Bu çalışmada, rekombinant G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerindeki küçük molekül kütüphanelerini taramak için 384 kuyucuklu plakalar için yüksek verimli, hücre içi kalsiyum floresan testi açıklanmaktadır. Hedef, sığır ateşi kenesinden kinin reseptörü, Rhipicephalus microplus, CHO-K1 hücrelerinde eksprese edilir. Bu tahlil, aynı hücreleri tek bir "çift eklemeli" tahlilde kullanarak agonistleri ve antagonistleri tanımlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant G Proteinine Bağlı Reseptörlerin Yüksek Verimli Taraması için "Çift İlaveli" Bir Kalsiyum Floresan Testi
Bu makalede
Özet
Özet
G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder ve çok sayıda insan ilacının hedefidir. GPCR'lere karşı rastgele küçük molekül kütüphanelerinin yüksek verimli taraması (HTS), ilaç endüstrisi tarafından hedefe özgü ilaç keşfi için kullanılır. Bu çalışmada, omurgasız-spesifik nöropeptit GPCR'lerin yeni küçük moleküllü ligandlarını, ölümcül insan ve veteriner patojenlerinin vektörlerinin fizyolojik çalışmaları için problar olarak tanımlamak için bir HTS kullanılmıştır.
Omurgasızlara özgü kinin reseptörü hedef olarak seçildi çünkü omurgasızlarda diürez, beslenme ve sindirim dahil olmak üzere birçok önemli fizyolojik süreci düzenliyor. Ayrıca, birçok omurgasız GPCR'nin farmakolojisi zayıf bir şekilde karakterize edilir veya hiç karakterize edilmez; bu nedenle, bu reseptör gruplarının diğer metazoanlardaki, özellikle de insanlardaki ilgili GPCR'lere göre diferansiyel farmakolojisi, GPCR'lerin bir süper aile olarak yapı-aktivite ilişkilerine bilgi katmaktadır. Sığır ateşi kenesinden kinin reseptörünün ligandlarının veya güney sığır kenesi Rhipicephalus microplus'tan keşfedilmesi için 384 kuyucuklu plakalardaki hücreler için bir HTS testi geliştirilmiştir. Kene kinin reseptörü CHO-K1 hücrelerinde kararlı bir şekilde eksprese edildi.
Kinin reseptörü, endojen kinin nöropeptitleri veya diğer küçük molekül agonistleri tarafından aktive edildiğinde, kalsiyum depolarından sitoplazmaya Ca2 + salınımını tetikler. Bu kalsiyum floresan testi, "çift eklemeli" bir yaklaşımla birleştirildiğinde, aynı tahlil plakasındaki fonksiyonel agonist ve antagonist "hit" moleküllerini tespit edebilir. Her tahlil, 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir dizi taşıyan ilaç plakaları kullanılarak gerçekleştirildi. 0.7'lik güvenilir bir Z 'faktörü elde edildi ve HTS 2 μM nihai konsantrasyondayken üç agonist ve iki antagonist isabet molekülü tanımlandı. Burada bildirilen kalsiyum floresan testi, Ca2+ sinyal kaskadını aktive eden diğer GPCR'leri taramak için uyarlanabilir.
Giriş
Mayadan insanlara kadar mevcut olan G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler), birçok organizmada reseptörlerin en büyük süper ailesini temsil eder1. Hayvanlarda neredeyse tüm biyolojik süreçlerin düzenlenmesinde kritik rol oynarlar. Eklembacaklıların genomunda 50-200 GPCR vardır, yani en büyük membran reseptörü süper ailesi2'yi temsil ederler. Dizi benzerliklerine ve işlevlerine göre A-F olmak üzere altı ana sınıfa ayrılırlar3. GPCR'ler hormonlar, nöropeptitler, biyojenik aminler, glutamat, proton, lipoglikoproteinler ve fotonlar gibi çeşitli hücre dışı sinyalleri dönüştürür4
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre bakımı
NOT:BMML 3 olarak adlandırılan R. microplus'tan kinin reseptörünü istikrarlı bir şekilde eksprese eden bir cho-K1 hücre hattı, Holmes ve ark.16 tarafından geliştirilmiştir. Hücre hattının gelişiminin ayrıntıları başka bir yerde sunulmuştur14. Aşağıdaki adımların tümü steril koşullar altında sınıf II biyogüvenlik kabininde gerçekleştirilir.
