Zebra Balıklarında Biyotoksinlerin İmmün Hücre Fonksiyonları Üzerine Etkilerinin Değerlendirilmesi

Özet

Bu protokol, toksin maruziyetinin zebra balığı lökositlerinin farklı alt popülasyonlarının endositik fonksiyonları üzerindeki etkilerini değerlendirebilen akış sitometrik testlerini açıklar. Testte spesifik fonksiyonel inhibitörlerin kullanılması, değişmiş endositik mekanizmaların farklılaşmasına izin verir.

Özet

Sucul ortamda zararlı seviyelerde çeşitli biyolojik toksinler bulunabilir. Siyanobakteriler, su ortamında siyanotoksin üreten çeşitli prokaryotik mikroorganizmalar grubudur. Bu biyotoksinler hepatotoksinler, dermatoksinler veya nörotoksinler olabilir ve balıkları ve memelileri etkileyebilir. Yüksek seviyelerde, bu bileşikler ölümcüldür. Öldürücü olmayan seviyelerde sinsi hareket ederler ve bağışıklık hücresi fonksiyonlarını etkilerler. Algler tarafından üretilen biyotoksinler arasında mikrosistin ve anatoksin A bulunur. Suda yaşayan hayvanlar ayrıca Clostridium botulinum tarafından üretilen botulinum nörotoksin E (BoNT / E) ile kontamine olmuş materyalleri de yiyebilir ve bu da ölüme veya bağışıklık fonksiyonlarının azalmasına neden olabilir. Zebra balığı, toksinlerin bağışıklık hücresi fonksiyonlarını nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir. Bu çalışmalarda toksin maruziyetleri in vivo veya in vitro olarak gerçekleştirilebilir. İn vivo çalışmalar zebra balığını toksine maruz bırakır ve daha sonra hücreler izole edilir. Bu yöntem, doku ortamının lökosit fonksiyonunu nasıl etkileyebileceğini gösterir. İn vitro çalışmalar önce hücreleri izole eder ve daha sonra onları kültür kuyularında toksine maruz bırakır. Lökositler, böbrek iliği ekstraksiyonu ve ardından yoğunluk gradyan santrifüjlemesi ile elde edilir. Lökositlerin patojenleri nasıl içselleştirdiği endositik mekanizmalar tarafından belirlenir. Akış sitometrisi fagositoz testleri, endositik mekanizmaların toksin maruziyeti ile değişip değişmediğini gösterir. Toksinlerin bağışıklık fonksiyon bozukluğuna nasıl neden olduğunu belirlemek için izole lökositleri kullanan çalışmalar eksiktir. Bu makalede açıklanan prosedürler, laboratuvarların çevresel bir toksin bağışıklık hücrelerinin endositik fonksiyonlarını azalttığında etkilenen mekanizmaları incelemek için zebra balığı kullanmasını sağlayacaktır.

Giriş

Çevresel biyotoksinlerin ve bağışıklık baskılayıcı ajanların birçok türü vardır. Bakteriyel toksinler içeren alg patlamaları iç sularda meydana gelir ve biyofilm¹ olarak da ortaya çıkabilir. Siyanobakteriler (mavi-yeşil algler) doğal olarak tüm tatlı su ekosistemlerinde bulunur. Tatlı su sistemlerinde siyanobakteri patlamaları önemli ölçüde artmıştır². Belirli zamanlarda, Siyanobakteriler suda ve karada yaşayan hayvanlara zararlı toksinler üretebilir. Bu toksinler karaciğeri, cildi ve mukoza zarlarını ve/veya sinir sistemini etkileyebilir. Siyanobakteriler tarafından üretilen iki bileşik, mikrosistin ve anatoksin A'dır. Mikrosistin, siklik bir heptapeptiddir³. Anatoksin A bir alkaloid^4'tür. Botulinum nörotoksin E (BoNT/E), sucul sistemlerde meydana gelen başka bir toksindir. Clostridium botulinum tarafından üretilir ve suda yaşayan hayvanlar tarafından yutulabilir⁵.

