Yöntem makalesi

Saccharomyces cerevisiae'de 5-Etinil-2'-deoksiüridin Kullanımı Kullanılarak S-Faz Süresinin Belirlenmesi

DOI:

10.3791/64490

⸱

21 Ekim 2022

 ,  , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İn vivo olarak dahil edilen ve mikroskopi ve akış sitometrisi ile Click kimyası kullanılarak tespit edilen bir timidin analoğu olan EdU'yu kullanarak S. cerevisiae'deki S-faz süresini doğru bir şekilde belirlemek için iki tamamlayıcı protokol tanımladık. DNA replikasyon süresinin ve mutantlarda gözden kaçan replikasyon kusurlarının kolay karakterizasyonuna izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik DNA replikasyonu, bir hücrenin genetik planının kromozom ayrışmasından önce doğru şekilde kopyalanmasını sağlayan yüksek oranda düzenlenmiş bir süreçtir. DNA sentez kusurları kromozom yeniden düzenlemelerinin altında yattığından, DNA replikasyonunu izlemek, genom instabilitesinin temelini anlamak için gerekli hale gelmiştir. Saccharomyces cerevisiae , hücre döngüsü düzenlemesini incelemek için klasik bir modeldir, ancak S fazındaki hücrelerin fraksiyonu veya S-faz süresi gibi anahtar DNA replikasyon parametrelerinin belirlenmesi hala zordur. Bu protokol, mühendislik TK-hENT1 maya hücrelerinde bir timidin analoğu olan 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) kısa ve toksik olmayan darbelerini kullanır, ardından mikroskopi ve akış sitometrisi ile hem tek hücreli hem de popülasyon seviyelerinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte DNA replikasyonunun görselleştirilmesine ve nicelleştirilmesine izin vermek için Click reaksiyonu ile tespit edilir. Bu yöntem, S fazında ve maya mutantlarının hücre döngüsü ilerlemesinde daha önce göz ardı edilen kusurları tanımlayabilir, böylece genom stabilitesini sağlamak için gerekli olan yeni oyuncuların karakterizasyonuna izin verebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitotik bölünme yoluyla genom stabilitesi, üretilen iki hücre progenisine tam ve eşit bir kromozom setinin iletilmesiyle sağlanır. Bu, hücre döngüsünün her aşamasında belirli bir zamanda meydana gelen bir dizi olayın doğru bir şekilde tamamlanmasına dayanır. G 1'de, çoğaltma kaynakları, Cdc61 de dahil olmak üzere çeşitli lisanslama faktörlerinin işe alınması üzerine lisanslanır. S fazında, tüm genom duplikasyonu, çoklu aktif replikasyon kökenlerinden başlatılır ve replikasyon fabrikaları2 olarak adlandırılan mikroskobik olarak görünür odaklarda toplanan replikasyon makineleri tarafından gerçekleştirilir. M fazında, kopyalanmış kardeş kromatitler, mitotik hücre3'ün zıt kutuplarına ayrılmalarına izin vermek için mitotik iğ üzerine bağlanır ve çift yönlendirilir. Her fazın düzenlenmesi, uygun şekilde tamamlanması ve süresi, genom stabilitesini sağlamak için anahtardır. Gerçekten de, bu fazların herhangi birinden erken çıkış genom instabilitesine yol açar. Örneğin, tomurcuklanan maya CDK inhibitörü Sic1'in silinmesi veya G1 siklinlerinin aşırı ekspresyonu ile indüklenen daha kısa birG1, sonraki S fazı 4,5,6'yı değiştirecektir. Sonuç olarak, replikasyon stresi ile ilişkili olsun ya da olmasın, bu deregülasyonlar, kromozom kırılmalarına, yeniden düzenlemelere ve yanlış ayrışmaya neden olur 4,5,6. Bu nedenle, S fazının süresini ve daha geniş anlamda, hücre döngüsünün diğer fazlarının süresini izlemek, farklı mutantlarda ve farklı stresli koşullarda meydana gelen kusurları tanımlamak için çok önemli olabilir.

