Tüm Organoidlerin ve Sferoidlerin Hala Bir Hidrojel İçinde Kültürlenmesi, Dondurulması, İşlenmesi ve Görüntülenmesi

Hücre araştırması ve tedavisinin geleceği, 3D hücre kültürleri ^1,2,3'te yatmaktadır. Organoid ve sferoid modeller, insan vücudu gelişimini, fizyolojisini ve hastalıklarını taklit eden daha iyi modeller oluşturarak in vitro deneyler ve hayvan modelleri arasındaki boşluğu kapatır 4,5,6,7,8,9. Bununla birlikte, bu modellerin tekrarlanabilirliği ve tekrarlanabilirliği zorlu olmaya devam etmektedir. Ayrıca, bu yapıların mevcut teknolojilerle taşınması, toplanması, aktarılması ve santrifüjlenmesi, organoidlerin ve sferoidlerin birçok koşulda kaybolmasına veya hasar görmesine neden olur ve sonuçları önemli ölçüde etkiler.

Histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme ve kriyoprezervasyon için birçok protokole rağmen, deneysel koşulların standartlaştırılması, bu hassas yapıların kaybedilmeden veya zarar görmeden ele alınması ve işlenmesi ile ilgili evrensel bir yaklaşım yoktur. Mevcut protokoller de inanılmaz derecede uzundur, birkaç günden birkaç haftaya kadar değişmektedir ve çeşitli reaktiflerle karmaşık prosedürler içermektedir^{10,11,12,13,14}. Ek olarak, hücre kültürü damarları ve kriyovyaller arasında 3D büyüyen yapıların toplanması, pipetlenmesi, santrifüjlenmesi ve aktarılması, yapıların ve mekanik kuvvetlerin konumlandırılmasında değişikliklere neden olur ve sonuçta organoidlerin ve sferoidlerin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkiler. Doku topolojisinin, hücrelerin konumlandırılmasının ve mekanik kuvvetlerin hücre farklılaşmasını ve olgunlaşmasını önemli ölçüde etkilediği bildirilmiştir 6,15,16,17.

Bu nedenle, istikrarlı kalitede organoidler ve sferoidler üretmek için mevcut geleneksel teknolojilerin geliştirilmesi arzu edilir. Santrifüjleme ve yukarıda açıklanan diğer adımları atlayacak ve çoklu proseslerin başından sonuna kadar malzemeyi tek bir güvenli ortamda sağlayacak bir yöntem/cihaz, en tutarlı ve güvenilir verilere ulaşmak için faydalı olacaktır. Ek olarak, bu zaman, işçilik ve maliyet kısıtlamalarını azaltacaktır.

Burada açıklanan çok amaçlı cihaz (MD), organoidlerin ve sferoidlerin çoklu işlemleri için tek bir güvenli ortam sağlar (Ek Şekil 1). Bu cihaz ve tamamlayıcı protokoller hasat, pipetleme, aktarma ve santrifüj adımlarını ortadan kaldırır. Organoidler ve sferoidler, sıralı süreçler sırasında in vitro ortamlarında kalırlar. Bu ortam esas olarak ticari olarak temin edilebilen hidrojeller gibi doğal veya sentetik hücre dışı matris bileşenlerini içerir. Başka bir deyişle, burada açıklanan yöntemler, bir hidrojel damlası halindeyken bütün monte edilmiş bir organoid / sferoid örneğinin işlenmesine, incelenmesine ve dondurulmasına izin verir.

Biyouyumlu cihaz, 60 °C ile -160 °C arasındaki sıcaklıklara dayanıklıdır, bu da organoidlerin / steroidlerin -160 ° C'de bir sıvı azot tankına geri yüklenmesini veya 60 ° C'de elektron mikroskobu için reçine bloklarının hazırlanmasını mümkün kılar. Cihazdaki niş, 3D büyüyen yapılar için sınırlı bir alan tanımlamak ve önceki çalışmalara dayanarak sferoidlerin veya organoidlerin oluşumunu teşvik etmek için tasarlanmıştır 18,19,20,21,22,23. Cihazın bu kısmı şeffaftır ve yüksek optik kalite sağlayan belirli bir plastik içerir (kırılma indisi: 1.43; abbe değeri: 58; kalınlık: 7.8 mil [0.0078 in veya 198 μm]). Hem niş hem de çevresindeki 'yan' kısım otofloresana neden olur. Merkezdeki şeffaf niş 80 mm 2 alana sahipken, yan kısım 600 mm^2'dir. Kabın derinliği 15 mm'dir ve kalınlığı 1,5 mm'dir. Bu özellikler, cihazın büyüklüğüne ve tasarımına ek olarak, farklı tipte yüksek teknolojili mikroskoplar altında gözlemler yapmayı ve numunelerin elektron mikroskobik incelemeleri için hazırlanmasını mümkün kılmaktadır (Şekil 2). Cihazın kapatma sistemi, biri dondurucuda kapatılmış, diğeri inkübatörde gaz akışına izin veren iki konum sağlar. CCK8 proliferasyonu ve sitotoksisite testleri, geleneksel hücre kültürü yemeklerine kıyasla hücreler üzerinde benzer etkiler göstermektedir (Ek Şekil 2). Tripan mavisi dışlama testi, MD'deki hücre kültürü sırasında yüksek hücre canlılığını (% 94) göstermektedir (Şekil 3).

