Yöntem makalesi

Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/64563

⸱

23 Aralık 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Institute for Health Sciences and Technologies (SABITA), Istanbul Medipol University, 2Cellorama, 3Cancer and Stem Cell Research Center, Maltepe University, 4Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Maltepe University, 5Department of Medical Biology, School of Medicine, Maltepe University, 6School of Medicine, Koc University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, çok amaçlı bir cihaz içindeki bir hidrojelde bozulmadan kalırken, tüm sferoidlerin ve organoidlerin çeşitli mikroskoplar altında kültürlenmesi, dondurulması, çözülmesi, işlenmesi, boyanması, etiketlenmesi ve incelenmesi için metodolojileri açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre kültürü laboratuvarlarında üç boyutlu büyüyen yapılar olan organoidler ve sferoidler, insan vücudunu daha iyi taklit ettikleri ve hayvan çalışmalarına göre avantajlara sahip oldukları için iki boyutlu kültür modellerine kıyasla daha üstün modeller olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar genellikle tekrarlanabilirlik ve tutarlılık ile ilgili sorunlarla karşı karşıyadır. Uzun deneysel süreçler sırasında - organoidlerin ve sferoidlerin farklı hücre kültürü damarları arasında transferi, pipetleme ve santrifüjleme ile - bu hassas ve kırılgan 3D büyüyen yapılar genellikle hasar görür veya kaybolur. Sonuçta, sonuçlar önemli ölçüde etkilenir, çünkü 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamaz. Burada açıklanan yöntemler, bu stresli adımları en aza indirir ve çok amaçlı bir cihazda hala bir hidrojel içindeyken, işleme dizisi boyunca organoidler ve sferoidler için güvenli ve tutarlı bir ortam sağlar. Araştırmacılar, tek bir çok amaçlı cihaz kullanarak organoidlerin veya sferoidlerin yapısını konfokalden elektron mikroskoplarına kadar çeşitli yüksek teknoloji ürünü aletler altında büyütebilir, dondurabilir, çözebilir, işleyebilir, lekeleyebilir, etiketleyebilir ve daha sonra inceleyebilirler. Bu teknoloji, çalışmaların tekrarlanabilirliğini, güvenilirliğini ve geçerliliğini geliştirirken, işleme sırasında 3D büyüyen yapılar için istikrarlı ve koruyucu bir ortam sağlar. Ek olarak, stresli adımları ortadan kaldırmak taşıma hatalarını en aza indirir, alınan süreyi azaltır ve kontaminasyon riskini azaltır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre araştırması ve tedavisinin geleceği, 3D hücre kültürleri 1,2,3'te yatmaktadır. Organoid ve sferoid modeller, insan vücudu gelişimini, fizyolojisini ve hastalıklarını taklit eden daha iyi modeller oluşturarak in vitro deneyler ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatır 4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, bu modellerin tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği zorlu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bu yapıların mevcut teknolojilerle taşınması, toplanması, aktarılması ve santrifüjlenmesi, organoidlerin ve sferoidlerin birçok koşulda kaybolmasına veya hasar görmesine neden olur ve sonuçları önemli ölçüde etkiler.

Histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme ve kriyoprezervasyon için birçok protokole rağmen, deneysel koşulların standartlaştırılması, bu hassas yapıların kaybedilmeden veya zarar görmeden ele alınması ve işlenmesi ile ilgili evrensel bir yaklaşım yoktur. Mevcut protokoller de inanılmaz derecede uzundur, birkaç günden birkaç haftaya kadar değişmektedir ve çeşitli reaktiflerle karmaşık prosedürler içermektedir10,11,12,13,14. Ek olarak, hücre kültürü damarları ve kriyovyaller arasında 3D büyüyen yapıların toplanması, pipetlenmesi, santrifüjlenmesi ve aktarılması, yapıların ve mekanik kuvvetlerin konumlandırılmasında değişikliklere neden olur ve sonuçta organoidlerin ve sferoidlerin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkiler. Doku topolojisinin, hücrelerin konumlandırılmasının ve mekanik kuvvetlerin hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını önemli ölçüde etkilediği bildirilmiştir 6,15,16,17.

Bu nedenle, istikrarlı kalitede organoidler ve sferoidler üretmek için mevcut geleneksel teknolojilerin geliştirilmesi arzu edilir. Santrifüjleme ve yukarıda açıklanan diğer adımları atlayacak ve çoklu proseslerin başından sonuna kadar malzemeyi tek bir güvenli ortamda sağlayacak bir yöntem/cihaz, en tutarlı ve güvenilir verilere ulaşmak için faydalı olacaktır. Ek olarak, bu zaman, işçilik ve maliyet kısıtlamalarını azaltacaktır.

Burada açıklanan çok amaçlı cihaz (MD), organoidlerin ve sferoidlerin çoklu işlemleri için tek bir güvenli ortam sağlar (Ek Şekil 1). Bu cihaz ve tamamlayıcı protokoller hasat, pipetleme, aktarma ve santrifüj adımlarını ortadan kaldırır. Organoidler ve sferoidler, sıralı süreçler sırasında in vitro ortamlarında kalırlar. Bu ortam esas olarak ticari olarak temin edilebilen hidrojeller gibi doğal veya sentetik hücre dışı matris bileşenlerini içerir. Başka bir deyişle, burada açıklanan yöntemler, bir hidrojel damlası halindeyken bütün monte edilmiş bir organoid / sferoid örneğinin işlenmesine, incelenmesine ve dondurulmasına izin verir.