Çevresel toksinlere maruz kalmak balıkları etkiler ve ayrıca hayvan sağlığını etkileyebilir ve hastalık oluşumlarını artırabilir⁶. Bu toksinlerin bağışıklık hücrelerini nasıl etkilediğini anlamak, bu maddelere maruz kalmayla ilişkili risklerin belirlenmesi için esastır. Zebra balığı, çevresel toksinlerin bağışıklık hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için mükemmel bir modeldir⁷. Akış sitometrisi ve zebra balığı lökositlerini kullanan bir yöntem geliştirmek oldukça faydalıdır. Zebra balığının insanlar için fizyolojik bir önemi vardır ve bu yöntem, temel toksikoloji ve immünolojiden ilaç keşfi ve gelişim biyolojisine kadar çok çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Suda yaşayan organizmalar oldukları için zebra balıkları özellikle su kaynaklı çevresel toksinlerin etkilerini incelemek için uygundur⁷. Zebra balığının kullanımı diğer omurgalı modellerine göre daha ucuzdur ve kullanımları daha az etik kaygı doğurur.

Beyaz kan hücreleri veya lökositler, hastalığa neden olan organizmalara karşı ilk hücresel savunma hattıdır. Endositoz, bir hücrenin, hücrenin dışında bulunan bir sıvıyı veya parçacığı alması veya içselleştirmesi işlemidir. Bu, bileşiği bir vezikül⁸ içine alan hücre tarafından gerçekleştirilir. Lökositler bu işlemi patojenleri öldürmede ve hastalığa karşı savunma hazırlamada ilk adım olarak kullanırlar. Fagositoz bir endositoz türüdür ve çevresel kirleticilerin balık sağlığı üzerindeki etkilerini araştırmak için kullanılan ilk yöntemlerden biridir⁹. Petrie-Hanson laboratuvarı, lökosit, endositik ve fagositik fonksiyonlara müdahale etme ve bağışıklık savunmasını etkileme potansiyeli açısından biyotoksinleri taramak için zebra balığı lökositlerini kullanan yöntemler geliştirmiştir. Bu yöntemlerde yer alan endositoz türleri pinositoz, fagositoz, kalsiyum bağımlı reseptör aracılı fagositoz ve mannoz reseptörü aracılı fagositozdur. Zebra balığı ile akış sitometrisi yöntemlerinin kullanılması ilk olarak Petrie-Hanson laboratuvarında⁹ tanımlanmıştır ve sucul toksinleri ve patojenleri araştırmak için rutin olarak kullanılmaktadır. Rag1^-/- mutant zebra balığının T ve B hücreleri¹⁰ yoktur ve doğuştan gelen bağışıklık hücresi mekanizmalarını spesifik olarak araştırmak için kullanılabilir.

Akış sitometrisi lazer tabanlıdır ve hücrelerin fiziksel özelliklerini belirlemek için kullanılabilir. İleri saçılma veya FSC değeri, X ekseninde çizilir ve hücrenin boyutunu temsil eder. Yan saçılma veya SSC, Y ekseni üzerinde çizilir ve hücrenin sitoplazmik tanecikliğini temsil eder. Ortaya çıkan grafik, benzer fiziksel özelliklere sahip hücre popülasyonlarını birlikte gruplandırılmış, farklı hücre tiplerinin bir dağılım grafiği üzerinde çeşitli konumlarda göründüğünü göstermektedir. Bu popülasyonlar, hücrelerin fiziksel özellikleri^{değiştikçe} dağılım grafiği üzerindeki konumlarını değiştirebilir 9. Bu tekniği zebra balığı lökositleri ile kullanmak, araştırmacıların çevresel toksinler de dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt olarak hücre popülasyonlarındaki değişiklikleri değerlendirmelerini sağlar.

Akış sitometresi çok boyutludur ve hücreleri ve aktivitelerini daha fazla karakterize etmek için değerlendirmede birden fazla florofor türü kullanılabilir. Bu protokolde açıklanan tahlillerde endositoz, bir hücrenin içselleştirdiği floresan materyal miktarının ölçülmesiyle karakterize edilir. Toksine maruz kalmanın endositik mekanizmaları etkileyip etkilemediği ve nasıl etkilediği, toksine maruz kalan hücrelerin materyali alma kabiliyetinin, akış sitometrisi kullanılarak toksine maruz kalmayan hücrelerin kabiliyetine kıyasla karşılaştırılmasıyla belirlenebilir. Bu şekilde değerlendirilebilen endositik süreçler arasında pinositoz, reseptör aracılı endositoz ve fagositoz bulunur.

