcı üzerinde karıştırın.
    NOT: 1x Folin-Ciocalteu reaktifi hazırlamak için, 2x (2N) reaktif 1:1'i ultra saf su ile seyreltin. Seyreltilmiş reaktif kararsız olduğu için aynı kullanım gününde 1x Folin-Ciocalteu reaktifi hazırlayın.
  5. Mikro plakayı ışıktan alüminyum folyo ile örtün ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Bir ELISA plaka spektrometresinde 660 nm'de numunelerin emilimini ölçün (bkz.
    NOT: Renk, 650 nm ile 750 nm arasındaki dalga boylarında ölçülebilir.
  7. Standart boş numunelerin 660 nm absorbans değerinin ortalamasını alın ve standart ve bilinmeyen numunelerin diğer 660 nm değerlerinden çıkarın.
    1. Absorbansı, 10 saniye boyunca düşük sarsıntıya sahip bir uç nokta modunda bir ELISA plaka spektrometresi ile ölçün.
  8. Bilinmeyen her numunenin protein konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi kullanın.
  9. Proteinin hesaplanması için, her standart BSA eğrisinin X eksenindeki mg / mL cinsinden konsantrasyonlara karşı Y eksenindeki absorbans değerlerini kullanarak doğrusal bir regresyon grafiğinden konsantrasyonu belirleyin.
    1. Protein konsantrasyonunu hesaplamak için doğrusal regresyon ve r değeri denklemini elde edin.
      NOT: Sonuçlar, toplam proteinin mg AM'ye (μg / mL protein / mg AM dokusu) göre normalleştirilmiş bağıl konsantrasyon değerleri olarak ifade edilir.

3. AME'de Lumikan'ın nicelleştirilmesi

NOT: Lumikan konsantrasyonu, farklı depolama koşullarında ve zaman periyotlarında depolanan AME'de ölçülmelidir. Sandviç ELISA kullanarak lumikanı ölçün ve üreticinin talimatlarını izleyin. Tüm standartların ve numunelerin mükerrer olarak test edilmesi önerilir.