Tek bir cihazda bir numune için gerçekleştirilebilecek işlemler arasında (1) kültürleme, (2) histolojik boyama, (3) immünohistokimyasal ve immünofloresan etiketleme dahil immünoboyama, (4) dondurma, (5) çözülme, (6) parlak alan, karanlık alan, floresan, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi optik mikroskoplar altında inceleme, (7) doğrudan taramalı elektron mikroskobu altında kaplama ve inceleme veya (8) iletim elektron mikroskobu için hazırlık ( Şekil 2).

Histolojik boyama, immünohistokimyasal etiketleme veya organoidleri ve sferoidleri floresan olarak etiketlemek için farklı metodolojiler mevcuttur 10,11,12,13,14,24,25. Onları hidrojelden toplamak, mevcut teknolojinin ilk ve ana adımıdır. Bu adımdan sonra, bazı yöntemler bütüne monte immüno-etiketlemeye izin verir. Hasat edilen organoidler parafine gömülür, bölümlere ayrılır ve diğerlerinde boyama ve immün boyama için etiketlenir. Ancak, bölümler tüm örneği sunmayabilir ve yapının 3B mimarisiyle ilgili yalnızca sınırlı veriler sağlayabilir. Ayrıca, bu 3D yapılara verilen hasar ve antijenite kaybı, bu teknolojilerin iyi bilinen yan etkileridir.

Bu makaledeki mikroskobik incelemeler için tamamlayıcı yeni protokoller, hala bir hidrojel içinde bulunan bütün montajlı numunelerin analizine izin vermektedir. Burada açıklanan protokoller yeni geliştirilen iki formülasyonu içermektedir: immünohistokimya çözeltisi (S-IHC) ve immünofloresan etiketleme için çözelti (S-IF). Bu çözümlere sahip yöntemler, araştırmacıların daha doğru veriler elde etmelerini sağlar, çünkü santrifüjleme, pipetleme ve hassas yapıların aktarılması gibi geleneksel iş akışlarının zararlı etkileri yoktur. Burada açıklanan protokol ayrıca hasat, blokaj, temizleme ve antijen alma adımlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve tüm prosedürü 6-8 saate kısaltır. Ayrıca, metodoloji aynı S-IF'ye aynı anda bir ila üç antikor eklenmesine izin verir. Bu nedenle, burada açıklanan protokolün bir başka avantajı olan çoklu etiketleme deneylerinden sonra bile sonuçları aynı gün içinde elde etmek mümkündür; Geleneksel tam montajlı immünofloresan etiketleme protokolleri tipik olarak 3 gün ile birkaç hafta arasında sürer 10,11,12,13,14.

Antijeniteyi azaltan bir başka zararlı adım olan parafin gömme de ihmal edilir. 3D yapı, mikroskobik incelemenin başından sonuna kadar in vitro ortamında kalır. 3D yapı büyüme koşullarında kaldığından, protein ekspresyonu ve lokalizasyon verileri in vivo koşulları daha iyi taklit eder. Metodoloji, numunenin antijen ekspresyonunu etkileyen adımları ortadan kaldırdığı için daha doğru sonuçlar beklenmektedir. Tablo 1 ve Tablo 2, bu yeni protokollerin geleneksel iş akışlarına kıyasla adımları nasıl ortadan kaldırdığını, laboratuvarda zamandan ve iş gücünden nasıl tasarruf ettiğini ve maliyetleri ve atık ürünleri nasıl azalttığını göstermektedir.

Yukarıda açıklanan önemli adımlara ek olarak, başka bir sorun, numunenin 3D yapısını daha yüksek hücre canlılık oranları ^{26,27,28,29,30,31} ile korumak için bir kriyoprezervasyon ortamı ve yöntemi sağlamaktır. Kriyoprezervasyon, stabil bir model sistemi oluşturmak ve organoidlerin ve sferoidlerin biyobankacılığını sağlamak için gereklidir^32,33. Biyobankacılığın tüm orijinal 3D yapısı, doğal sağlık veya hastalık durumunun daha sadık bir şekilde özetlenmesine izin verecektir. Kriyoprezervasyonun kolaylığı ve güvenilirliği ve organoidlerin/sferoidlerin çözülmesi en önemli hususlardır. Çözülme sonrası organoid iyileşmesi çoğu güncel teknolojide çok düşüktür, genellikle% 50'den azdır. Bununla birlikte, son çalışmalar^26,27,28,29 sağkalım oranlarının artmasıyla umut verici sonuçlar göstermiştir. Lee ve ark., % 15 DMSO 28 içeren Wisconsin Üniversitesi solüsyonunu kullandıklarında sferoid hücrelerin%^78'inin kriyoprezervasyondan sonra hayatta kaldığını göstermiştir. Arai ve ^ark.29'un çalışmasında hücre sağkalım oranı% 83'e yükselmiştir. Bununla birlikte, kriyoprezervasyon sonrası sonuçlar, 3D yapılar aynı özellikleri ve kaliteyi koruyamadığından önemli ölçüde etkilenir. Ek olarak, farmasötik ve teşhis ortamlarında iyi üretim uygulamaları için serumsuz reaktifler gereklidir. Geleneksel iş akışları, yavaş dondurma yöntemi için fetal sığır serumu (FBS) ve dimetil sülfoksit (DMSO) içeren bir ortam kullanır ve her ikisi de handikaplarla ilişkilidir. FBS, hayvansal kaynaklı bir üründür ve parti varyasyonlarına sahip olabilir. DMSO çok başarılı bir kriyoprotektandır, ancak özellikle çözülme sırasında uzun süreli maruz kalma sitotoksik etkilere neden olabilir^30,31.