Pinositoz, çözünür bileşenlerin alımıdır ve hücre reseptörlerini kullanmaz. Alım, küçük vakuoller oluşturmak için mikrofilamentler ve mikrotübüller tarafından sitoplazmik yeniden düzenlemeyi içerir. Luciferase Yellow (LY), seçici olmayan pinositoz¹¹ ile sıvı alımını ölçmek için kullanılan bir floresan boyadır. Reseptör aracılı endositoz, büyük moleküllerin seçici alımını içerir. Bu işlemi değerlendirmek için floresein (FITC) etiketli dekstran (DX) 40 kullanılabilir. Fagositoz, 0,5 mikrometreden daha büyük parçacıkları yutan bir endositoz şeklidir. Bu işlem, FITC-DX70 ve FITC-Eschericia coli kullanan prosedürlerle araştırılır. DX40 ve DX70, sırasıyla 40.000 ve 70.000 moleküler ağırlığa sahiptir. FITC-E. coli , akış sitometresi ile ölçülebilen bir flora bağlı E. coli'nin standart laboratuvar türüdür. Reseptör aracılı endositozun birçok formu, bir sinyal molekülü olarak ve hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi için kalsiyum gerektirir⁹. Reseptör aracılı endositozun bir diğer türü mannoz reseptörü (MR) aracılı endositozdur. Mannoz reseptörleri, mikrobiyal hücre yüzeylerindeki^mannan formlarını tanıyan transmembran proteinlerdir 9. Bu prosedürleri optimize etmek için, kullanılacak dozları belirlemek için her toksin ile bir doz yanıt eğrisi oluşturulmalıdır. LY, FITC-DX40, FITC-DX70 ve FITC-E için bir doygunluk eğrisi yapılmalıdır. Kullanılacak doğru konsantrasyonu değerlendirmek için coli .

Lökositlerin farklı parçacıkları içselleştirmek için kullandıkları mekanizmalar değişebilir. İşlemin hangi bileşeninin toksin maruziyetinden etkilenebileceğini önermek için, fagositik mekanizmaları bloke etmek için inhibitörler eklenebilir. Sitokalasin D (CCD) mikrotübül hareketini ve dolayısıyla pinositozu inhibe eder. CCD, reseptör aracılı endositozu^{etkilemez 11}. EDTA, kalsiyuma (Ca^{2 +}) bağımlı reseptör aracılı endositozu bloke eder. Mannan, fagositoz veya pinositozun mannoz reseptörü aracılı olup olmadığını değerlendirmek için bir mannoz reseptör inhibitörü olarak kullanılır⁹.

Bu protokolün amacı, toksin maruziyetinin fagositik lökositlerin patojenleri alma yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirleme prosedürlerini göstermektir. Bu protokoller ayrıca spesifik bir endositik mekanizmanın etkilenip etkilenmediğini de ayırt edebilir. Bu tahlillerin akış sitometresi üzerinde gerçekleştirilmesi, lökosit alt popülasyonlarının farklı şekilde etkilenip etkilenmediğini belirlemek için boyut ve sitoplazmik tanecikliğe dayalı olarak lökosit popülasyonlarını seçerek daha fazla ayrımcılığa izin verir. Bu yöntem, hücre popülasyonlarının elektronik olarak kapılanmasına dayanır.

Protokol

Bu protokol Mississippi Eyalet Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (MSU-IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmada kullanılan tüm zebra balıkları, daha önce Mississippi Eyalet Üniversitesi (MSU) Veterinerlik Fakültesi'ndeki spesifik patojen içermeyen kuluçkahanede kurulmuş olan homozigot bir rag1^-/- mutant zebra balığı kolonisinden yetiştirilmiştir10. Yabani tip zebra balığı da bu kuluçkahanede çoğaltıldı. Bu çalışmalarda toksin maruziyetleri in vivo veya in vitro olarak gerçekleştirilebilir. İn vivo çalışmalar, zebra balığını toksine maruz bırakır, daha sonra lökositler izole edilir, bu da toksin ve doku mikro çevresinin nasıl etkileşime girebileceğini ve lökosit fonksiyonunu nasıl etkileyebileceğini gösterir. İn vitro çalışmalar lökositleri izole eder ve daha sonra hücreleri kültür kuyularında toksine maruz bırakır.