Biyouyumlu cihaz, 60 °C ile -160 °C arasındaki sıcaklıklara dayanıklıdır, bu da organoidlerin / steroidlerin -160 ° C'de bir sıvı azot tankına geri yüklenmesini veya 60 ° C'de elektron mikroskobu için reçine bloklarının hazırlanmasını mümkün kılar. Cihazdaki niş, 3D büyüyen yapılar için sınırlı bir alan tanımlamak ve önceki çalışmalara dayanarak sferoidlerin veya organoidlerin oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır 18,19,20,21,22,23. Cihazın bu kısmı şeffaftır ve yüksek optik kalite sağlayan belirli bir plastik içerir (kırılma indisi: 1.43; abbe değeri: 58; kalınlık: 7.8 mil [0.0078 in veya 198 μm]). Hem niş hem de çevresindeki 'yan' kısım otofloresana neden olur. Merkezdeki şeffaf niş 80 mm 2 alana sahipken, yan kısım 600 mm2'dir. Kabın derinliği 15 mm'dir ve kalınlığı 1,5 mm'dir. Bu özellikler, cihazın büyüklüğüne ve tasarımına ek olarak, farklı tipte yüksek teknolojili mikroskoplar altında gözlemler yapmayı ve numunelerin elektron mikroskobik incelemeleri için hazırlanmasını mümkün kılmaktadır (Şekil 2). Cihazın kapatma sistemi, biri dondurucuda kapatılmış, diğeri inkübatörde gaz akışına izin veren iki konum sağlar. CCK8 proliferasyonu ve sitotoksisite testleri, geleneksel hücre kültürü yemeklerine kıyasla hücreler üzerinde benzer etkiler göstermektedir (Ek Şekil 2). Tripan mavisi dışlama testi, MD'deki hücre kültürü sırasında yüksek hücre canlılığını (% 94) göstermektedir (Şekil 3).

Tek bir cihazda bir numune için gerçekleştirilebilecek işlemler arasında (1) kültürleme, (2) histolojik boyama, (3) immünohistokimyasal ve immünofloresan etiketleme dahil immünoboyama, (4) dondurma, (5) çözülme, (6) parlak alan, karanlık alan, floresan, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi optik mikroskoplar altında inceleme, (7) doğrudan taramalı elektron mikroskobu altında kaplama ve inceleme veya (8) iletim elektron mikroskobu için hazırlık ( Şekil 2).

Histolojik boyama, immünohistokimyasal etiketleme veya organoidleri ve sferoidleri floresan olarak etiketlemek için farklı metodolojiler mevcuttur 10,11,12,13,14,24,25. Onları hidrojelden toplamak, mevcut teknolojinin ilk ve ana adımıdır. Bu adımdan sonra, bazı yöntemler bütüne monte immüno-etiketlemeye izin verir. Hasat edilen organoidler parafine gömülür, bölümlere ayrılır ve diğerlerinde boyama ve immün boyama için etiketlenir. Ancak, bölümler tüm örneği sunmayabilir ve yapının 3B mimarisiyle ilgili yalnızca sınırlı veriler sağlayabilir. Ayrıca, bu 3D yapılara verilen hasar ve antijenite kaybı, bu teknolojilerin iyi bilinen yan etkileridir.

Bu makaledeki mikroskobik incelemeler için tamamlayıcı yeni protokoller, hala bir hidrojel içinde bulunan bütün montajlı numunelerin analizine izin vermektedir. Burada açıklanan protokoller yeni geliştirilen iki formülasyonu içermektedir: immünohistokimya çözeltisi (S-IHC) ve immünofloresan etiketleme için çözelti (S-IF). Bu çözümlere sahip yöntemler, araştırmacıların daha doğru veriler elde etmelerini sağlar, çünkü santrifüjleme, pipetleme ve hassas yapıların aktarılması gibi geleneksel iş akışlarının zararlı etkileri yoktur. Burada açıklanan protokol ayrıca hasat, blokaj, temizleme ve antijen alma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve tüm prosedürü 6-8 saate kısaltır. Ayrıca, metodoloji aynı S-IF'ye aynı anda bir ila üç antikor eklenmesine izin verir. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün bir başka avantajı olan çoklu etiketleme deneylerinden sonra bile sonuçları aynı gün içinde elde etmek mümkündür; Geleneksel tam montajlı immünofloresan etiketleme protokolleri tipik olarak 3 gün ile birkaç hafta arasında sürer 10,11,12,13,14.

Antijeniteyi azaltan bir başka zararlı adım olan parafin gömme de ihmal edilir. 3D yapı, mikroskobik incelemenin başından sonuna kadar in vitro ortamında kalır. 3D yapı büyüme koşullarında kaldığından, protein ekspresyonu ve lokalizasyon verileri in vivo koşulları daha iyi taklit eder. Metodoloji, numunenin antijen ekspresyonunu etkileyen adımları ortadan kaldırdığı için daha doğru sonuçlar beklenmektedir. Tablo 1 ve Tablo 2, bu yeni protokollerin geleneksel iş akışlarına kıyasla adımları nasıl ortadan kaldırdığını, laboratuvarda zamandan ve iş gücünden nasıl tasarruf ettiğini ve maliyetleri ve atık ürünleri nasıl azalttığını göstermektedir.

Yukarıda açıklanan önemli adımlara ek olarak, başka bir sorun, numunenin 3D yapısını daha yüksek hücre canlılık oranları 26,27,28,29,30,31 ile korumak için bir kriyoprezervasyon ortamı ve yöntemi sağlamaktır. Kriyoprezervasyon, stabil bir model sistemi oluşturmak ve organoidlerin ve sferoidlerin biyobankacılığını sağlamak için gereklidir32,33. Biyobankacılığın tüm orijinal 3D yapısı, doğal sağlık veya hastalık durumunun daha sadık bir şekilde özetlenmesine izin verecektir. Kriyoprezervasyonun kolaylığı ve güvenilirliği ve organoidlerin/sferoidlerin çözülmesi en önemli hususlardır. Çözülme sonrası organoid iyileşmesi çoğu güncel teknolojide çok düşüktür, genellikle% 50'den azdır. Bununla birlikte, son çalışmalar26,27,28,29 sağkalım oranlarının artmasıyla umut verici sonuçlar göstermiştir. Lee ve ark., % 15 DMSO 28 içeren Wisconsin Üniversitesi solüsyonunu kullandıklarında sferoid hücrelerin%78'inin kriyoprezervasyondan sonra hayatta kaldığını göstermiştir. Arai ve ark.29'un çalışmasında hücre sağkalım oranı% 83'e yükselmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası sonuçlar, 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamadığından önemli ölçüde etkilenir. Ek olarak, farmasötik ve teşhis ortamlarında iyi üretim uygulamaları için serumsuz reaktifler gereklidir. Geleneksel iş akışları, yavaş dondurma yöntemi için fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir ortam kullanır ve her ikisi de handikaplarla ilişkilidir. FBS, hayvansal kaynaklı bir üründür ve parti varyasyonlarına sahip olabilir. DMSO çok başarılı bir kriyoprotektandır, ancak özellikle çözülme sırasında uzun süreli maruz kalma sitotoksik etkilere neden olabilir30,31.

