Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi

Mayadan insanlara kadar mevcut olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), birçok organizmada reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder¹. Hayvanlarda neredeyse tüm biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynarlar. Eklembacaklıların genomunda 50-200 GPCR vardır, yani en büyük membran reseptörü süper ailesi^2'yi temsil ederler. Dizi benzerliklerine ve işlevlerine göre A-F olmak üzere altı ana sınıfa ayrılırlar³. GPCR'ler hormonlar, nöropeptitler, biyojenik aminler, glutamat, proton, lipoglikoproteinler ve fotonlar gibi çeşitli hücre dışı sinyalleri dönüştürür⁴. GPCR'ler, aşağı akış sinyallerini iletmek için heterotrimer G proteinlerine (Gα, Gβ ve Gγ) bağlanır. Gα_s veya Gα_{i / o} proteinlerine bağlı GPCR'ler, sırasıyla adenilil siklazı aktive ederek veya inhibe ederek hücre içi 3', 5'-siklik adenozin monofosfat (cAMP) seviyelerini arttırır veya azaltır. Gα_q/11'e bağlı GPCR'ler, fosfolipaz C (PLC)-inositol-1,4,5-trifosfat (IP₃) yolunu aktive ederek endoplazmik retikulum kalsiyum depolarından kalsiyum salınımını indükler. Gα_12/13'e bağlı GPCR'ler RhoGTPaz nükleotid değişim faktörleri ^5,6'yı aktive eder. GPCR'ler, insan ilaçlarının% 50'sinden fazlasının ve bir akarisitin hedefidir, amitraz⁴. GPCR'ler bu kadar çeşitli sinyalleri dönüştürürken, omurgasızlara özgü fizyolojik fonksiyonları bozan yeni pestisitler geliştirmek için umut verici hedeflerdir.

HTS'nin amacı, reseptör fonksiyonlarını modüle edebilen isabetli molekülleri tanımlamaktır. HTS, tahlil geliştirme, minyatürleştirme ve otomasyon^7'yi içerir. Eklembacaklı nöropeptit GPCR'leri, gelişim, erime ve ekdisis, atılım, enerji mobilizasyonu ve üreme gibi çoğu fizyolojik fonksiyonda rol oynar⁴. Eklembacaklıların ve metazoanların nöropeptit GPCR'lerinin çoğu, siyah bacaklı kene Ixodes scapularis'in miyoinhibitör peptid ve SIFamid reseptörlerinde olduğu gibi, kalsiyum sinyal kaskadın 2,6,8,9,10 yoluyla sinyal verir; ligandları hindgut motilite testlerinde antagonistiktir, SIF kasılmaya neden olur ve MIP bunu inhibe eder^11,12. Sarı humma sivrisineğinin NPY benzeri bir reseptörü olan Aedes aegypti,¹³ arayan kadın konağı düzenler. Aequorin kalsiyum biyolüminesans testi¹⁴ gibi diğer alternatif kalsiyum mobilizasyon testleriyle karşılaştırıldığında, kalsiyum floresan testinin gerçekleştirilmesi kolaydır, diğer rekombinant kalsiyum tespit proteinlerinin transfeksiyonunu gerektirmez ve uygun maliyetlidir. Kalsiyum floresan testi, aequorin kalsiyum biyolüminesans testi^14,15'te elde edilen hızlı kinetik sinyale kıyasla uzun süreli bir sinyal üretir.

Buradaki örnekte, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücre hattında rekombinant olarak eksprese edildi ve kalsiyum floresan testi için kullanıldı. R. microplus'ta bulunan sadece bir kinin reseptör geni vardır; reseptör, Gq proteinine bağımlı bir sinyal yolundan sinyal verir ve kalsiyum depolarından hücre içi boşluğa¹⁶ Ca^{2 +} 'nın efflüksünü tetikler. Bu işlem, kalsiyum iyonlarını bağlarken bir floresan sinyali ortaya çıkaran bir florofor ile tespit edilebilir ve ölçülebilir (Şekil 1).