1. Reaktif ve çözelti hazırlama

1. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) Tamponu: (Kalsiyum veya Magnezyum İçermeyen Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) +% 0.05 Sığır Serum Albümini (BSA)) (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre izolasyonundan önce bunu taze olarak hazırlayın.
2. Doku kültürü ortamı (TCM): Glutamax ve% 10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş RPMI-1640 kullanın (bkz.
3. Sitokalasin D (CCD): Ticari olarak temin edilebilen ürünü (Malzeme Tablosuna bakınız) 1 mL 200 geçirmez mutlak etanol içinde yeniden süspanse ederek stok çözeltisini hazırlayın. Nihai konsantrasyonu 2,5 μg/mL elde etmek için 980 μL FACS tamponuna 20 μL stok CCD ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın.
4. EDTA: Stok çözelti 1 mg / mL'dir. Nihai konsantrasyonu 1 mM elde etmek için 900 μL FACS tamponuna 100 μL stok çözeltisi ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın.
5. Mannan: 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisi hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Daha sonra, nihai konsantrasyonu 500 μg/mL elde etmek için 900 μL FACS tamponuna 100 μL stok çözeltisi ekleyerek çalışma çözeltisini hazırlayın.
6. Lucifer Yellow (10 μg / mL) (LY, bir floresan boya), Dextran-40 (DX-40, 500 μg / mL) ve Dextran-70 (DX-70, 500 μg / mL) ayrı ayrı hazırlayın ticari olarak temin edilebilen reaktifleri steril suda yeniden süspanse ederek her birinden 1 mg / mL çözelti yaparak.
7. Floresein (FITC) bakterileri: Işık korumalı bir ortamda 37 ° C'de gece boyunca 50 μg / mL FITC ile desteklenmiş 100 mL Luria Bertani (LB) ortamında çalkalayarak Escherichia coli DH5α'yı ( Malzeme Tablosuna bakınız) büyütün 540 nm'de 0,8'lik bir optik yoğunluk (OD) elde edin.
   1. Bakterileri (3x) fosfat tamponlu salin (PBS) ile 10 dakika santrifüjleyerek 1000 x g'da yıkayın ve ardından 60 ° C'de 20 dakika ısıtın. 1 kez daha yıkayın, ardından bakteri konsantrasyonlarını OD₅₄₀ 0.8'e ayarlayın. Bu stok çözümü olacaktır.
   2. Stok çözeltisini 1:100 oranında seyrelterek çalışma çözeltisini hazırlayın (1 mL stok: 99 mL FACS tamponu). Son konsantrasyonu 1.8 x 10⁸ hücre / mL'ye ayarlayın.

2. Zebra balığı bakımı

1. Zebra balığını klorsuz şebeke suyunda tek geçişli bir akış sisteminde tutun ve yüksek proteinli balık unu ile besleyin ve doygunluğa kadar Artemia'yı yaşayın.
2. 6 aylıkken, karışık cinsiyetli zebra balıklarını tanklarından çıkarın ve deneyde kullanılmak üzere araştırma laboratuvarına taşıyın. Bu, böbrek iliğinden optimum sayıda lökosit izolasyonu için kullanılacak en iyi yaştır⁹.

3. Hücre izolasyonu

1. 10 zebra balığını trikare içinde ötenazi yapın (~ 100 mL, 4 mg / mL fosfat tamponlu Trikain metan sülfonat / litre balık suyu) (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleşik yöntemleri izleyerek⁹.
2. 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne 40 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
3. Böbrek iliği dokularını⁹ çıkarın ve bunları 3 mL doku kültürü ortamı içeren bir C-tüpüne yerleştirin ve bir doku ayrıştırıcı kullanarak dokuyu homojenize edin. Bu tercih edilen prosedürdür.
4. Alternatif olarak, bir hücre süzgecindeki 3 mL'lik bir şırınganın kauçuk ucuyla dokuları parçalayın. Doku homojenize edildikten (veya bozulduktan sonra), süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpün üzerine yerleştirilmiş 40 μm'lik bir hücre süzgecinden dökün.
5. Filtrelenmiş süspansiyonu 500 ° C'de 5 dakika boyunca 16 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dökün. Hücreleri 3 mL TCM'de yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
6. Hücreleri oda sıcaklığında 3 mL steril filtrelenmiş, yoğunluk gradyanlı ortama (1.077 g / mL) dikkatlice katmanlayın.
7. Ardından, 16 ° C'de 20 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Santrifüj durduğunda hücrelerin yeniden askıya alınmaması için frenin en düşük ayarda olduğundan emin olun.
8. Opak buffy tabakasını arayüzden 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir tüpe çıkarın.
9. 5 mL TCM ekleyerek ve bir Pasteur pipeti ile karıştırarak hücreleri yıkayın. 16 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
10. Süpernatanı atarak ve yaklaşık 1 x 10⁶ hücre / mL elde etmek için hücre peletini TCM'de yeniden süspanse ederek adımı tekrarlayın.