Bu makalede ayrıca, hala bir hidrojel halindeyken tüm organoidlerin veya sferoidlerin donma / çözülme metodolojisi açıklanmaktadır. Çalışmada organoidlerin ve sferoidlerin dondurulması için iki formül kullanılmıştır: (1) geleneksel dondurma çözeltisi (FS) içeren% 10 DMSO ve (2) serum ve DMSO içermeyen bir kriyoprezervasyon ortamı. Bu kriyoprezervasyon ortamı, mevcut formüllerden farklı olan hücre dışı matris bileşenleri içerir. Hücre dışı matris, hücresel bileşenler için fiziksel iskele için gerekli olan iki ana makromolekül sınıfı, proteoglikanlar ve lifli proteinlerden oluşur, ancak aynı zamanda doku morfogenezi, farklılaşma ve homeostaz için gerekli süreçleri başlatır 34,35,36,37,38,39,40 . Kollajenler gerilme mukavemeti sağlar, hücre yapışmasını düzenler, kemotaksisi ve migrasyonu destekler ve doku gelişimini yönlendirir37. Ek olarak, elastin lifleri, tekrarlanan gerilme38'e maruz kalan dokulara geri tepme sağlar. Üçüncü bir fibröz protein olan fibronektin, interstisyel hücre dışı matriksin organizasyonunu yönlendirir ve hücre bağlanmasına aracılık etmede çok önemli bir role sahiptir ve hücre dışı bir mekano-düzenleyici olarak işlev görür39. Du ve ark. tavuk kollajen hidrolizatının doğal aktomiyozin model sistemi41 üzerindeki kriyoprotektif etkisini göstermiştir. Sonuçları, kollajen hidrolizatının buz kristali büyümesini inhibe edebileceğini, ticari kriyoprotektanlara benzer şekilde protein dondurucu-denatürasyonunu ve oksidasyonunu azaltabileceğini ve donma-çözülme döngülerinden sonra daha iyi bir jel yapısı sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon ortamına hücre dışı matriks bileşenlerinin eklenmesi, numune için daha güvenli ve koruyucu bir ortam sağlar ve donma-çözülme sonrası canlı yapıların iyileşmesini destekler.

Ek olarak, bu çalışma, canlı organoidlerin ve sferoidlerin sitoplazmik membranlarını ve çekirdeklerini hala hidrojel içindeyken etiketlemek için basit bir protokol tanımlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Organoidlerin ve sferoidlerin kültürlenmesi

  1. Çözülmesi için hidrojeli gece boyunca (buzdolabında veya soğuk bir odada) buzun üzerine yerleştirin.
  2. Ticari olarak temin edilebilen çok amaçlı cihazı (MD; bakınız Malzeme Tablosu) deneyden 1 gün önce (37 °C, %5 CO2) inkübatöre ısıtın.
  3. Steril geniş uçlu pipet uçlarını buzdolabına 4 °C'de yerleştirin.
    NOT: Adım 1.1-1.3 0. Günde, 1.4-1.11 adımları ise 1. Gün gerçekleştirilmelidir.
  4. Hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığında buzun üzerine yerleştirin.
    1. İsteğe bağlı: Hidrojeli üreticinin tavsiyesine göre soğuk hücre kültürü ortamında seyreltin.
  5. HepG2 hücrelerinin bir peletini (ticari olarak elde edilen hepatosellüler karsinom hücre hattı; bakınız Malzeme Tablosu) içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin.
  6. Plaka 30-35 μL% 100 hidrojel bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış cihazın nişi içinde.
  7. Her hidrojel damlasının üst kısmının ortasına 10.000 HepG2 hücresi yerleştirin (Şekil 2) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  8. Hidrojel damlasını% 10 Fetal Sığır Serumu ile 200 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile örtün.
  9. Gaz akışına izin vermek için MD'nin kapağını doğru konumda örtün ve cihazı inkübatöre yerleştirin.
  10. Hücreleri her gün% 10 FBS ile 200 μL DMEM ile besleyin.
  11. Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3). Küresel oluşum 3. günden sonra başlar. Video 1 , bir hidrojel kubbede farklı seviyelerde sferoidlerin yerini göstermektedir.
    NOTLAR: Hidrojeli çevreleyen sıvının nazikçe aspire edilmesi ve hidrojel damlalarının zarar görmesini önlemek için yeni sıvının yavaşça çevreye eklenmesi şiddetle tavsiye edilir.

2. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin hematoksilin ve Eozin boyanması

  1. Fiksatifi ısıtın (% 4 paraformaldehit; PFA), PBS ve hematoksilin (bkz. malzeme tablosu) 37 °C'ye kadar.
  2. Hidrojel damlasını çevreleyen ortamı bir pipetle aspire edin, sabitlemek için 100-200 μL% 4 PFA ekleyin ve 37 ° C'de 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. % 4 PFA'yı aspire edin ve 37 ° C'de her biri 5 dakika boyunca 3x'i yıkamak için 200 μL PBS ekleyin. Daha sonra, PBS'yi aspire edin ve 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 200 μL Hematoksilin çözeltisi ile inkübe edin.
  4. Hematoksilin'i aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca 3x'i yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin. dH2O'yu aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 200 μL etanol ile inkübe edin.
  5. Etanol aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 200 μL Eozin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin. Eozini aspire edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika yıkamak için200μL dH 2 O ekleyin.
  6. dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak örtmek için 100 μL gliserol ekleyin.
  7. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak kayması ile monte edin. Bu adım, önemli büyüklükteki organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için atlanabilir.
  8. Muayeneye kadar kurumasını önlemek için MD'nin kapağını sıkıca kapatın. Numune en az 6 ay boyunca muayene için stabildir.

3. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin immünohistokimyası

  1. İmmünohistokimya için ticari olarak elde edilen çözeltiyi (S-IHC; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
  2. Hidrojeldeki organoidleri veya sferoidleri, 37 ° C'de 5 dakika boyunca200μL dH 2 O'da% 3 hidrojen peroksit (H2 O 2) ile inkübe edin.
  3. Hidrojen peroksit çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca dH2O'da yıkayın. dH2O'yu aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca 37 ° C'de 100 μL S-IHC ile iki kez inkübe edin.
  4. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 1-2 saat boyunca S-IHC'de seyreltilmiş 100 μL birincil antikor (bkz. Malzeme Tablosu) ile inkübe edin (üreticinin çalışma seyreltmesi ile ilgili tavsiyelerini takiben).
  5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
  6. 100 μL S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca biyotinile ikincil bir antikor (bakınız Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.
  7. Sekonder antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin. S-IHC'yi aspire edin ve streptavidin etiketli 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
  8. HRP etiketli streptavidini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
  9. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 100 μL DAB / AEC kromojen çözeltisi karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  10. Boyama yoğunluğunu bir ışık mikroskobu altında izleyin.
  11. Her biri 2 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  12. İsteğe bağlı: 37 ° C'de 5 dakika boyunca nükleer karşı boyama için 100 μL Hematoksilin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  13. Hematoksilin aspire edin ve dH2O'da 5 dakika yıkayın.
  14. dH2O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak 100 μL gliserol ile örtün.
  15. Mikroskobik incelemeye kadar MD'nin kapağını sıkıca kapatın.
    NOTLAR: Antijen alımı ve protein bloke etme adımları bu protokolde ihmal edilir, çünkü S-IHC bu adımları ortadan kaldırır.

4. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin/sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi

  1. Aşağıdaki malzemeleri 37 °C'ye ısıtın:% 4 PFA, PBS, S-IF, S-IF'de birincil antikor çözeltisi, S-IF'de ikincil antikor çözeltisi, nükleer leke ve gliserol (bkz.
  2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 37 ° C'de 15-30 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Fiksatifi aspire edin ve her biri 37 ° C'de 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
  3. Aşağıdaki adımlar sırasında nem sağlamak için nişi çevreleyen tarafa dH2O ekleyin.
  4. Hidrojel damlasını çevreleyen S-IF'yi aspire edin ve hidrojel damlasını 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL birincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
  6. S-IF'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL ikincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
  7. İkincil antikor solüsyonunu aspire edin ve karanlıkta 37 °C'de her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.
  8. PBS'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de montaj ortamı veya gliserol içeren 100 μL nükleer-DNA lekesi ile inkübe edin.
  9. Kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.
  10. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak fişi ile örtün. Organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için bu adım atlanabilir.
  11. MD'yi sıkıca kapatın. MD'lerdeki numuneler, en az floresan kaybı ile karanlıkta en az 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
  12. Konfokal mikroskobik inceleme için aşağıdaki ayarları kullanın: tüm kanalların iğne deliği değerini 20,1 olarak ayarlayın, kazanç ana sabitini 488 nm için 550, 550 nm için 485 ve 594 nm için 450 olarak tutun, tüm deneyler için lazer gücünü sabit tutun ve en düşük yüzdeyi 2,0'da tutun.
    NOTLAR: Primer antikorlar: Anti-Na-K ATPaz (1:100), Anti-Arginaz (1:50), Anti-Albümin (1:50), Anti-Beta-galaktosidaz (1:25), Antimitokondriyal antikor (1:100), Anti-Golgi Antikoru (1:50), Anti-Sitokeratin 5 (1:100), Ov6 antikoru (1:100). İkincil antikorlar: Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) - 488, Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) -550, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -488, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -550, Keçi anti-Tavuk IgY (H + L) -647. Tüm sekonder antikorlar için seyreltme 1:100'dür. Ek olarak, konjuge bir antikor olan FITC-Phalloidin (1:100 ) de kullanılır (bkz.

5. Bir hidrojel içinde canlı organoidlerin ve sferoidlerin plazma zarı ve çekirdeğin etiketlenmesi

  1. Üreticinin tavsiyelerine göre (bkz. Malzeme Tablosu) Hank'in dengeli tuz çözeltisinde Alexa flor buğday tohumu aglutinin (5.0 μg / mL) ve Hoechst (2 μM) içeren etiketleme çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.
  2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hidrojel damlasını örtmek için 100 μL etiketleme çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.
  3. Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve PBS 2x'te her biri 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İsteğe bağlı: 37 °C'de 15 dakika boyunca 200 μL %4 formaldehit ile sabitleyin.
  4. Hidrojel damlasını montaj ortamı olarak gliserol ile örtün. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak camı ile monte edin.
  5. MD'nin kapağını sıkıca kapatın ve floresan / konfokal mikroskobik incelemeye kadar karanlıkta buzdolabında saklayın. En az 6 ay boyunca stabildir.

6. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin bir hidrojel içinde dondurulması ve çözülmesi

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri dondurun.
    1. Ticari olarak elde edilen dondurma çözeltisini (FS; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
    2. Hidrojel kubbeyi çevreleyen hücre kültürü ortamını nazikçe aspire edin.
    3. Yavaşça 200 μL FS ekleyin. Numuneyi FS ile 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    4. Cihazın kapağını sıkıca kapatın ve bir köpük kutuya yerleştirin. Bu köpük kutusunu, Ek Şekil 3'te gösterildiği gibi başka bir köpük kutuya yerleştirin. Her iki köpük kutuyu da sıkıca kapatın. Birbirinin içindeki iki köpük kutu, -20 °C'lik bir dondurucuda numunenin 1 ila 2°C/dak'lık bir sıcaklık soğutma gradyanı aralığını sağlar.
    5. Kutuyu 2 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Kutuyu -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın ve gece boyunca bırakın.
    6. Numuneyi kutulardan çıkarın. MD'deki numune -80 °C dondurucuda 6 ay boyunca saklanabilir.
    7. Numuneyi içeren MD'yi daha uzun süreli depolama için sıvı azot tankına aktarın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri çözün.
    1. Numuneyi içeren MD'yi dondurucu/azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    2. Nişe 200 μL ılık kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 1'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    3. Nişe daha sıcak kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 2'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
    4. Ortam ve FS karışımını nazikçe aspire edin. Hidrojeldeki tüm montajlı organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskobu (adım 7) ve iletim elektron mikroskobu (adım 8) görüntülemesine devam edin.

7. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskopisi

  1. Karnovsky'nin fiksatif ve post-fiksatif çözeltisini (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
  2. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin. Numuneyi MD'de laminer akış başlığındaki buz üzerine 15 dakika boyunca yerleştirin.
  3. Organoidleri / sferoidleri çevreleyen sıvılaştırılmış hidrojeli çok nazikçe aspire edin. Sınırlı miktarda matrigel, numuneye zarar vermemek ve kaybetmemek için niş içinde kalabilir.
  4. Karnovsky'nin fiksatif (% 2 PFA,% 2.5 glutaraldehit 0.15 M Kakodilat tamponunda ve 2 mM CaCl2; bakınız Malzeme Tablosu) ile RT'de 1 saat boyunca sabitleyin.
  5. Fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış suyla (dH2O) 3x yıkayın.
  6. dH2O'yu nazikçe aspire edin ve 1 saat boyunca RT'de post-fiksatif çözelti (% 1 sulu osmiyum tetroksit [OsO4]; Malzeme Tablosuna bakınız) ile sabitleyin.
  7. Post-fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış su (dH2O) 3x ile yıkayın.
  8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde dehidrat (% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100), etanol / aseton karışımı (1: 1; 1: 2) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak aseton.
  9. Kritik noktalı kurutucu ile kurulayın.
  10. Cihazdaki numuneyi 90 sn boyunca bir püskürtme kaplayıcı kullanarak 6 nm altın / paladyum ile kaplayın (bkz.
  11. Vakum modunda (5 x 10-6 mA) 2-3 kV'ta lens içi ikincil elektron dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 8,1-8,2 mm çalışma mesafesi ve 675x, 1050x ve 1570x büyütmelerde görüntüler çekin.
    NOTLAR: Tüm adımlar MD'de gerçekleştirilir. Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın.

8. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin iletim elektron mikroskobu