- Hedef reseptörün ekspresyonunu sağlamak için rekombinant hücre hattını seçici ortamda (% 10 fetal sığır serumu [FBS] ve 800 μg / mL G418 sülfat içeren F-12K ortamı) büyütün. Reseptörü sabit bir ş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu HTS tahlilini örnek olarak göstermek için 320 rastgele küçük molekülden oluşan bir kurum içi ilaç plakası (SAC2-34-6170) kullanılmıştır. HTS, 0.7 Z' faktörü ile mükemmel tahlil kalitesine sahipti (Tablo 1). Bu Z' faktörü, test edilen bileşiklerden bağımsız olarak tahlil kalitesini yansıtır34. 0,5 veya daha yüksek bir Z′ faktörü, pozitif kontrollerin RFU'ları ile negatif kontroller arasında iyi bir tahlil sinyali dinamik aralığı olduğunu gösterir. Z' faktör.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
HTS'nin amacı, çok sayıda küçük molekülü tarayarak isabetli molekülleri tanımlamaktır. Bu nedenle, bu örnekten elde edilen sonuçlar geleneksel bir HTS deneyinin yalnızca küçük bir bölümünü temsil etmektedir. Ayrıca, tanımlanan isabet moleküllerinin, aynı rekombinant hücre hattında ve sadece boş vektörü taşıyan bir CHO-K1 hücre hattında doza bağımlı bir tahlil gibi aşağı akış tahlillerinde doğrulanması gerekir; bu, küçük molekülleri kurtarmak için aynı anda gerçekleştirilebilir. Sitotoksisite testleri, ikinci ilavedeki ya.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, USDA-NIFA-AFRI Hayvan Sağlığı ve Refahı Ödülü (Ödül numarası 2022-67015-36336, PVP [Proje Direktörü]) ve Texas A&M AgriLife Araştırma Böcek Vektör Hastalıkları Hibe Programı'ndan (FY'22-23) P.V.P.'ye kadar rekabetçi fonlardan desteklenmiştir. Ek Tablo S2 , Dr. James Sacchettini'nin Texas A & M Üniversitesi ve Texas A & M AgriLife Research'teki laboratuvarından elde edilen şirket içi, rastgele, küçük moleküllü bir kütüphaneden elde edilen verileri içerir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %0.25 tripsin-EDTA | Gibco Invitrogen | 15050-065 | fenol kırmızısı ile |
| %0.4 tripan mavisi | MilliporeSigma | T8154 | sıvı, steril |
| 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri | Thermo Fisher | AM12400 | RNaz içermeyen Mikrofüj Tüpleri |
| 5 mL serolojik pipet | Corning | 29443-045 | Corning Costar Stripette ayrı ayrı sarılmış |
| 10 mL serolojik pipet | Corning | 29443-047 | Corning Costar Stripette ayrı ayrı sarılmış |
| 15 mL konik tüpler | Falcon | 352196 | steril |
| 20 & mikro; L filtre uçları | ABD Scientifc Inc. | P1121 | steril, bariyer |
| 25 mL serolojik pipet | Corning | 29443-049 | Corning Costar Stripette ayrı ayrı sarılmış |
| 50 mL konik tüpler | Corning | 430828 | dereceli, steril |
| 150 mL otomatik dostu rezervuar | Integra Bioscience | 6317 | steril, 1. günde hücre tohumlaması için ayrı ayrı sarılmış |
| 150 mL otomatik dostu rezervuar | Integra Bioscience | 6318 | steril, istiflenmiş, 2. günde boya yüklemek için |
| 384/ 12.5 &mikro; L düşük tutma uçları | Integra Bioscience | 6405 | uzun, steril filtre |
| 384 / 12.5 & mikro; L uçları | Integra Bioscience | 6404 | uzun, steril filtre |
| 384 kuyulu plaka | Greiner | 781091 | CELLSTAR, berrak polistiren ve mikro; Şeffaf, Siyah/Düz |
| Alüminyum levha contalar | Axygen Scientific | PCR-AS-200 | polyester bazlı |
| Alüminyum folyo sargı | Walmart | ||
| Biosafty kabini II | NuAire | NU-540-300 | |
| Hücre sayacı | Nexcelom | AutoT4 | |
| hücre sayma slaytları | Nexcelom | SD-100 | 20 & L odacıklı |
| CO2< / sub> nemlendirilmiş inkübatör | Thermo Fisher | Forma Serisi II | |
| Masa Lambası | SunvaleeyTEK | RS1000B | |
| Dimetil sülfoksit | MilliporeSigma | 276855 | anhydous, >99.9% İlaç |
| plakası | Corning | 3680 | |
| Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su | Corning | 21-031- CV | DPBS, 1x kalsiyum ve magnezyum |
| olmadan Etanol | Koptec | 2000 | |
| F-12K Besin Karışımı | Corning | 45000-354 | (Kaighn's Mod.) |
| Fetal sığır serumu | Equitech-Bio | SFBU30 | |
| Floresan kalsiyum tahlil kiti | ENZO Lifescience | ENZ-51017 | 10x96 testleri |
| G418 sülfat | Gibco Invitrogen | 10131-027 | Genetik seçici antibiyotik 50 mg / mL |
| Hank tamponu | MilliporeSigma | 55037C | HBSS modifiye, kalsiyum ile, magnezyum ile, fenol olmadan |
| HEPES tamponu | Gibco Invitrogen | 15630-080 | 1 Molar |
| HTS veri depolama plakası CDD | kasası ve nbsp; | https://www.collaborativedrug.com/ | |
| Sıvı taşıma sistemi | Integra Bioscience | Viaflo | 384/12.5 µ L |
| Plaka santrifüj | Thermo Fisher | Sorvall ST8 | |
| Plaka okuyucu | BMG teknolojisi | Clariostar | |
| Poly-D-lizin | MilliporeSigma | P6407 | |
| Rhimi-K-1 agonist peptit | Genscript | özel sipariş | QFSPWGamide |
| T-75 şişe | Falcon | 353136 |
Kaynaklar
- Hanlon, C. D., Andrew, D. J. Outside-in signaling - A brief review of GPCR signaling with a focus on the Drosophila GPCR family. Journal of Cell Science. 128 (19), 3533-3542 (2015).
- Liu, N., Li, T., Wang, Y., Liu, S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