4. Hücre canlılığı deneyi

1. Hücre canlılığını izlemek için, propidyum iyodür (PI) boyaması kullanarak hücre ölümünü değerlendirin.
   1. Analiz edilecek 5 μL / mL hücre konsantrasyonunda PI (200 μg / mL) ekleyin. PE/Texas Red kanalında okuyun.
      NOT: Propidyum iyodür, ölü hücrelerin zarlarındaki deliklerden yayılır ve böylece onları boyar. Bu çalışma için değerlendirilen canlılık %85 idi.

5. Toksin inkübasyonu

1. İzole edilmiş hücre süspansiyonundan 200 μL hücreyi, 6 oyuklu bir doku kültürü plakasının (kontrol için 3 kuyucuk ve toksin maruziyeti için 3 kuyucuk) her bir oyuğuna alikot edin. Bu, çoğaltmaların üç kopya halinde çalıştırılmasına izin verir.
2. Her kuyucuğa 2 mL TCM ekleyin.
3. Kuyucukların üçüne toksin (~ 2.5 μg / mL) ekleyin.
   NOT: Toksin konsantrasyonu, deneye başlamadan önce optimize edilmelidir ve test için kullanılan toksine bağlı olacaktır.
4. İstenilen maruz kalma süresi için doku kültürü plakasını inkübe edin. İstenen maruz kalma süresi, deneye başlamadan önce optimize edilmelidir ve test için kullanılan toksine bağlı olacaktır. Bu çalışmada, maruz kalma süresi ~ 1 saat idi.
5. Maruz kalma süresinden sonra, doku kültürü plakasını 10 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
6. Plakadan yapışan hücreleri çıkarmak için her bir kuyucuktaki hücreleri dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. Hücreleri plakadan 14 mL'lik yuvarlak tabanlı bir santrifüj tüpüne çıkarın.
8. Hücreleri 16 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 3 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
9. Hücreleri 1.5 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
   NOT: İn vivo çalışmalar için, zebra balığını toksine maruz bırakın (yukarıda belirtilene benzer bir konsantrasyonda) ve ardından hücreleri izole edin.

6. Endositoz testi

1. 100 μL hücreleri 5 mL akış sitometri tüplerine bağlayın. Tüpleri, her oyuktan dört kopya tüp ile aşağıdaki gibi etiketleyin: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Uygun tüplere adım 1.6 ve adım 1.7'de belirtildiği gibi floresan boya ekleyin: tüpe (1) 50 μL LY, tüpe (2) 50 μL DX40; 50 μL DX70 tüpe (3); 50 μL FITC-E. tüpe coli (4).
3. 1 saat inkübe edin. Her tüpe 200 μL FACS tamponu ekleyin.
4. Hücreleri 16 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Bu adımı üç kez tekrarlayın. Akış sitometrik analizini gerçekleştirin.