  1. Karnovsky'nin sabitleyicisini 37 ° C'ye ısıtın. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin.
  2. Numuneyi Karnovsky'nin RT'deki fiksatif ile 1 saat sabitleyin. Her biri 15 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  3. RT'de45 dakika boyunca% 2 sulu OsO 4 ve% 2.5 potasyum ferrosiyanür ile post-fix. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  4. RT'de 30 dakika boyunca% 0.5 Tiyokarbohidrazit (TCH; Malzeme Tablosuna bakınız) içinde inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  5. RT'de %2 sulu OsO4'te 30 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  6. RT'de 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisinde (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
    NOT: Bu adımda, sferoidler gece boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
  7. Kurşun aspartat çözeltisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 60 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH2O 3x ile yıkayın.
  8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde (% 50,% 70,% 90,% 100 [x2]) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak asetonda dehidratasyon.
  9. RT'de her biri 2 saat boyunca (1:1; 1:2) aseton/Epon reçinesi ve saf Epon reçinesi (bkz. Malzeme Tablosu) karışımı ile muamele edin.
  10. Reçineyi gece boyunca 60 °C'de polimerize edin (en az 16 saat). Polimerizasyondan sonra, Ek Şekil 4'te gösterildiği gibi reçine bloğunu MD'den çıkarın.
  11. Reçine bloğunu reçine yapıştırıcı ile daha büyük bir bloğa takın. Bloğu kesin ve organoidlerin veya sferoidlerin konumuna ulaşın.
  12. Bir ultramikrotom kullanarak yarı ince (1.000 nm) ve ultra ince kesitler (60 nm) alın (bkz.
  13. Ultra ince kesitleri 100 örgü bakır ızgaraya yerleştirin ve 30 kV'luk hızlanan voltajda bir STEM dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 44 mm çalışma mesafesi ve 2580x, 5020x ve 6060x büyütmelerde görüntüler yakalayın.
    NOTLAR: Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın. MD'de 8.1-8.10 arası adımlar gerçekleştirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, çok amaçlı bir cihazı (MD) ve kültürleme, dondurma, çözme, histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme, kaplama ve tüm organoidlerin veya sferoidlerin işlenmesi için metodolojileri tamamlayan metodolojileri benzersiz bir şekilde tasarlanmış tek bir ortamda bir hidrojel içinde temsil etmektedir. Mevcut çalışma, 35 MD'de 35 hidrojel damlasında HepG2 karaciğer kanseri sferoidlerini hazırlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, MD'lerdeki akciğer organoidleri, organoid çalışmalar için mev...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan formülasyonları ve protokolleri tamamlayan MD, organoidlerin ve sferoidlerin daha kontrollü bir ortamda hızlı ve spontan 3D büyümesini kolaylaştırır ve deneyi aynı koşullarda sürdürür. Numune tüm süreç boyunca aynı ortamda kalır ve 3B büyüyen mimarilerin yaklaşık %100'ü konteynerde bozulmadan kalır. Bu, sıralı deneyler sırasında homojenliği arttırır ve uzun bir kültür periyoduna izin verir. Ek olarak, organoidler ve küresel işleme sırasındaki adımların sayısı, geleneksel iş akışlarına kıyasla önemli ölçü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ranan Gülhan Aktaş, MD, S-IHC, S-IF ve FS patent başvurularının sahibidir. Olgu Enis Tok bu ürünlerin geliştirilmesinde yer aldı. Olgu Enis Tok ve Gamze Demirel, Celorama isimli şirketin Ar-Ge ekibi üyeleridir. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut ve Özgecan Kayalar'ın beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyagramların hazırlanması için Chicago Üniversitesi'nden Dale Mertes'e, İstanbul Medipol Üniversitesi Sağlık Bilimleri ve Teknolojileri Araştırma Enstitüsü'ndeki teknik desteği için Dr. Mehmet Serif Aydın'a ve makalenin editörlüğünü yaptığı için Maltepe Üniversitesi'nden Dr. Rana Kazemi'ye minnettarız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mutlak Etanol (EtOH)Merck818760250030, %50, %70, %80, %90 ve %96 çözelti yapmak için dH2O'da seyreltin ve RT
AsetonMerck8222512500'da
Alexa flor buğday tohumu aglütininin ve Hoechst 'de saklayın; Hank'in dengeli tuz çözeltisinde (HBSS)    InvitrogenI34406Image-IT LIVE Plazma Membranı ve Nükleer Etiketleme Kiti, -20 ° C'de saklayın; C
Alfa-1-Fetoprotein (AFP) Konsantre ve Önceden Seyreltilmiş Poliklonal AntikorBiocare MedicalCP 028 +4 &°C'de A Mağazası; C
Anti-albümin antikoruAbcamEPR20195+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:50
Anti-beta galaktosidaz antikoru, Tavuk poliklonalAbcam134435+4 & derece'de saklayın; C, Seyreltme: 1:25
Anti-sitokeratin 5Abcam53121+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:100
Arginaz-1 Konsantre ve Önceden Seyreltilmiş Tavşan Monoklonal AntikoruBiocare MedicalACI 3058 A, B+4 &°C'de saklayın; C, Seyreltme: 1:50
Kalsiyum klorür (CaCl2< / sub>)SigmaC1016-500G2 mM CaCl yapmak için Karnovsky'nin fiksatifinde çözün < alt > 2 < / sub>; RT'de saklayın
Hücre Sayma Kiti 8 (WST-8 / CCK8)Abcamab228554
Santrifüj tüpleri, 15 mL ve nbsp;Nest601051
Santrifüj tüpleri, 50 mL Nest602052
Sınıf II Mikrobiyolojik Güvenlik Kabini Bio II Advance PlusTelstarEN12469
CO2 İnkübatörüPanasonicKM-CC17RU2
Bakır Izgaralar ElektronMikroskobu BilimleriG100-CuIzgaralara yerleştirilen ultra ince kesitler; 100 satır / inç kare örgü
Kritik Nokta KurutucuLeicaEM CPD300karışımında SEM uygulamaları için biyolojik numunelerin kurutulması
için  Sigma AldrichAEC101+4 &° C'de Mağaza; C
Elmas bıçakDiatomeUltra 45&�, 40-USTEM Dimetil sülfoksit için ultra ince kesitler için kullanın
Biofroxx67-68-5
Tek Kullanımlık Plastik Pasteur PippettesNest
DMEM - Dulbecco'nun Modifiye Eagle MediumGibco41966-029+4 &° 'de saklayın; C
Eosin Y Çözeltisi AlkollüParlak Slayt2.BS01-105-1000
Epon reçinesi ve nbsp;Sigma45359-1EA-FEpoksi Gömme Ortamı kiti, +4 &� C'de saklayın; C
Katkı Maddeli Fetal Sığır SerumuPan BiotechP30-3304+4 &°C'de saklayın; C
Dondurma Çözeltisi (FS)CelloramaCellO-F+4 &�C'de saklayın; C
Cam bıçak üreticisiLeicaEM KMR38 mm kalınlığında cam bıçaklar yapmak için
Cam bıçak şeritleri (Boyut 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)Leica7890-08için ultra veya yarı ince kesitler için kullanın