Kinin reseptörü, A Sınıfı Rodopsin benzeri reseptörlere ait omurgasızlara özgü bir GPCR'dir. Kinin, Mollusca, Crustacea, Insecta ve Acari ^4,17,18'de bulunan eski bir sinyal nöropeptitidir. Koleopteranlar (böcekler) kinin sinyal sisteminden yoksundur; Sivrisinek Aedes aegypti'de, üç aedeskinin'i bağlayan sadece bir kinin reseptörü bulunurken, Drosophila melanogaster'in benzersiz bir ligand^19,20,21 olarak drosokinin ile bir kinin reseptörü vardır. Omurgalılarda homolog kininler veya kinin reseptörleri yoktur. Kininin kesin işlevi kenelerde bilinmemekle birlikte, R. microplus'ın kinin reseptörü RNAi-susturulmuş dişileri, üreme uygunluğunu önemli ölçüde azalttığını göstermektedir²². Kininler böceklerde pleotropik peptitlerdir. Drosophila melanogaster'da, hem merkezi hem de periferik sinir düzenleyici sistemler 23, ekdisis öncesi 24, beslenme 25, metabolizma 26 ve uyku aktivite paternleri^26,27 ve larva lokomotifi ^28'de rol oynarlar. Kininler, sivrisinek A. aegypti^29,30,31'de hindgut kontraksiyonunu^, diürezi ve beslenmeyi düzenler. Kinin peptitleri, biyolojik aktivite için gerekli minimum sekans olan korunmuş bir C-terminal pentapeptid Phe-X1-X2-Trp-Gly-NH_2'ye sahiptir³². Eklembacaklı özgüllüğü, endojen ligandın küçük boyutu, onları küçük moleküllü girişime uygun hale getirir ve böceklerdeki pleiotropik fonksiyonlar, kinin reseptörünü haşere kontrolü için umut verici bir hedef haline getirir⁴.

"Çift eklemeli" tahlil (Şekil 2), aynı HTS tahlili^15'teki agonistlerin veya antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. İlaç endüstrisinde ilaç keşfi için yaygın olarak kullanılan "çift eklemeli" bir tahlilden uyarlanmıştır³³. Kısacası, ilaçların hücre plakasına ilk eklenmesi, çözücü kontrolünün uygulanmasına kıyasla daha yüksek bir floresan sinyali tespit edildiğinde kimyasal kütüphanedeki potansiyel agonistlerin tanımlanmasına izin verir. Bu küçük moleküllerle 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tüm kuyucuklara bilinen bir agonist (kinin peptidi) uygulanır. İlaç plakasından rastgele bir antagonist alan kuyucuklar, ilk eklemede çözücüyü alan kontrol kuyularına kıyasla agonist ilavesi üzerine daha düşük bir floresan sinyali gösterir. Bu tahlil daha sonra aynı hücrelere sahip potansiyel agonistlerin ve antagonistlerin tanımlanmasına izin verir. Standart bir HTS projesinde, bu isabet molekülleri, doz-yanıt testleri ve burada gösterilmeyen ek biyolojik aktivite testleri ile daha da doğrulanacaktır.