7. Akış sitometrisi

1. Hücre popülasyonlarını görselleştirmek ve veri toplamak için akış sitometrisi yapın. Ayrıntılar için Hohn ve ^ark.9'a bakın.
2. İlk adımda hedef hücre popülasyonlarını belirleyin. En sol taraftaki kalıntıları ve küçük, piknotik hücreleri çıkarmak için yan saçılma (SSC) (genellikle dikey eksen) ve grafiğin altındaki aynı kalıntıları kaldırmak için ileri saçılma (FSC) (genellikle yatay eksen) kullanın.
3. Çift okumaları ortadan kaldırın (iki kez sayılan hücreler). Bu, bir darbe geometri kapısı (FSC-H x FSC-A) kullanılarak gerçekleştirilir.
4. Arka plan sinyalini belirleyin. Arka plan floresan seviyelerini belirlemek için hücreleri yalnızca floresan kontrolü ve kullanılan her florokrom için bir izotip floresan kontrolü çalıştırın.
   NOT: Her florokrom, hücre otofloresansı ve spesifik olmayan bağlanmadan etkilenen kendi benzersiz arka plan floresan seviyesine sahiptir. Bu, gerçek pozitif sinyaller ile arka plan floresansı arasında ayrım yapar. Floresansa dayalı hücre popülasyonlarını tanımlarken ve geçitlerken, bu kontrol değerleri pozitif olayların sayısından çıkarılır ve elde edilen sayı, analiz için kullanılan sayıdır.
5. Örnekleri çalıştırın ve geçitlenecek hücre popülasyonlarını belirleyin. Bir hücre karışımı içindeki farklı hücre popülasyonlarını morfolojik olarak karakterize etmek ve tanımlamak için FSC ve SSC'yi kullanın.
   NOT: FSC öncelikle hücrenin boyutu ile ilgilidir. Daha büyük hücreler ileri yönde daha fazla ışık saçarak daha yüksek FSC değerlerine neden olurken, daha küçük hücreler daha az ışık saçar ve daha düşük FSC değerlerine sahip olur. Farklı boyutlardaki hücreler kümeler halinde gruplandırılacaktır. Örneğin, daha küçük olan lenfositler, granülositlere kıyasla daha düşük FSC değerlerine sahip ayrı bir küme olarak görünebilir. SSC, hücrenin tanecikliği, karmaşıklığı ve iç yapısı ile ilgilidir. Daha fazla sitoplazmik tanecikliliğe sahip hücreler daha yüksek SSC değerlerine sahip olacaktır. Benzer hücreler bir araya toplanacaktır. Örneğin, nötrofiller sitoplazmik granüllere sahiptir ve lenfositlerden daha yüksek bir SSC değerinde kümelenir.
6. Tüm örnekleri çalıştırın ve FSC/SSC'ye dayalı olarak, daha fazla analiz edilmek üzere hücre popülasyonlarına kapılar uygulayın. Kapılı alanlar, hücre yoğunluğuna ve ilgilenilen popülasyonlara göre uygulanır.
7. Mavi lazerle 495 nm / 519 nm'de floresan için her kapıdaki FITC'nin Ortalama Floresan Yoğunluğunu (MFI) analiz etmek için kapılı alanları histogramlara çizin.
8. Analiz programında mükemmel olmak için yazılım tarafından belirlenen hücre sayılarını dışa aktarın.
9. Verileri istatistiksel bir yazılım paketinde analiz edin (bkz. Malzeme Tablosu).
10. Her bir kontrol hücresi popülasyonunun MFI'sini toksine maruz kalan hücre popülasyonlarının MFI'si ile karşılaştırın.

8. Toksinin endositik mekanizmalar üzerine etkisi ve CCD, EDTA ve mannan inhibitörlerinin endositik mekanizmalar üzerindeki etkileri

NOT: Sıvıları veya parçacıkları almak için hücre sitoplazması aktif olarak hareket eder. Bu hareket, birden fazla yapısal eleman ve sinyal yolu gerektirir. Biyotoksinler bu elementlerin veya yolların herhangi birini etkileyebilir. Spesifik karakterize edilmiş inhibitörlerin etkilerinin karşılaştırılması, biyotoksinin nasıl etki edebileceğinin ayırt edilmesine yardımcı olmak için kullanılabilir¹¹.

1. Hücre izolasyonlarını 3. adımda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
2. 100 μL hücreleri 5 mL akış sitometri tüplerine bağlayın (her oyuktan dört çoğaltma tüpü ile).
   NOT: Tüpleri aşağıdaki gibi etiketleyin: (5) CCD + LY (CCD, mikrofilament ve mikrotübül yeniden düzenlemesini inhibe ederek pinositozu inhibe eder; LY, mikropinositoz ile sıvı alımını değerlendirmek için kullanılır)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA, Ca^{2 +} bağımlı reseptör aracılı fagositoz ve mikropinositozu bloke eder; alımın kalsiyuma bağımlı bir mekanizma içerip içermediğinin ölçülmesi). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannan + DX40 (mannan, MR'ye bağımlı endositozu^{ölçerek mannoz reseptörü} tarafından spesifik alımı inhibe eder 9). (10) Mannan + DX70. (11) Mannan + FITC-E. coli.
3. İnhibitörler ekleyin: Tüpe 1 μL CCD (5); Tüplere 10 μL EDTA (6-8); Tüplere 100 μL Mannan (9-11). Adım 1'de belirtildiği gibi konsantrasyonları takip edin. 5 dakika inkübe edin.
4. Uygun tüplere ikincil floresan ekleyin: tüp (1) ve (5)'e 50 μL LY; Tüp (2), (6) ve (9)'a 50 μL DX40; Tüp (3), (7) ve (10)'a 50 μL DX70; 50 μL FITC-E. coli'den tüpe (4), (8) ve (11). 30 dakika inkübe edin.
5. Her tüpe 200 μL FACS tamponu ekleyin. 400 x g'da 16 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatanı dökün ve hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. 8.5-8.6 adımlarını iki kez tekrarlayın.
7. 7. adımı izleyerek numuneleri akış sitometresinde çalıştırın.