  1. İnsan lumikanı yakalama antikorunu (bakınız Malzeme Tablosu) fosfat tamponlu salin (PBS) içindeki kullanılan konsantrasyona göre seyreltin.
    NOT: Yakalama antikoru şişesi 120 μg antikor içerir. 0.5 mL PBS ile sulandırıldıktan sonra, yakalama antikorunu 2 μg / mL'lik bir çalışma çözeltisinde seyreltin.
    1. Seyreltilmiş yakalama antikorunun kuyucuğu başına anında 100 μL'yi 96 delikli bir mikro plakaya pipetleyin. Plakayı kapatın ve RT'de gece boyunca inkübe edin.
  2. Her bir kuyucuğu aspire edin ve 300 μL yıkama tamponu ile pipetleyerek yıkayın: PBS'de% 0.05 polioksietilen sorbitan monolaurat 20, pH 7.2-7.4 (bkz. Üç kez tekrarlayın.
    NOT: Son yıkamadan sonra, kalan yıkama tamponunu plakayı her zaman sabitleyerek çıkarın ve kağıt havlulara hafifçe dokunun.
  3. 300 μL reaktif seyreltici ekleyerek plakaları bloke edin: PBS'de% 1 BSA, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtrelenmiş (bkz. RT'de 1 saat boyunca inkübe edin.
  4. 2. adımı yineleyin.
  5. 125, 250, 500, 1.000, 2.000, 4.000 ve 8.000 pg/mL'lik nihai konsantrasyonlar için 0-8.000 pg/mL'den iki kat seri seyreltme kullanarak 96 delikli bir mikro plakaya standart bir eğri hazırlayın. ELISA lumican kiti, 75 ng'lik bir rekombinant lumikan standardı içerir (bkz.
  6. 100 μL numune ve yakalama antikoru kaplı 96 delikli mikroplakaya standart eğri ekleyin.
  7. Mikro plakayı örtün ve hızı 2-3 rpm arasında tutan kompakt bir rocker'da düşük ajitasyonla RT'de 2 saat boyunca inkübe edin.
  8. 2. adımı yineleyin.
  9. Her bir oyuğa 100 μL biyotinillenmiş tespit antikoru ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Işıktan koruyun ve RT'de 2 saat inkübe edin ve hızı 2-3 rpm arasında tutan kompakt bir rocker'da düşük ajitasyonla inkübe edin.
    NOT: Biyotinile tespit edilen antikor şişesi 24 μg antikor içerir. 1.0 mL reaktif seyreltici ile sulandırıldıktan sonra, biyotinile tespit antikorunu 400 ng / mL'lik bir çalışma çözeltisinde seyreltin.
  10. 2. adımı yineleyin.
  11. Her bir kuyucuğa streptavidin-yaban turpu peroksidazının (HRP, Malzeme Tablosuna bakınız) çalışma seyreltmesinin 100 μL'sini ekleyin. Mikro plakayı ışıktan örtün ve RT'de 20 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Reaktif streptavidin-HRP 40 kat konsantreydi. 1x streptavidin-HRP iş çözeltisi reaktif seyreltici ile yapıldı.
    NOT: Plakayı doğrudan ışığa yerleştirmekten kaçının.
  12. 2. adımı yineleyin.
  13. Son olarak, her bir kuyucuğa 100 μL substrat tetrametilbenzidin (TMB, bakınız Malzeme Tablosu) çözeltisi ekleyin.
    NOT: TMB çözeltisini, kit içinde sağlanan eşit hacimli stabilize hidrojen peroksit% 30 çözeltisi ile hazırlayın.
    NOT: Çözeltiyi kullanmadan hemen önce hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.
  14. RT'de karanlık bir yerde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
    NOT: Plakayı doğrudan ışığa yerleştirmekten kaçının. Daha fazla yıkamaya gerek olmadığı için TMB solüsyonunu aspire etmeyin.
  15. Kolorimetrik reaksiyonu durdurmak için 50 μL 1NH2SO4 durdurma çözeltisi ekleyin. Tam karıştırmayı sağlamak için plakaya hafifçe dokunun.
  16. Bir ELISA plaka spektrometresinde 450 nm'ye ayarlanmış bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir kuyucuğun emiciliğini hemen belirleyin.
  17. Absorbansı, 10 saniye boyunca düşük sarsıntıya sahip bir uç nokta modunda bir ELISA plaka spektrometresi ile ölçün.
  18. Standart boş numunelerin 450 nm absorbans değerinin ortalamasını alın ve standart ve bilinmeyen numunelerin diğer 450 nm değerlerinden çıkarın.
  19. Bilinmeyen her numunenin lumikan konsantrasyonunu belirlemek için standart eğriyi kullanın.
  20. Lumikan konsantrasyonunun hesaplanması için, her standart lumikan eğrisinin X eksenindeki pg/mL cinsinden konsantrasyonlara karşı Y eksenindeki absorbans değerlerini kullanarak doğrusal bir regresyon grafiği oluşturun.
    1. Lumikan konsantrasyonunu hesaplamak için doğrusal regresyon ve r değeri denklemini elde edin.
      NOT: Lumikan konsantrasyonu, ekstrakte edilen doku mg'ına göre normalleştirildi. Sonuçlar, lumikanın mg'ye (ng/mL lumikan/mg dokusu) normalize edilmiş bağıl konsantrasyon değerleri olarak ifade edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonuçlar standart sapmanın (SD) ortalama değeri ± olarak raporlanır. Öğrencinin t-testleri ve varyans analizi (ANOVA) yapıldı. 0.05 < P değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel analiz, istatistik yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).