, EM sınıfı, %25 Elektron Mikroskobu Bilimleri162102.5 çözelti yapmak için dH2< / sub>O'da seyreltin ve +4 &°C'de saklayın; C
Gliserol çözeltisiSigma Aldrich56-81-5-20 ° C'de saklayın, Seyreltme: 1:100
Keçi anti-tavuk IgY (H + L) İkincil Antikor, Alexa, 647InvitrogenA32933RT'de saklayın
Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 488Invitrogen35502+4 & derecede saklayın; C,  Seyreltme: 1:50
Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 550Invitrogen84540+4 & derecede saklayın; C,  Seyreltme: 1:50
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 488Invitrogen35552+4 &°C'de saklayın; C,  Seyreltme: 1:50
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) İkincil Antikor, DyLight, 550Invitrogen84541+4 & °C'de saklayın; C
Hematoksilen Harris Parlak Slayt2.BS01-104-1000
HepG2 hücreleriATCCHB-8065Azot tankında saklayın
İnsan/Sıçan OV-6 Antikor Monoklonal Fare IgG1 Klonu # OV-6 R& D SystemsMAB2020-20 °C mağaza; C
HidrojelCorning354248Matrigel, Temel Membran Matrisi Yüksek Konsantrasyon (HC), LDEV içermez, 10 mL, -20 ° C'de saklayın; C
HidrojelCorning354234Matrigel, Temel Membran Matrisi, LDEV içermez, 10 mL, -20 ° C'de saklayın; C
HidrojelThermoFischer ScientificA1413201Geltrex, LDEV İçermeyen Azaltılmış Büyüme Faktörü Bodrum Membran Matrisi Hidrojel
Biyoteknoloji, Ar-Ge D SystemsBME001-01Cultrex Ultramatrix RGF BME, -20 &°C'de Saklayın; C
Karnovsky'nin fiksatifi%2 PFA, 0.15 M Kakodilat Tamponunda %2.5 Glutaraldehit, 2 mM CaCl2; taze hazırlayın; TEM & SEM örnekleri
L-Aspartik asitSigma11189-100G
Kurşun aspartat çözeltisinde40 mg aspartik asidi 10 mL ddH2O'da çözün ve 66 mg kurşun nitrat ekleyin. Çözelti 60 ° C'de stabilize edilir; C ve pH'ı 5'e ayarlayın; taze
Kurşun nitrat ElektronMikroskobu Bilimleri17900RT'de saklayın
Leica Konfokal MikroskopLeicaDMi8
LSM 700 Lazer Taramalı Konfokal MikroskopZeiss
Mikroplaka okuyucuBiotek Synergy
Çok Amaçlı Cihaz (MD)CelloramaCellO-M
Nükleer DNA lekesiInvitrogenH3569Hoechst 33258, Pentahidrat (bis-Benzimid) - Suda 10 mg / mL Çözelti, +4 ° C'de saklayın; C
Nükleer-DNA lekesiThermoFischer Scientific62248DAPI çözeltisi, +4 &°C'de saklayın; C
Osmiyum Tetroksit (OsO4),%4Elektron Mikroskobu Bilimleri19190%2 çözelti yapmak için dH2O içinde seyreltin; +4 &°C'de saklayın; C ve hava geçirmez bir kapta; hafif
Ov6 antikorunuR& D sistemleriMAB2020+4 >'de saklayın; C
Paraformaldehit (PFA) çözeltisi, %4 & nbsp;Sigma1.04005.1000%4 PFA'yı dH2O'da çözün ve kaynatın, soğutun ve çıkarın; -20 °C'de saklayın; C
Paraformaldehit çözeltisi PBS'de %4, 1 LSanta Cruz Biyoteknolojisc-281692+4 &°C'de saklayın; C
Fosfat Tamponlu Salin (PBS), tabletlerMP Biomedicals, LLC2810305
Post-fiksatif çözelti%2 OsO4, %2.5 Potasyum Ferrosiyanür dH2O; taze
Potasyum Ferrosiyanür sulu çözeltisi hazırlayın,% 5 Elektron Mikroskobu Bilimleri26603-01RT Primovert'te Saklayın
- Ters Parlak Alan Mikroskobu - ZEISSZeissÜrün no.: 491206-0001-000
Yuvarlak tabanlı mikrosantrifüj tüpleri, 2 mLNest620611
STEM bağlantılı Taramalı Elektron MikroskobuZeissGeminiSEM 500Elektron mikrograflarını taramak için 2-3 kV'da Inlens İkincil Elektron (SE) dedektörü ve transmisyon elektron mikrografları için 30 kV'da aSTEM dedektörü kullanıyoruz.
SensiTek HRP Anti-Polivalent Laboratuvar PaketiScyTek LaboratoriesSHP125+4 &°C'de Saklayın; C
Sodyum Kakodilat Tamponu, 0.4 M, pH 7.2Elektron Mikroskobu Bilimleri116550.2 M yapmak için dH2O'da seyreltin ve +4 &°C'de saklayın; C
Sodyum / Potasyum ATPaz alfa 1 antikoru [M7-PB-E9]GeneTexGTX22871-20 ° C'de saklayın;
İmmünofloresan Etiketleme için C Çözeltisi (S-IF)CelloramaCellO-IF+4 &°C'de saklayın;
İmmünohistokimya için C Çözeltisi (S-IHC)CelloramaCellO-P+4 &°C'de saklayın; C
Numune düzeltme cihazıLeicaEM TRIM2Ultramikrotoma epon numune bloğu hazırlamak için
Püskürtme kaplayıcıLeicaEM ACE200SEM numunelerini 90 s için 6 nm altın/paladyum ile kaplayın
Tiyokarbohidrazid (TCH)Sigma223220-5G% 0.5 çözelti yapmak için dH < sub > 2 O ile seyreltin ve 0.22 & mikro ile filtreleyin; M membran filtre; RT'de mağaza; taze
Tripan Mavisi Çözeltisi hazırlayın, %0,4Gibco15250061
Ultra jel süper yapıştırıcıPattexPSG2CNumuneden tutucuya epon bloğu ile polimerize epon bloğu
UltramikrotomLeicaEM UC7Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için yüksek kaliteli ultra veya yarı ince kesitler hazırlamak için)
Üniversal Pipet Uçları, 10 &; LNest171215-1101
Üniversal Pipet Uçları, 1000 & LIsolabL-002
Üniversal Pipet Uçları, 200 & L Nest110919HA01
Uranil Asetat ElektronMikroskobu Bilimleri22400% 2 çözelti yapmak ve 0.22 < mikro ile filtrelemek için dH > alt 2 O içinde seyreltin; M membran filtre; RT'de sıkıca kapalı konteyner deposunu tutun
% saklayın RT Mutlak aseton DAB/AEC kromojen çözeltisi Moleküler biyoloji için TEM Glutaraldehit Sulu Çözeltisi % RT saklayın koruyun tutkalı için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  4. Bartfeld, S., Clevers, H. Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment. Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).
  5. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  6. Hautefort, I., Poletti, M., Papp, D., Korcsmaros, T. Everything you always wanted to know about organoid-based models (and never dared to ask). Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 14 (2), 311-331 (2022).
  7. Kakni, P., Truckenmüller, R., Habibović, P., Giselbrecht, S. Challenges to, and prospects for, reverse engineering the gastrointestinal tract using organoids. Trends in Biotechnology. 40 (8), 932-944 (2022).
  8. Eglen, R. M., Reisine, T. Human iPS cell-derived patient tissues and 3D cell culture part 2: spheroids, organoids, and disease modeling. SLAS Technology: Translating Life Sciences Innovation. 24 (1), 18-27 (2019).
  9. Chatzinikolaidou, M. Cell spheroids: the new frontiers in in vitro models for cancer drug validation. Drug Discovery Today: Technologies. 21 (9), 1553-1560 (2016).
  10. Rios, A. C., Clevers, H. Imaging organoids: a bright future ahead. Nature Methods. 15 (1), 24-26 (2018).
  11. Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared Organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