Sonuçlar

Endositoz deneyleri, spesifik hücresel mekanizmaların toksin maruziyeti ile değişip değişmediğini belirlemek için gradyanlardan izole edilen ve fagositler ve lenfositler için kapılı karışık lökositler kullanır. İlk olarak, hücreler boyut ve ayrıntı düzeyine^{göre kapılanır 10}. Ölü, parçalanmış veya ölmekte olan hücreler, dağılım grafiğinin sol alt köşesinde görselleştirilir ve elimine edilir, fagositoz için analiz edilmez. Fagosit kapısı makrofajları, Doğal Öldürücü (NK hücreleri) ve granülositleri içerirken, lenfosit kapısı lenfositleri, fagositik B hücrelerini ve nonspesifik sitotoksik hücreleri (NCC'ler) içerir (Şekil 1).

Fagositoz, mavi lazerle 495 nm / 519 nm'de floresan okunarak gösterildiği gibi, FITC etiketli partiküllerin alımı ile belirlenir. Arka plan otofloresansı ve spesifik olmayan bağlayıcı floresansı, kontrol hücreleri ve izotip kontrolü tarafından yayılan ortalama floresan yoğunluğu (MFI) hesaba katılarak elimine edilir. Kullanılacak konsantrasyonları belirlemek için her inhibitör ile bir doz-yanıt eğrisi yapılmalıdır. Test edilen toksine maruz kalan hücrelerin akış sitometrisi sonuçları, bir inhibitöre maruz kalan hücrelerin sonuçlarıyla aynıysa, toksin benzer bir etkiye neden oluyor ve bu endositik mekanizmayı inhibe ediyor olabilir. Toksin ve inhibitörün tepkileri katkı maddesi ise, bu, toksinin inhibitörden farklı bir mekanizma ile endositozu inhibe edebileceğini düşündürmektedir.

Tedavi edilmeyen hücreler ile test edilen toksin ile tedavi edilen hücreler (Şekil 2), toksin veya inhibitör ile tedavi edilen hücreler (Şekil 3A) ve sadece inhibitör ile tedavi edilen hücreler (Şekil 3B) arasında karşılaştırmalar yapılır. Temsili sonuçlar, mikrosistin ile tedavi edilen hücrelerin, CCD ile tedavi edilen hücrelere benzer şekilde inhibe edildiğini göstermektedir. Bu sonuçlar, mikrosistinin mikropinositoz ile sıvı alımını inhibe ettiğini göstermektedir. Kapılı hücreler tek yönlü ANOVA ile analiz edilir ve sonuçlar FITC için pozitif ortalama hücre sayısı olarak rapor edilmelidir.

Şekil 1: Yabani tip zebra balığı böbrek dokusundan izole edilen lökositlerin ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) özelliklerine dayalı temsili akış sitometrisi dağılım grafiği. Fagosit kapısı makrofajları/monositleri ve granülositleri (kapılı hücrelerin #'ü) içerir. Lenfosit kapısı, lenfositleri, fagositik B hücrelerini ve spesifik olmayan sitotoksik hücreleri (NCC'ler) içerir (kapılı hücrelerin% 26'sı). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Toksine maruz kaldıktan sonra Şekil 1'de gösterilen fagositik hücrelerin ortalama floresan yoğunluğu (MFI). Tüp (1) boyanmamış hücreleri gösterirken, tüp (2) içindeki hücreler LY alımı yoluyla floresan yayar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Şekil 1'de yer alan fagositlerin ortalama floresan yoğunluğu (MFI). Cytochalasin D (CCD) inhibitörü (A) olmadan Lucifer sarı (LY) alımı; CCD varlığı ile LY alımı. Tüp (1) boyanmamış hücreleri gösterirken, Tüp (2)'deki hücreler LY alımı yoluyla floresan yayar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Protokolde yer alan adımlara genel bakış. *Balıkların bir biyotoksine maruz kalma süresi ve derecesi, kullanılan spesifik biyotoksine ve farklı kurumların hayvan bakımı ve biyogüvenlik düzenlemelerine ve protokollerine bağlı olarak değişecektir. ** Kullanılan istenen konsantrasyon ve kullanılan maruz kalma süresi, deneyden önce optimize edilmelidir ve kullanılan toksine bağlı olacaktır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Zebra balığı lökositleri ile akış sitometrisinin kullanılması, bağışıklık sistemini ayrıntılı olarak incelemek, çevresel toksinlerin etkisini değerlendirmek ve toksikolojik araştırmaları kolaylaştırmak için güçlü ve çok yönlü bir yaklaşım sunar. Toksinlerin bağışıklık hücreleri ve bağışıklık tepkisi üzerindeki etkisini hızlı ve etkili bir şekilde değerlendirmenin bir yolunu sağlar. Sonuçlar, ilgili humoral faktörleri ortaya koymakta ve balığın fizyolojisinin ve metabolizmasının çevresel biyotoksinlerle nasıl etkileşime girdiğini göstermektedir. Protokolün genel görünümü Şekil 4'te gösterilmektedir.