Hücre döngüsü faz süresini ölçmek için geleneksel bir yöntem, basit DNA içeriği akış sitometrisini (Şekil 1A) içerir ve popülasyonu1C ve2C zirvelerinden G 1, S ve G 2 + M faz fraksiyonlarına ayırmak için kullanılan bir uygulama algoritmasına (çoğu sitometri yazılımında mevcuttur) dayanır. Kesirler daha sonra7. zamanı ikiye katlayan nüfus ile çarpılır. Bununla birlikte, bu yöntem yalnızca tahmini değerleri verir, belirli bir fraksiyon içinde homojen bir hücre boyutu dağılımı gerektirir ve senkronize kültürlere uygulanamaz. Memeli hücrelerinde S-faz süresini incelemek için, EdU da dahil olmak üzere birkaç timidin analogu geliştirilmiş ve yaygın olarak kullanılmıştır. Hücre dışı ortamdan alımları ve timidin kinaz (bundan böyle TK olarak anılacaktır) tarafından fosforilasyonları, DNA polimerazlarının onları DNA sentezi (replikasyon, rekombinasyon, onarım) bölgelerinde birleştirmeleri için kullanılabilir hale getirir. Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde TK geninin yokluğunu atlamak için, maya suşları, herpes simpleks virüsü TK8 ve insan dengeleyici nükleozid taşıyıcısının (hENT1) 9'un kararlı ve kurucu ekspresyonuna izin verecek şekilde tasarlanmıştır. DNA'ya dahil edildikten sonra, EdU, alkinini kimyasal olarak azid modifiye florokromlarla birleştiren seçici Tıklama reaksiyonu yoluyla tespit edilir10.

Bu makale, DNA replikasyon süresini ve dinamiklerini ve ayrıca hücre döngüsünün diğer fazlarının süresini hassas bir şekilde görselleştirmek ve ölçmek için EdU ile asenkron ve senkron TK-hENT1 mühendislik hücrelerini nabız etiketlemek için optimize edilmiş iki kapsamlı protokol sunmaktadır. mikroskopi ve akış sitometrisi ile hem tek hücre hem de popülasyon seviyelerinde yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. S. cerevisiae hücre kültürü

NOT: Kullanılan maya suşları Tablo 1'de listelenmiştir

NOT: S-fazı süresi farklı şekillerde izlenebilir. Ele alınacak soruya bağlı olarak, hücrelerG1 tutuklamasını takiben asenkron veya senkron olarak büyütülebilir.

