Method Article

Uzun Süreli ve Kısa Süreli Hematopoetik Kök Hücreler için İzolasyon Yöntemi

DOI:

10.3791/64488

⸱

May 19th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak uzun süreli hematopoetik kök hücrelerin (LT-HSC'ler) ve kısa süreli HSC'lerin (ST-HSC'ler) izolasyonu için adım adım bir protokol sunuyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendini yenileme kapasitesi ve çok soylu farklılaşma potansiyeli genellikle hematopoetik kök hücrelerin (HSC) tanımlayıcı özellikleri olarak kabul edilir. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, HSC kompartmanında fonksiyonel heterojenitenin var olduğunu ileri sürmüştür. Son zamanlarda yapılan tek hücreli analizler, HSC bölmesinde farklı hücre kaderlerine sahip HSC klonlarını bildirmiştir ve bunlar önyargılı HSC klonları olarak adlandırılmaktadır. Heterojen veya kötü tekrarlanabilir sonuçların altında yatan mekanizmalar, özellikle saflaştırılmış HSC fraksiyonları konvansiyonel immün boyama ile nakledildiğinde kendini yenilemenin uzunluğu ile ilgili olarak çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, uzun vadeli HSC'ler (LT-HSC'ler) ve kısa vadeli HSC'ler (ST-HSC'ler) için, kendilerini yenileme süreleri ile tanımlanan tekrarlanabilir bir izolasyon yöntemi oluşturmak, bu sorunun üstesinden gelmek için çok önemlidir. Tarafsız çok adımlı tarama kullanarak, fare hematopoetik sistemindeki LT-HSC'lerin özel bir belirteci olabilecek bir transkripsiyon faktörü olan Hoxb5'i tanımladık. Bu bulguya dayanarak, bir Hoxb5 muhabir fare hattı oluşturduk ve LT-HSC'leri ve ST-HSC'leri başarıyla izole ettik. Burada, Hoxb5 muhabir sistemini kullanarak LT-HSC'lerin ve ST-HSC'lerin izolasyonu için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu izolasyon yöntemi, araştırmacıların kendini yenileme mekanizmalarını ve HSC bölmesindeki bu heterojenliğin biyolojik temelini daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kendini yenileme kapasitesine ve multipotensine sahip hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), hematopoetik hiyerarşi 1,2'nin zirvesinde yer almaktadır. 1988'de Weissman ve meslektaşları ilk kez fare HSC'lerinin izolasyonunun akış sitometrisi3 kullanılarak sağlanabileceğini gösterdi. Daha sonra, hücre yüzey belirteçlerinin bir kombinasyonu ile tanımlanan bir fraksiyonun, Lineage-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / loFlk2 −, farelerde tüm HSC'leri içerdiği bildirildi 4,5,6,7,8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan tüm hayvan deneyleri RIKEN Biyosistem Dinamiği Araştırma Merkezi tarafından onaylanmıştır.