AME'deki toplam protein miktarı zaman ve depolama koşullarından etkilenmiştir. Bazal protein konsantrasyonu tüm AME arasında benzerdi; toplam protein aralığı, değerlend...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, AME'de lumikanın varlığı ve farklı depolama koşulları altındaki stabilitesi ile doğrudan ilişkisi analiz edilmiştir. İlginç bir şekilde, AME'deki toplam protein konsantrasyonu ölçüldüğünde, protein konsantrasyonu depolamadan sonra artmıştır. Kanıtlar, dondurulmuş depodaki protein konsantrasyonunu değiştirebilecek üç mekanizma önermektedir: soğuk denatürasyon, çözünenlerin dondurulmuş konsantrasyonu ve protein yapısının buzla indüklenen kısmi açılması19. Dondurma işlemi, numunedeki sı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çalışma, Universidad Nacional Autonoma de Mexico Araştırma ve Teknolojik İnovasyon Projeleri Destek Programı (Hibe No. PAPIIT IN203821) ve Eğitim, Bilim, Teknoloji ve İnovasyon Bakanlığı (Hibe No. SECTEI 250/2019) tarafından finanse edilmiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 N H < alt > 2 < / alt > SO< alt > 4< / alt> durdurma çözümüR& D SistemleriDY994
100 μ L mikropipetEppendorf
1000 μ L mikropipetEppendorf
15 mm Petri kabıSymlaboratorios
18 G İğne (1,2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 
2 mL mikrosantrifüj tüpüEppendorfZ606340
20 mL plastik şırınga BD Becton Dickinson 
302562 20 & mu; L mikropipetEppendorf
20-200 μ L mikropipetEppendorf
5 mL mikrosantrifüj tüpüEppendorf30119401
96 oyuklu mikroplakaSARSTEDT821581
Alüminyum folyoN/AN/A
Amniyotik membranInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Dengeli tuz çözeltisiBausch + LombBSS-403802
BeherN/AN/A
BioRender BioRenderfigür tasarımı 
Kompakt RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
eksiksiz, EDTA içermeyen, Proteaz inhibitörü
kokteyl tabletleri		Roche11 873 580 001Proteaz İnhibitörü
Daiggner girdap Genie 2A.Daigger & Co., INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plaka spektrometresiThermo Labsystems & nbsp;35401106
Multiscan Dondurucu
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversiyon 9istatistiksel analiz ve grafik programı 
İnsan lumican DuoSet ELISA kitiR& D SystemsDY2846-05, insan Lumican yakalama antikoru
İnkübatörünü içerir ve nbsp;Forma Bilimsel 3326 S/N 36481-7002
Ters Işık MikroskobuOlympus 6A13921de-epitelizasyonu doğrulamak için  Mod.CK2
Laminer akış başlığıForma Scientific 14753-567Mod.1184
Sıvı nitrojenN/AN/A
HarçN/AN/A
Çok kanallı pipetleyiciEppendorf
Azot TankıThermo ScientificMod. Biocan 20
Kağıt havluN/AN/A
Fosfat tamponlu tuzlu su ürünleriR& D SystemsDY006
Pierce Modifiye Lowry Protein Test KitiThermo Scientific23240
Plaka kapatıcılarR& D SystemsDY992
Reaktif seyrelticiAr-Ge D SistemleriDY995PBS'de% 1 BSA, pH 7.2-7.4, 0.2 & mu; m filtreli
Soğutmalı santrifüjcenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Kauçuk polis hücre sıyırıcıNEST710001mekanik de-epitelizasyon için
Neşter bıçağıBraunBB521No. 10 veya 21
Streptavidin-HRP 40 kat konsantre ve nbsp;Ar-Ge D Systemsbölüm 893975
Substrat tetrametilbenzidin (TMB) çözeltisiR& D SystemsDY999
Dişli cımbızInvent Germany6binox 
Ultra saf suPISA
Yıkama tamponuR& D SistemleriWA126PBS'de %0,05 Tween 20, pH 7,2-7,4
305211

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
  2. Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
  3. Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
  4. Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).
  5. Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
  6. Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426(2017).
  7. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
  8. Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
  9. Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
  10. Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
  11. Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
  12. Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
  13. Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
  14. Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
  15. Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).
  16. Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
  17. Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
  18. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  19. Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
  20. McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).
  21. Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
  22. Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
  23. Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
  24. Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
  25. Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
  26. Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
  27. Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
  28. Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
  29. Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  30. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein EkstraksiyonuKorneal EpitelizasyonMekanik De epitelizasyonProteaz nhibit rleriS v Azotla DondurmaSantrif gasyon Tekni iAmniyotik Membran Ekstresi

İlgili makaleler