İnsan mantar patojeni Cryptococcus neoformans , konakçı içinde hayatta kalmasını teşvik etmek için çeşitli virülans faktörleri (örneğin, peptidazlar) üretir. Çevresel nişler, yeni doğal peptidaz inhibitörlerinin umut verici bir kaynağını temsil etmektedir. Bu protokol, yumuşakçalardan ekstraktların hazırlanmasını ve mantar virülans faktörü üretimi üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesini özetlemektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yumuşakçalardan Ham ve Berraklaştırılmış Özlerin Tahmini Antikriptokok Özelliklerinin Değerlendirilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Cryptococcus neoformans , öncelikle bağışıklık sistemi baskılanmış bireyleri enfekte eden küresel bir dağılıma sahip kapsüllenmiş bir insan mantar patojenidir. Antifungallerin klinik ortamlarda yaygın kullanımı, tarımda kullanımı ve suş hibridizasyonu, direncin evriminin artmasına neden olmuştur. Antifungallere karşı bu artan direnç oranı, dünya çapında klinisyenler ve bilim adamları arasında artan bir endişe kaynağıdır ve yeni antifungal tedaviler geliştirmek için artan bir aciliyet vardır. Örneğin, C. neoformans , doku bozulması, hücresel düzenleme ve besin ediniminde rol oynayan hücre içi ve hücre dışı enzimler (örneğin, peptidazlar) dahil olmak üzere çeşitli virülans faktörleri üretir. Bu tür peptidaz aktivitesinin inhibitörler tarafından bozulması, mantar büyümesini ve proliferasyonunu bozar, bu da bunun patojenle mücadelede önemli bir strateji olabileceğini düşündürmektedir. Önemli olarak, yumuşakçalar gibi omurgasızlar, biyomedikal uygulamalar ve anti-mikrobiyal aktivite ile peptidaz inhibitörleri üretirler, ancak mantar patojenlerine karşı kullanımları açısından yeterince araştırılmamışlardır. Bu protokolde, ham ve berraklaştırılmış ekstraktlarda potansiyel peptidaz inhibitörlerini izole etmek için yumuşakçalardan global bir ekstraksiyon gerçekleştirilmiş ve klasik kriptokokal virülans faktörlerine karşı etkileri değerlendirilmiştir. Bu yöntem, yumuşakçaların antifungal özelliklere sahip önceliklendirilmesini destekler ve yumuşakçalarda bulunan doğal inhibitörlerden yararlanarak anti-virülans ajanların keşfi için fırsatlar sağlar.
Giriş
Cryptococcus neoformans, HIV / AIDS1 ile yaşayan bireyler gibi bağışıklık sistemi baskılanmış konakçılarda ciddi hastalık üreten ve AIDS'e bağlı ölümlerin yaklaşık% 19'una yol açan bir insan mantar patojenidir2. Mantar, farklı mekanizmalar kullanarak mantar öldürücü ve fungistatik aktivite gösteren azoller, polienler ve flusitozin dahil olmak üzere çeşitli antifungal sınıflarına duyarlıdır 3,4. Bununla birlikte, antifungallerin klinik ve tarımsal ortamlarda yaygın kullanımı, suş hibridizasyonu ile birleştiğinde, C. neoformans
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Yumuşakçalardan protein ekstraksiyonu
- Yumuşakçaları belirlenmiş ve onaylanmış bir doğal alandan toplayın (örneğin, Speed River, Guelph, Ontario). Bu çalışma için, çok çeşitli potansiyel antifungal etkileri değerlendirmek için hem yerli hem de istilacı türler seçildi.
- Yumuşakçaların kabuğunu (örneğin, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi ve Cipangopaludina chinensis) bir havane ve harç kullanarak yavaşça kırın ve katı parçaları bir çift cımbızla çıkarın. Genel olarak, protokol boyunca kullanılmak üzere 10 yumuşakça toplanır.