Şekil 1: Kalsiyum floresan tahlil mekanizmasının gösterimi. Gq proteini hücre içi kalsiyum sinyal yolunu tetikler. Kinin reseptörü (G proteinine bağlı reseptör) CHO-K1 hücrelerinde rekombinant olarak eksprese edildi. Agonist ligand reseptöre bağlandığında, kinin reseptörü ile ilişkili Gq proteini, bir PIP₂ molekülünün IP₃ ve DAG'ye dönüşümünü katalize eden PLC'yi aktive eder. IP 3 daha sonra endoplazmik retikulumun yüzeyindeki IP₃R'ye bağlanır ve Ca 2 + iyonlarının floroforlara bağlandığı ve bir floresan sinyali ortaya çıkardığı sitoplazmaya Ca^{2 +} 'nın salınmasına yol açar. Floresan sinyali, 490 nm'de uyarma ile elde edilebilir ve 514 nm'de tespit edilebilir. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; PLC = fosfolipaz C; PIP₂ = fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat; IP₃ = inositol trisfosfat; DAG = diasilgliserol; IP3 R = IP₃ reseptörü. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilen G proteinine bağlı bir reseptör üzerindeki küçük moleküllerin yüksek verimli taranması için iş akışı. (A) Kinin reseptörünü kararlı bir şekilde eksprese eden rekombinant CHO-K1 hücreleri, bir sıvı taşıma sistemi (25 μL / kuyu) kullanılarak 384 delikli plakaya (10.000 hücre / kuyu) eklendi ve nemlendirilmiş bir CO₂ inkübatöründe 12-16 saat boyunca inkübe edildi (B ) Floresan boyayı (25 μL/kuyu) içeren tahlil tamponu, sıvı taşıma sistemi kullanılarak hücre plakasına eklenmiştir. Plaka, 30 dakika boyunca 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edildi ve RT'de 30 dakika daha dengelendi. (C) Her bir kuyucuktaki hücrelerin arka plan floresan sinyali bir plaka okuyucu ile ölçüldü. (D) 384 delikli bir kütüphane plakasından ve boş çözücüden (hepsi 0,5 μL / kuyuda) ilaç çözeltileri, bir sıvı işleme sistemi kullanılarak hücresel tahlil plakasına eklendi. (E) Hücresel kalsiyum floresan yanıtları, ilaç çözeltilerinin eklenmesinden hemen sonra plaka okuyucu ile ölçülmüştür; ortalamadan daha yüksek floresan sinyalleri ortaya çıkaran bileşik (ler) agonist hit (ler) olarak seçildi. GPCR'yi bloke eden antagonist vuruşları (aşağıdaki simge), G adımı sırasında peptid agonistinin eklenmesinden sonra ortaya çıkmıştır. (F) Aynı tahlil plakasında, hücrelerin tarama bileşikleri ile 5 dakikalık inkübasyonundan sonra, kene kinin reseptörünün endojen agonist peptidi Rhimi-K-1 (QFSPWGamide) her bir oyuğa (1 μM) eklenmiştir. (G) Agonist peptid ilavesinden sonra hücresel floresan yanıtları hemen plaka okuyucu tarafından ölçüldü. Floresan sinyalini inhibe eden bileşik (ler) antagonist hit (ler) olarak seçildi. Kısaltmalar: GPCR = G proteinine bağlı reseptör; RT = oda sıcaklığı; RFU = bağıl floresan birimleri. BioRender.com ile oluşturuldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hücre bakımı

NOT:_{BMML 3} olarak adlandırılan R. microplus'tan kinin reseptörünü istikrarlı bir şekilde eksprese eden bir cho-K1 hücre hattı, Holmes ve ark.16 tarafından geliştirilmiştir. Hücre hattının gelişiminin ayrıntıları başka bir yerde sunulmuştur¹⁴. Aşağıdaki adımların tümü steril koşullar altında sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.

1. Hedef reseptörün ekspresyonunu sağlamak için rekombinant hücre hattını seçici ortamda (% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve 800 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı) büyütün. Reseptörü sabit bir şekilde eksprese eden hücreleri 1 mL donma ortamında (% 90 FBS ve% 10 dimetil sülfoksit [DMSO]) -80 ° C'lik bir dondurucuda 2 mL'lik bir kriyovyalde saklayın.
   NOT: Dondurulmuş hücrelerin uzun süreli depolanması için, bunları sıvı azotta saklayın.
2. Hücre kültüründen önce tüm ortamları önceden ısıtın. Bir biyogüvenlik kabininde, 13 mL önceden ısıtılmış seçici ortamı (% 10 FBS ve% 10 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı) bir T-75 şişesine aktarın ve biyogüvenlik kabininde saklayın. Dondurulmuş BMLK 3 hücrelerinin bir şişesini (~ 1.5 × 10⁶ hücre) 37 ° C'lik bir su banyosunda_2-3 dakika boyunca çözün. Çözülmüş hücreleri T-75 şişesine aktarın. Aksi belirtilmedikçe, hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de tutun.
3. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında (1-2 gün), oda sıcaklığında tutulan Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) hariç tüm ortamları 37 ° C'ye ısıtın. Bir biyogüvenlik kabininde, harcanan ortamı T-75 şişesinden çıkarın, şişeyi yavaşça döndürerek hücreleri 10 mL DPBS ile 5 s yıkayın ve ardından DPBS'yi serolojik bir pipetle çıkarın.
   