  12. Renner, H., Otto, M., Grabos, M., Schöler, H. R., Bruder, J. M. Fluorescence-based single-cell analysis of whole-mount-stained and cleared microtissues and organoids for high throughput screening. Bio-protocol. 11 (12), (2021).
  13. Edwards, S. J., et al. High-resolution imaging of tumor spheroids and organoids enabled by expansion microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 208(2020).
  14. Bergdorf, K. N., et al. Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100578(2021).
  15. Foty, R. A., Pfleger, C. M., Forgacs, G., Steinberg, M. S. Surface tensions of embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development. 122 (5), 1611-1620 (1996).
  16. Jia, D., Dajusta, D., Foty, R. A. Tissue surface tensions guide in vitro self-assembly of rodent pancreatic islet cells. Developmental Dynamics. 236 (8), 2039-2049 (2007).
  17. Foty, R. A., Steinberg, M. S. The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Developmental Biology. 278 (1), 255-263 (2005).
  18. Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
  19. Sant, S., Johnston, P. A. The production of 3D tumor spheroids for cancer drug discovery. Drug Discovery Today: Technologies. 23, 27-36 (2017).
  20. Marrero, B., Messina, J. L., Heller, R. Generation of a tumor spheroid in a microgravity environment as a 3D model of melanoma. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 45 (9), 523-534 (2009).
  21. Napolitano, A. P., et al. Scaffold-free three-dimensional cell culture utilizing micromolded nonadhesive hydrogels. Biotechniques. 43 (4), 494-500 (2007).
  22. Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models-Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
  23. Kim, S., et al. Spatially arranged encapsulation of stem cell spheroids within hydrogels for the regulation of spheroid fusion and cell migration. Acta Biomaterialia. 142, 60-72 (2022).
  24. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Current Opinion in Cell Biology. 5 (5), 633-640 (2002).
  25. Sargenti, A., et al. A new method for the study of biophysical and morphological parameters in 3D cell cultures: Evaluation in LoVo spheroids treated with crizotinib. PLoS One. 16 (6), 0252907(2021).
  26. Jeong, Y., et al. Vitrification for cryopreservation of 2D and 3D stem cells culture using high concentration of cryoprotective agents. BMC Biotechnology. 20 (1), 45-54 (2020).
  27. Lee, J. H., Jung, D. H., Lee, D. H., Park, J. K., Lee, S. K. Effect of spheroid aggregation on susceptibility of primary pig hepatocytes to cryopreservation. Transplantation Proceedings. 44 (4), Elsevier. 1015-1017 (2012).
  28. Lee, B. E., et al. A simple and efficient cryopreservation method for mouse small intestinal and colon organoids for regenerative medicine. Biochemical and Biophysical Research Communications. 595, 14-21 (2022).
  29. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids andfabrication of scaffold-free tubular constructs. PLoS One. 15 (4), (2020).
  30. Awan, M., et al. Dimethyl sulfoxide: a central player since the dawn of cryobiology, is efficacy balanced by toxicity. Regenerative Medicine. 15 (3), 1463-1491 (2020).
  31. Erol, O. D., Pervin, B., Seker, M. E., Aertes-Kaya, F. Effects of storage media, supplements and cryopreservation methods on quality of stem cells. World Journal of Stem Cells. 13 (9), 1197-1214 (2021).
  32. De Angelis, M. L., et al. Colorectal cancer spheroid biobanks: multi-level approaches to drug sensitivity studies. Cell Biology and Toxicology. 34 (6), 459-469 (2018).
  33. Botti, G., Di Bonito, M., Cantile, M. Organoid biobanks as a new tool for pre-clinical validation of candidate drug efficacy and safety. International Journal of Physiology Pathophysiology and Pharmacology. 13 (1), 17-21 (2021).
  34. Jarvelainen, H., Sainio, A., Koulu, M., Wight, T. N., Penttinen, R. Extracellular matrix molecules: potential targets in pharmacotherapy. Pharmacological Reviews. 61 (2), 198-223 (2009).
  35. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signaling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22, 287-309 (2006).
  36. Schaefer, L., Schaefer, R. M. Proteoglycans: from structural compounds to signaling molecules. Cell and Tissue Research. 339 (1), 237-246 (2010).
  37. Rozario, T., DeSimone, D. W. The extracellular matrix in development and morphogenesis: a dynamic view. Developmental Biology. 341 (1), 126-140 (2010).
  38. Wise, S. G., Weiss, A. S. Tropoelastin. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (3), 494-497 (2009).
  39. Smith, M. L., et al. Force-induced unfolding of fibronectin in the extracellular matrix of living cells. PLoS Biol. 5 (10), (2007).
  40. Carvallo, M. P., Costa, E. C., Miguel, S. P., Correia, I. J. Tumor spheroid assembly on hyaluronic acid-based structures: A review. Carbohydrate Polymers. 150, 139-148 (2016).
  41. Du, L., Betti, M. Chicken collagen hydrolysate cryoprotection of natural actomyosin: Mechanism studies during freeze-thaw cycles and simulated digestion. Food Chemistry. 211, 791-802 (2016).
  42. Wang, X., et al. The significance of arginase-1 expression in the diagnosis of liver cancer: A protocol for a systematic review. Medicine. 99 (9), 19159(2020).
  43. Radwan, N. A., Ahmed, N. S. The diagnostic value of arginase-1 immunostaining in differentiating hepatocellular carcinoma from metastatic carcinoma and cholangiocarcinoma as compared to HepPar-1. Diagnostic Pathology. 7, 149(2012).
  44. Chen, A., Guo, Z., Fang, L., Blan, S. Application of fused organoid models to study human brain development and neural disorders. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 133(2020).
  45. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398 (2017).
  46. Kosheleva, N. V., et al. Cell spheroid fusion: beyond liquid drops model. Scientific Reports. 10 (1), 12614(2020).
  47. Arai, K., Murata, D., Takao, S., Verissiomo, A. R., Nakayama, K. Cryopreservation method for spheroids and fabrication of scaffold-free tubular constructs. PloS One. 15 (4), 0243248(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Organoid K lt rSferoid K lt rHidrojel lemeok Ama l Cihazmm nofloresan aretlemeKonfokal MikroskopiElektron MikroskopiB t n Da lama G r nt leme3D H cre ModelleriKriyoprezervasyon Protokol

İlgili makaleler