  1. Asenkron olarak büyüyen S. cerevisiae hücrelerinden
    NOT: Bu yöntem, asenkron olarak büyüyen bir hücre popülasyonunda S fazındaki hücrelerin yüzdesinin belirlenmesine izin verir. İki katına çıkma süresi belirlenerek, S fazının (ve diğer fazların) süresi tahmin edilebilir.
    1. S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL sentetik tam (SC) ortamda aşılayın.
      NOT: Konsantrasyon bir hücre sayacı ile ölçülür. İki katına çıkma sürelerini verimli bir şekilde hesaplamak için, kültürün hala üstel fazda olan bir gecelik kültürden (yani, ideal olarak 2 × 107 hücre / mL'nin altında) aşılanması önerilir. EdU tespiti verimli olmadığından zengin ortamda (YPD) büyüyen hücreler önerilmez.
    2. Ertesi gün, hücreleri 20 mL taze SC ortamında 5 × 105 hücre / mL'lik son konsantrasyonda seyreltin.
    3. Hücreleri 30 ° C'de, 120 rpm'de yatay sallanan bir su banyosunda kültürleyin.
    4. Hücre konsantrasyonunu 1 × 107 hücre / mL'ye ulaşana kadar her saat başı ölçün.
      NOT: Bu adım, hücre konsantrasyonunun zaman içindeki artışının grafiksel bir gösterimini yapmanıza olanak tanır. İki katına çıkma sürelerini hesaplamak için kullanılan formül Tablo 2'nin açıklamasında açıklanmıştır.
    5. Hücre konsantrasyonu yaklaşık 2 × 10 6-5 × 106 hücre / mL olduğunda EdU etiketlemesi için adım 2'ye paralel olarak ilerleyin.
  2. G1-senkronize S. cerevisiae hücrelerinden
    NOT: Bu yöntem, akış sitometrisi ve / veya mikroskopi analizleri yoluyla S fazının ne zaman başlayıp biteceğinin belirlenmesini sağlar.
    1. S. cerevisiae hücrelerini, 130 rpm'de orbital ajitasyon ile 30 ° C'de bir gece kültürü için düşük hücre konsantrasyonunda (5 × 104 hücre / mL) 10 mL SC ortamında aşılayın.
      NOT: Adım 1.1.1'den sonraki notlara bakın.
    2. Ertesi gün, hücreleri 20 mL taze SC ortamında 2 × 106-3 × 106 hücre / mL'lik son konsantrasyonda seyreltin.
    3. Suda seyreltilmiş 40 μL 1 mg / mL α faktörü ekleyin.
    4. Hücreleri 30 ° C'de 1 saat boyunca 130 rpm'de yörüngesel ajitasyon ile kültürleyin.
    5. Suda seyreltilmiş 40 μL 1 mg / mL α faktörünü tekrar ekleyin.
    6. Hücreleri 30 ° C'de 1 saat boyunca 130 rpm'de yörüngesel ajitasyon ile kültürleyin.
    7. G1 tutuklamasını izlemek için hücreleri bir ışık mikroskobu altında görselleştirin. Hücrelerin% 90'ından fazlası bir shmoo gösteriyorsa ve diğerleri yuvarlak, tomurcuklanmamış hücrelerse devam edin.
      NOT: Kullanılan arka plana bağlı olarak, shmoo görselleştirmeden önce hücrelerin sonikleştirilmesi önerilir. W303 arka planı için, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde 2x'i sonikleştirin.
    8. 1.500 × g'da 3 dakika santrifüj. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    9. Hücreleri 20 mL SC ortamında yeniden askıya alın.
    10. 1.2.8-1.2.9 arasındaki adımları bir kez yineleyin.
      NOT: α faktörü bu adımlarla yıkanır ve hücreler hücre döngüsünde serbest bırakılır. Alternatif olarak, α faktörü, bir vakum pompasına bağlı bir yan kollu şişe üzerine yerleştirilmiş bir huni kullanılarak maya hücrelerini 1.2 μm'lik bir nitroselüloz filtre ile filtreleyerek yıkanabilir.
    11. Her 5 dakikada bir 2 kez 1 mL hücre toplayın ve EdU etiketlemesi için adım 2'ye geçin.
      NOT: EdU ile iki tüpten yalnızca birinden gelen hücreleri darbeyle etiketleyin. Darbe etiketli olmayan hücreler, iki değişkenli propidium iyodür (PI)-EdU grafiğinde EdU-pozitif hücreleri EdU-negatif hücrelerden ayırt etmek için kullanılır.
    12. Serbest bırakıldıktan 30 dakika sonra suda seyreltilmiş 400 μL 1 mg / mL α faktörü ekleyin.
      NOT: Bu yüksek dozda α faktörü, bir sonraki hücre döngüsünün G1 fazındaki hücreleri durdurmak ve hücrelerin sonraki S fazına tekrar girmesini önlemek için gereklidir.

2. EdU etiketleme

  1. 1 mL hücre kültürünü, 1 μL 10 mM EdU içeren 2.0 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın. İnversiyon ile iyice karıştırın.
    NOT: PI-EdU iki değişkenli FACS'taki EdU-pozitif hücreleri EdU-negatif hücrelerden ayırmak için, 1 μL DMSO içeren 2.0 mL'lik bir mikrofüj tüpüne 1 mL hücre kültürü daha aktarın.
  2. Sallanan bir su banyosunda ajitasyon altında 30 ° C'de 3-5 dakika boyunca inkübe edin.
    NOT: Mikroskopla EdU tespiti için üç dakika yeterlidir; Bir akış sitometresinde optimum EdU tespiti için 5 dakika gereklidir.
  3. 100 μL% 100 etanol ilavesiyle reaksiyonu durdurun.
    1. Hücre boyutu ölçümü gerekiyorsa, 100 μL% 20 paraformaldehit ilavesiyle reaksiyonu durdurun.
      NOT: Mitotik hücrelerin nükleer mimarisi, Click reaksiyonunu takiben daha ileri analizler için bozulmadan tutulacaksa, hücreleri buz üzerine koymak yerine, oda sıcaklığında (RT) %2 paraformaldehit ile sabitlemenizi öneririz, çünkü ikincisi mikrotübül depolimerizasyonuna neden olur.
    2. 100 μL% 100 etanol ilavesinden önce hücreleri sabitlemek için hücreleri RT'de 20 dakika boyunca değişken hızlı bir rocker üzerinde 20 eğim / dak'da hafif ajitasyon altında bırakın.