6. 
   

Bu HTS tahlilini örnek olarak göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir kurum içi ilaç plakası (SAC2-34-6170) kullanılmıştır. HTS, 0.7 Z' faktörü ile mükemmel tahlil kalitesine sahipti (Tablo 1). Bu Z' faktörü, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesini yansıtır34. 0,5 veya daha yüksek bir Z′ faktörü, pozitif kontrollerin RFU'ları ile negatif kontroller arasında iyi bir tahlil sinyali dinamik aralığı olduğunu gösterir. Z' faktörü 0,5'ten düşük olan tahliller optimal olmayan bir sinyal dinamik aralığına sahiptir, genellikle isabet seçimi için bilgilendirici değildir ve bu nedenle atılır. Pozitif kontrollerden gelen yanıt (göreceli floresan birimleri, RFU cinsinden ölçülür) (64 pozitif kontrol yanıtının ortalama RFU'su, μ c+ = 130.139), negatif kontrollerden ortalama 19 kat daha yüksekti (64 negatif kontrol yanıtının ortalama RFU'su, μc- = 6.675). Burada "agonist isabetleri" seçmek için kesme floresansı,% >50'lik normalleştirilmiş yüzde aktivasyon (NPA) maksimum oranına ayarlandı. "Antagonist vuruşları" seçmek için kesme floresansı,% >50'lik gözlemlenen bir inhibitör aktiviteye (Io) ayarlandı. Üç agonist isabet molekülü ve iki antagonist isabeti seçildi: SACC-0090237 (NPA =% 153), SACC-0036982 (NPA =% 118) ve SACC-0006532 (NPA =% 152) ve SACC-0103392 (I o =% 53) ve SACC-0041280 (I o =% 56) antagonistler olarak (ham veriler Ek Tablo S2'de gösterilmiştir). Agonistler (yeşil satırlar) ve antagonistler (turuncu satırlar) için NPA ve Io hesaplamalarına örnekler Ek Tablo S2'de gösterilmiştir.

Bileşik ekleme	μS1	σs	μc-	σc-	Z' değeri
(n = 320)	(n = 320)	(n = 64)	(n = 64)
9,212	18,130	6,675	1,895	0.7
Agonist peptid ilavesi	μs	σs	μc+	σc+
1,22,322	15,987	1,30,139	11,062

Tablo 1: HTS tahlilinde tüm plakadan normalleştirilmiş hücre yanıtlarının özeti. Ortalama (μ) ve standart sapma (σ) CDD kasa analizinden elde edilir. Kısaltmalar: HTS = yüksek verimli tarama; RFU'lar = bağıl floresan birimleri; 1s (numuneler) = 320 test edilmiş bileşik; μs = 320 kuyudan gelen hücresel yanıtların (RFU'lar) ortalama değeri; μc- = negatif kontrollerden RFU'ların ortalama değeri; μc+ = pozitif kontrollerden RFU'ların ortalama değeri; σs = 320 kuyudan hücresel yanıtların (RFU'lar) standart sapması; σc- = RFU'ların negatif kontrollerden standart sapması; σc+ = RFU'ların pozitif kontrollerden standart sapması.

Ek Tablo S1: Otomatik pipetleme adımları için sıvı taşıma sisteminin özel programları. Bu tablo Xiong ve ark.31'den değiştirilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Tablo S2: Temsili sonuçların ham verileri. Yeşil renkle vurgulanan satırlar agonist isabetlerini, turuncu renkle vurgulanan satırlar ise antagonist isabetlerini temsil eder. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.