1. Alıcı farelerin ön koşullandırması

  1. 8-10 haftalık erkek C57BL/6 konjenik fareleri alıcı fareler olarak hazırlayın. Alıcı farelerin sayısı deneysel protokole bağlıdır. Genellikle her durum için 10-20 fare hazırlarız.
    1. Fareleri enrofloksasin (170 mg / L) ile desteklenmiş sterilize edilmiş suyla besleyin. Işınlanmış alıcı fareler enfeksiyona karşı oldukça hassas olduklarından, kafesleri mümkün olduğunca temiz tutun.
      NOT: Antibiyotiklerle takviye, ışınlamadan 24 saat önce başlar ve enfeksiyonları önlemek içi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceden, kendini yenileme kapasitesi, donör HSC'lerin kendilerini yenileme kapasitelerini ancak alıcı periferik kandaki çok soylu donör hücreleri gözlenirse korudukları düşünülen rekabetçi transplantasyon testleri kullanılarak ölçülmüştür17. Ek olarak, birkaç rapor LT-HSC'leri ikinci kemik iliği transplantasyonundan birkaç ay sonra periferik kan hücreleri üretmeye devam eden hücreler olarak tanımlamaktadır10,18. Bu nedenle, kendilerini yen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geleneksel olarak, hücre yüzey belirteci tanımlı HSC'ler, HSC'lerin kendini yenileme kapasitesi ve çoklu potens 19,20,21 gibi işlevlerini incelemek için hazırlanmıştır. Bununla birlikte, immünofenotipik olarak tanımlanan (Soy-c-Kit + Sca-1 + CD150 + CD34 − / loFlk2 −) HSC fraksiyonu iki ayrı HSC popülasyonu içerir: LT-HSC'ler ve ST-HSC'ler 9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma ile ilişkili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiroshi Kiyonari'ye hayvan bakımı ve RIKEN BDR'de alıcı fareler sağladığı için ve ayrıca Kobe Üniversitesi'nde laboratuvar yönetimi için Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka ve Masaki Miyahashi'ye minnettarız. Yazarlar ayrıca bu çalışma için devam eden desteği de büyük ölçüde takdir ediyorlar. Masanori Miyanishi, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği (JSPS) KAKENHI Hibe Numaraları JP17K07407 ve JP20H03268, Mochida Memorial Tıbbi ve Farmasötik Araştırma Vakfı, Japonya Yaşam Bilimleri Vakfı, Takeda Bilim Vakfı, Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı ve AMED-PRIME, AMED tarafından JP18gm6110020 Hibe Numarası altında desteklenmiştir. Taro Sakamaki, JSPS KAKENHI Hibe Numaraları....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,2 mL 8 tüplü şerit, kubbe kapağıSSIbio3230-00
0,5M EDTA pH 8.0IinvtrogenAM9260G
100 & mikro; m Hücre SüzgeciFalcon352360
30G insülin şırıngasıBD326668
40 & mikro; m Hücre SüzgeciFalcon352340
5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Çıtçıtlı KapaklıFALCON352235
7-AAD Canlılık Boyama ÇözeltisiBioLegend420404
96 kuyulu U-TabanlıFALCON351177
Anti-APC-Mikro BoncuklarMilteny biotec130-090-855
Tuzaklı Aspiratör şişeBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotin (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6. CD45.1 konjenik fareler Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril %10BAYER341106546
BD FACS Aria II özel sipariş sistemi BDN/A
Parlak leke tamponuBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotin (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotin (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 konjenik farelerN/AN/ALaboratuvarımızda Yetiştirildi
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotin (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotin (53-6.7)BioLegend100704
Santrifüj Tüpü 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Santrifüj Tüpü 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Ca
D-PBS (-), sıvı Nacalai14249-24
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo sürüm 10BD Biosciences 
Gmmacell 40 ExactorEn iyi theratronikN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mKiraz fareleri (C57BL/6J arka plan) Laboratuvarımızda
IgG sıçan serumu, teknik sınıf, >=80% (SDS-PAGE), tamponlu sulu çözeltiSigma-AldrichI8015-100MG
izofluranPfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON KAĞIT CRECIA 6-6689-01
LS SütunlarıMilteny biotec130-042-401
Lizis tamponu BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Doku Kültürü için Mikroplaka (Yapışma Hücresi için) 6WellIWAKI3810-006
MidiMACS AyırıcıMilteny biotec130-042-302
Fare PastaKafesleri Natsume SeisakushoKN-331
Çok Amaçlı Soğutmalı SantrifüjTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penisilin-Streptomisin Karışık Çözeltisinacalai26253-84
Porselen Harç & phi; Havaneli Asone6-549-03
Protein LoBind Tüpü ile 120mm 1.5 mL Eppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Paslanmaz çelik neşter bıçağıFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Fareler için Tailveiner Sınırlayıcı standartBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotin (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5ml Konsantrik Luer-Slip ŞırıngaTERUMOSS-05LZ
Terumo Hipodermik İğne 23G x 1TERUMONN-2325-R
ve Mg içermeyen canlandırıcı 47117182 https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hematopoietic Stem CellsLong Term HSCsShort Term HSCsHoxb5 Reporter MiceFlow CytometryBone Marrow IsolationSelf Renewal MechanismsCell SortingLineage Negative CellsMulti Lineage Differentiation

Related Articles