3. Hücre fiksasyonu ve geçirgenliği

  1. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Süpernatantı vakum pipeti kullanarak çıkarın.
  2. Hücre peletini 500 μL% 70 etanol içinde yeniden askıya alın. Girdap yaparak iyice karıştırın.
  3. Hücreleri geçirgenleştirmek için RT'de 20 eğim / dak'da ≥1 saat boyunca değişken hızlı bir rocker üzerinde bırakın.
    NOT: SC ortamında yetiştirilen hücreler, mikrofüj duvarlarına yapışma eğiliminde oldukları için pelet yapmazlar. Etanol ilavesi peletlemeyi iyileştirir ve hücre kaybını azaltır. Hücreler gece boyunca 4 ° C'de veya -20 ° C'de daha uzun süre saklanabilir.
  4. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
  5. PBS'de hücreleri 500 μL% 10 etanol ile 2 kat yıkayın.
    NOT: Yıkamalar, dahil edilmemiş EdU'yu hücrelerden çıkarmak için çok önemlidir.

4. Click-it reaksiyonu

  1. Sitometri analizi için
    1. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    2. Pelet, 0.1 mg / mL RNaz A ve 0.2 mg / mL proteinaz K içeren 200 μL PBS'de yeniden askıya alın.
    3. Ara sıra sallanarak (veya gece boyunca 37 °C'de) 50 ° C'de 1-2 saat boyunca inkübe edin.
    4. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    5. Hücreleri 500 μL PBS ile yıkayın.
    6. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    7. Hücre peletini 200 μL PBS +% 1 sığır serum albümini (BSA) içinde yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
      NOT: Daha uzun süreler gerekli değildir ve hatta tıklama ifadelerinin verimliliğine zarar verir.
    8. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    9. Peleti 300 μL PBS +% 1 BSA içinde yeniden askıya alın.
    10. Hücreleri iki tüp arasında dağıtın: Click reaksiyonu için 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 200 μL ve Sytox Green boyama için başka bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünde 100 μL.
    11. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    12. Sytox Green boyama için
      NOT: Yüksek kaliteli DNA içeriği referans profilleri elde etmek için Sytox Green boyama (Tıklama olmadan) için bir aliquot almanızı şiddetle tavsiye ederiz. Gerçekten de, Click reaksiyonu, Sytox Green ve PI floresan dahil olmak üzere interkalant floresanı güçlü bir şekilde söndürür. Sonuç olarak, Click reaksiyonu DNA içeriğinin okunmasını bozabilir.
      1. Hücre peletini 100 μL PBS'de yeniden askıya alın.
      2. 10-30 μL'yi (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak) 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve 0.5 μM Sytox Green içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın.
      3. 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
      4. Numuneleri bir akış sitometresinde işleyene kadar karanlıkta bırakın.
        NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir.
    13. Click tepkisi için
      1. Reaktifleri aşağıdaki sırayla (bir tüp için miktar) karıştırarak taze Azid Boya tamponu hazırlayın: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Cy5 Azide ve 2 μL 1 M askorbik asit.
        NOT: Azid Boya tamponunun ana karışımını hazırlamak mümkündür. Reaktifler yukarıda belirtilenlerle aynı sırada karıştırılmalıdır.
      2. Hücre peletini 40 μL taze yapılmış Azide Boya karışımı ile yeniden askıya alın. RT'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.
      3. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
      4. PBS'de hücreleri 300 μL% 10 etanol ile 3 kat yıkayın.
        NOT: Yıkamalar, tüm çözünür EdU-Cy5 azidini ortadan kaldırmak için çok önemlidir.
      5. PBS'de hücreleri 100 μL'lik 50 μg / mL PI'de yeniden askıya alın. Karanlıkta 10 dakika bekletin.
      6. Hücre süspansiyonunun 10-30 μL'sini (hücre konsantrasyonuna bağlı olarak), 300 μL 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 içeren bir akış sitometre tüpüne aktarın.
      7. 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
      8. Örnekleri bir sitometre üzerinde işleyene kadar karanlıkta bırakın.
        NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir.
    14. Sytox Green örneklerini 488 nm'de bir uyarma mavisi lazer ve 530/30 BP filtresi kullanarak okuyun. Tipik sonuçlar için Şekil 1A'ya bakın. 488 nm'de bir uyarma mavisi lazer ve PI (x ekseni) için 615/20 BP filtre ve 640 nm'de bir uyarma kırmızı lazer ve bir 660/20 BP filtresi (y ekseni) kullanarak nokta grafiğindeki iki değişkenli PI-EdU örneklerini okuyun. Tipik sonuçlar için Şekil 1B'ye bakın.