Ancak, bu yöntemlerin sınırlamaları vardır. Zebra balığı lökositlerini akış sitometrisi için hazırlamak, diğer modellere kıyasla daha karmaşık olabilir. Zebra balığının küçük boyutu, kan miktarını ve analiz için mevcut lökosit sayısını sınırlayabilir ^9,10. Bu prosedürler, tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için dokuların ayrılmasını gerektirir ve hücre canlılığı sonuçların doğruluğunu etkileyebilir. Fareler gibi modellerle karşılaştırıldığında, zebra balığı hücre belirteçlerine özgü antikorlar gibi mevcut immünolojik araçların yelpazesi zebra balığı için daha sınırlıdır. Bu sınırlama, zebra balığı lökositleri üzerinde yapılabilecek analiz derinliğini kısıtlayabilir. Ayrıca, akış sitometrisi verilerinin yorumlanması, özellikle karmaşık bağışıklık tepkileri ile uğraşırken uzmanlık gerektirir. Verilerin yanlış yorumlanması, özellikle çevresel toksin etkileri bağlamında yanlış sonuçlara yol açabilir.

İnhibitör eklenmemiş hücre örneklerinin sonuçları, inhibitörlü hücre örnekleriyle karşılaştırılabilir. Toksin eklenmiş hücre örneklerinin sonuçları, inhibitörlü hücre örnekleriyle karşılaştırılmalıdır. Hücre iskeletinin yeniden düzenlenmesi etkilenmişse, sınırlı LY alımı olacaktır. Toksin DX-40 veya DX-70 alımını inhibe ederse, farklı partikül boyutları fagosite edilmez. Hücreler FITC-E. coli'yi almıyorsa, toksin fagositozu inhibe etmiştir.

Özetle, zebra balığı, çevresel toksinlerin bağışıklık hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek için mükemmel bir model görevi görür. Bu protokol, özellikle endositoz ve fagositoz süreçlerine odaklanarak, biyotoksinleri taramak için akış sitometrisi ve zebra balığı lökositlerini kullanan bir yöntemi ana hatlarıyla belirtir¹¹. Bu çalışmanın amacı, toksin maruziyetinin fagositik lökositlerin patojenleri alma yeteneğini etkileyip etkilemediğini belirlemek ve spesifik endositik mekanizmalar üzerindeki potansiyel etkileri ayırt etmektir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 10 fetal sığır serumu	Gibco	A3160501
14 mL yuvarlak tabanlı santrifüj tüpleri	BD Biosciences	352059
40 & mikro; m hücre straininer	Corning	07-201-430
5 mL akış sitometri tüpleri	BD Biosciences	352235
50 mL konik santrifüj tüpü	Corning	14-959-49A
Mutlak etanol	Fisher	BP2818-500
Otomatik hücre sayacı	Yaşam Teknolojileri Kontes II FL		hücre canlılığını incelemek için
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma	A3059
sitokalasin D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
Dekstran 40	Sigma	FD40-100MG
Dekstran 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli < / em> DH5 ve alfa; (veya başka bir laboratuvar bakteri türü)	New England Biolabs	C29871
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma	ED4SS
Akış analiz yazılımı	Novoacea yazılımı
Akış sitometresi	Novocyte 3000
Floresein	Fluka BioChemica	46950
hanks kalsiyum veya magnezyum Sigma içermeyen dengeli tuz çözeltisi		H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifer Sarı	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Fosfat tamponlu salin	Sigma	P3813
RPMI-1640, GlutaMax	Gibco	ile 61870036
İstatistiksel yazılım	SPSS
Toksin
Trikain	Batı Kimya A.Ş	. NC0342409