- Organları toplayın ve tartın. Yaklaşık 15-20 g numune en uygunudur.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan iş akışı, proteinlerin ve peptitlerin C. neoformans'a karşı potansiyel anti-virülans özelliklerine sahip yumuşakçalardan izole edilmesini sağlar. Benzer şekilde, farklı ekstrakt formlarının (yani, ham ve berraklaştırılmış) değerlendirilmesi, potansiyel aktif bileşiklerin yarı saflaştırılmasına izin verir ve aşağı akış değerlendirmesini destekler (örneğin, kütle spektrometrisi tabanlı proteomikler). Tipik olarak, protein ekstraksiyonu iş akışı, 4-8 mg / mL protein konsantrasyonlarına sahip homoje.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan ekstraksiyon protokolü, Ontario, Kanada'dan toplanan yumuşakçalardan bileşiklerin izolasyonunu özetlemekte ve yumuşakça ekstraktlarının insan mantar patojeni C. neoformans'a karşı kullanılmasının yeni bir araştırmasını göstermektedir. Bu protokol, omurgasızlardan peptidaz inhibitörü aktivitesini araştıran büyüyen bir araştırma grubuna katkıda bulunur13. Ekstraksiyon sırasında, bazı ekstrakt numunelerinin, muhtemelen filtre zarını tıkayan çözünür polisakkaritlerin ve / vey.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Yazarlar, Geddes-McAlister Laboratuvarı üyelerine bu araştırma boyunca değerli destekleri ve el yazması geri bildirimleri için teşekkür eder. Yazarlar, Ontario Lisansüstü Bursu ve Uluslararası Lisansüstü Araştırma Ödülü - Guelph Üniversitesi'nden D. G.-G'ye ve Kanada İnovasyon Vakfı'ndan (JELF 38798) ve Ontario Kolejler ve Üniversiteler Bakanlığı'ndan - J. G.-M için Erken Araştırmacı Ödülü'nden gelen finansman desteğini kabul etmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 ve mu; m Filtreler | VWR | 28145-477 (Kuzey Amerika) | |
| 1.5 mL Tüpler (Güvenli Kilit) | Eppendorf | 0030120086 | |
| 2 mL Tüpler (Güvenli Kilit) | Eppendorf | 0030120094 | |
| 3,4-Dihidroksi-L-fenilalanin (L-DOPA) | Sigma-Aldrich | D9628-5G | CAS #: 59-92-7 |
| 96 oyuklu plakalar | Costar (Corning) | 3370 | |
| Mermi Blender Storm 24 | NEXT ADVANCE | BBY24M | |
| Santrifüj 5430R | Eppendorf | 5428000010 | |
| Chelex 100 Reçine | BioRad | 142-1253 | |
| CO2 İnkübatör (Statik) | SANYO | Mevcut değil | |
| Cryptococcus neoformans H99 | ATCC | 208821 | |
| DIC Mikroskobu | Olympus | ||
| DIC Mikroskop yazılımı | Zeiss | ||
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Glikoz (D-Glikoz, Susuz, Reaktif Sınıfı) | BioShop | GLU501 | CAS #: 50-99-7 |
| Glisin | Fisher Kimyasal | G46-1 | CAS #: 56-40-6 |
| GraphPad Prizma 9 | Nokta | ||
| Hemositometre | VWR | 15170-208 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4.7 H2O) | Honeywell | M1880-500G | CAS #: 10034-99-8 |
| Peptone | BioShop | PEP403 | |
| Phosohate tampon tuzu pH 7.4 | BioShop | PBS408 | SKU: PBS408.500 |
| Plaka okuyucu (Synergy-H1) | BioTek (Agilent) | Mevcut değil | |
| Potasyum fosfat monobazik (KH2< / sub>PO < sub>4< / sub>) | Fisher Chemical | P285-500 | CAS #: 7778-77-0 |
| Subtilisin A | Sigma-Aldrich | P4860 | CAS #: 9014-01-01 |
| Süksinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilid | Sigma-Aldrich | 573462 | CAS #: 70967-97-4 |
| Termal banyo | VWR | 76308-834 | |
| Tiamin Hidroklorür | Fisher-Bioreaktifler | BP892-100 | CAS #: 67-03-8 |
| Maya özü | BioShop | YEX401 | CAS #: 8013-01-2 |
| Maya azot bazı (Amino Asitler ile) | Sigma-Aldrich | Y1250-250G | YNB |
Kaynaklar
- Derek, J., Sloan, V. P. Cryptococcal meningitis: Epidemiology and therapeutic options. Clinical Epidemiology. 6, 169-182 (2014).
- Rajasingham, R., et al. The global burden of HIV-associated cryptococcal infection in adu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