      NOT: Şekil 1C, EdU-negatif hücreler için tipik PI-EdU iki değişkenli FACS sonucunu temsil eder. EdU-negatif hücrelerin EdU-pozitif hücrelerden ayrılmasına izin verir.
  2. Mikroskopi analizi için
    1. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    2. Peleti 200 μL PBS +% 1 BSA içinde yeniden askıya alın. RT'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatın.
    3. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    4. Reaktifleri aşağıdaki sırayla (bir tüp için miktar) karıştırarak taze Azit Boya tamponu hazırlayın: 36 μL PBS, 2 μL 0,2 M CuSO4, 0,2 μL 2 mM Dy-530 azid, 2 μL 1 M askorbik asit.
      NOT: Azid Boya tamponunun ana karışımı, reaktiflerin yukarıda belirtilen sırayla karıştırılmasıyla taze olarak hazırlanabilir.
    5. Peleti 40 μL taze yapılmış Azid Boya tamponu ile yeniden askıya alın. RT'de karanlıkta 60 dakika boyunca inkübe edin.
    6. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    7. PBS'de hücreleri 300 μL% 10 etanol ile 2 kat yıkayın.
      NOT: Yıkamalar, çözünür tüm Dy-530 azidini ortadan kaldırmak için çok önemlidir.
    8. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    9. PBS'de hücreleri 100 μL'de 0.5 μg / mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içinde yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletin.
    10. Hücreleri bir mikrosantrifüjde 10.000 × g'da 2 dakika boyunca pelet edin. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    11. Fazla DAPI'yi çıkarmak için 300 μL PBS ile yıkayın.
    12. Hücreleri bir mikrofüjde 10.000 × g'de 2 dakika boyunca toplayın. Supernatant'ı vakum pipeti ile atın.
    13. Pelet, hücre konsantrasyonuna bağlı olarak 10-50 μL PBS ile yeniden askıya alın.
    14. 2x, her seferinde 2 s için, 40-50 genliğinde sonikasyon.
      NOT: Hücreler bu aşamada birkaç gün boyunca 4 °C'de tutulabilir.
    15. Pipet, hücrelerin 1.7 μL'sini cam mikroskop üzerine kaydırır ve temiz bir örtü ile örter.
    16. Hemen DAPI ve TexasRed veya Cy3 filtreli bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S-faz süresini ve daha geniş anlamda G 1 ve G2 + M'nin süresini (protokol adımı 1.1) belirlemek için, S. cerevisiae W303 vahşi tip hücreler (WT, Tablo 1) SC ortamında 7 saat boyunca asenkron olarak yetiştirildi. Her saat, iki katına çıkma süresini belirlemek için hücre konsantrasyonu izlendi (Şekil 2B). Bu büyüme koşullarında, hesaplanan ikiye katlanma süresi 25 °C'de 120 dakika ± 13 dakika idi (Tablo 2). Hücreler üstel fazdayk...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya, hücre döngüsü çalışmaları için birincil model bir organizmadır, ancak S fazının karakterizasyonu, DNA replikasyonunun izleyicileri olarak kullanılan BrdU gibi eksojen nükleositleri dahil edememesi nedeniyle uzun zamandır engellenmiştir. Mayanın herpes simpleks timidin kinaz (TK) ekspresyonunun yüksek olması ve bir insan nükleozid taşıyıcısının (hENT) eklenmesi bu sorunu büyük ölçüde çözmüştür15,16. EdU, küçük floresan azid ve Click kimyası ile tespiti, anti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Agence Nationale de la Recherche (ANR) ve Association pour la Recherche sur le Cancer'ı (ARC) J.d.D.B.T. ve Agence Nationale pour la Recherche'ye (ANR) mali destek için doktora bursları için kabul etmek istemektedir (hibe ANR-18-CE12-0018-01). Montpellier MRG BioCampus görüntüleme tesisinde sitometri ve mikroskopi yapıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
&alfa;-faktör GenescriptRP01002
Sığır Serumu Albümini (BSA)Euromedex04-100--812-E
Bakır sülfatSigmaC1297
DAPISigmaD9542
Di-sülfo-Siyanin5 azid (Cy5 azid)InterchimFP-JV6320Alexa647-Azid Dy-530
azidDyomicsve nbsp; 530-10
EdU (5-etinil-2'-deoksiuridin)KarbosynthNE08701
Etanol mutlakCarlo Erba reaktifleriP013A10D16veya eşdeğeri
L-askorbik asitSigmaA4544
Propidyum iyodürSigmaP4864
Proteinaz KEuromedexEU0090
RnaseSIGMAR5000
Sytox GreenInvitrogenS-7020
Ekipman
Hücre sayacıOLSCASY
Akış sitometresiAgilentNovoSampler Pro
Çalkalama inkübatörüInfors444-4230veya eşdeğeri
Çalkalama suyu banyoJulaboSW22veya eşdeğeri
SonicatorSonicsVibra hücresi
Geniş alan mikroskobuLeicaTHUNDER Görüntüleyiciveya eşdeğeri

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bell, S. P., Labib, K. Chromosome duplication in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).
  2. Kitamura, E., Blow, J. J., Tanaka, T. U. Live-cell imaging reveals replication of individual replicons in eukaryotic replication factories. Cell. 125 (7), 1297-1308 (2006).
  3. Marston, A. L. Chromosome segregation in budding yeast: Sister chromatid cohesion and related mechanisms. Genetics. 196 (1), 31-63 (2014).
  4. Lengronne, A., Schwob, E. The yeast CDK inhibitor Sic1 prevents genomic instability by promoting replication origin licensing in late G1. Molecular Cell. 9 (5), 1067-1078 (2002).
  5. Tanaka, S., Diffley, J. F. X. Deregulated G 1-cyclin expression induces genomic instability by preventing efficient pre-RC formation. Genes & Development. 16 (20), 2639-2649 (2002).
  6. Teixeira, L. K., et al. Cyclin E deregulation promotes loss of specific genomic regions. Current Biology. 25 (10), 1327-1333 (2015).
  7. Slater, M. L., Sharrow, S. O., Gart, J. J. Cell cycle of Saccharomyces cerevisiae in populations growing at different rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (9), 3850-3854 (1977).
  8. McNeil, J. B., Friesen, J. D. Expression of the herpes simplex virus thymidine kinase gene in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and General Genetics. 184 (3), 386-393 (1981).
  9. Vernis, L. Reconstitution of an efficient thymidine salvage pathway in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 31 (19), 120(2003).
  10. Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
  11. Bruschi, C. V., McMillan, J. N., Coglievina, M., Esposito, M. S. The genomic instability of yeast cdc6-1/cdc6-1 mutants involves chromosome structure and recombination. Molecular and General Genetics. 249 (1), 8-18 (1995).
  12. Feng, L., Wang, B., Wu, L., Jong, A. Loss control of Mcm5 interaction with chromatin in cdc6-1 mutated in CDC-NTP motif. DNA and Cell Biology. 19 (7), 447-457 (2000).
  13. Saner, N., et al. Stochastic association of neighboring replicons creates replication factories in budding yeast. Journal of Cell Biology. 202 (7), 1001-1012 (2013).
  14. Pasero, P., Braguglia, D., Gasser, S. M. ORC-dependent and origin-specific initiation of DNA replication at defined foci in isolated yeast nuclei. Genes & Development. 11 (12), 1504-1518 (1997).
  15. Lengronne, A. Monitoring S phase progression globally and locally using BrdU incorporation in TK+ yeast strains. Nucleic Acids Research. 29 (7), 1433-1442 (2001).
  16. Magiera, M. M., Gueydon, E., Schwob, E. DNA replication and spindle checkpoints cooperate during S phase to delay mitosis and preserve genome integrity. The Journal of Cell Biology. 204 (2), 165-175 (2014).
  17. Talarek, N., Petit, J., Gueydon, E., Schwob, E. EdU incorporation for FACS and microscopy analysis of DNA replication in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1300, 105-112 (2015).
  18. Ivanova, T., et al. Budding yeast complete DNA synthesis after chromosome segregation begins. Nature Communications. 11 (1), 2267(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

EdU nkorporasyonuDNA ReplikasyonuH cre D ng s Reg lasyonuAk SitometrisiClick ReaksiyonuMaya SenkronizasyonuSytox Green BoyamaGenom Stabilitesi

İlgili makaleler