Bu makalede ayrıca, hala bir hidrojel halindeyken tüm organoidlerin veya sferoidlerin donma / çözülme metodolojisi açıklanmaktadır. Çalışmada organoidlerin ve sferoidlerin dondurulması için iki formül kullanılmıştır: (1) geleneksel dondurma çözeltisi (FS) içeren% 10 DMSO ve (2) serum ve DMSO içermeyen bir kriyoprezervasyon ortamı. Bu kriyoprezervasyon ortamı, mevcut formüllerden farklı olan hücre dışı matris bileşenleri içerir. Hücre dışı matris, hücresel bileşenler için fiziksel iskele için gerekli olan iki ana makromolekül sınıfı, proteoglikanlar ve lifli proteinlerden oluşur, ancak aynı zamanda doku morfogenezi, farklılaşma ve homeostaz için gerekli süreçleri başlatır 34,35,36,37,38,39,40 . Kollajenler gerilme mukavemeti sağlar, hücre yapışmasını düzenler, kemotaksisi ve migrasyonu destekler ve doku gelişimini yönlendirir³⁷. Ek olarak, elastin lifleri, tekrarlanan gerilme^38'e maruz kalan dokulara geri tepme sağlar. Üçüncü bir fibröz protein olan fibronektin, interstisyel hücre dışı matriksin organizasyonunu yönlendirir ve hücre bağlanmasına aracılık etmede çok önemli bir role sahiptir ve hücre dışı bir mekano-düzenleyici olarak işlev görür³⁹. Du ve ark. tavuk kollajen hidrolizatının doğal aktomiyozin model sistemi⁴¹ üzerindeki kriyoprotektif etkisini göstermiştir. Sonuçları, kollajen hidrolizatının buz kristali büyümesini inhibe edebileceğini, ticari kriyoprotektanlara benzer şekilde protein dondurucu-denatürasyonunu ve oksidasyonunu azaltabileceğini ve donma-çözülme döngülerinden sonra daha iyi bir jel yapısı sağlayabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, kriyoprezervasyon ortamına hücre dışı matriks bileşenlerinin eklenmesi, numune için daha güvenli ve koruyucu bir ortam sağlar ve donma-çözülme sonrası canlı yapıların iyileşmesini destekler.

Ek olarak, bu çalışma, canlı organoidlerin ve sferoidlerin sitoplazmik membranlarını ve çekirdeklerini hala hidrojel içindeyken etiketlemek için basit bir protokol tanımlamaktadır.

1. Organoidlerin ve sferoidlerin kültürlenmesi

1. Çözülmesi için hidrojeli gece boyunca (buzdolabında veya soğuk bir odada) buzun üzerine yerleştirin.
2. Ticari olarak temin edilebilen çok amaçlı cihazı (MD; bakınız Malzeme Tablosu) deneyden 1 gün önce (37 °C, %5 CO₂) inkübatöre ısıtın.
3. Steril geniş uçlu pipet uçlarını buzdolabına 4 °C'de yerleştirin.
   NOT: Adım 1.1-1.3 0. Günde, 1.4-1.11 adımları ise 1. Gün gerçekleştirilmelidir.
4. Hidrojeli 15 dakika boyunca laminer bir akış başlığında buzun üzerine yerleştirin.
   1. İsteğe bağlı: Hidrojeli üreticinin tavsiyesine göre soğuk hücre kültürü ortamında seyreltin.
5. HepG2 hücrelerinin bir peletini (ticari olarak elde edilen hepatosellüler karsinom hücre hattı; bakınız Malzeme Tablosu) içeren tüpü buzun üzerine yerleştirin.
6. Plaka 30-35 μL% 100 hidrojel bir jel damlası oluşturmak için önceden ısıtılmış cihazın nişi içinde.
7. Her hidrojel damlasının üst kısmının ortasına 10.000 HepG2 hücresi yerleştirin (Şekil 2) ve 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
8. Hidrojel damlasını% 10 Fetal Sığır Serumu ile 200 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile örtün.
9. Gaz akışına izin vermek için MD'nin kapağını doğru konumda örtün ve cihazı inkübatöre yerleştirin.
10. Hücreleri her gün% 10 FBS ile 200 μL DMEM ile besleyin.
11. Sferoidlerin büyümesini ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin (Şekil 3). Küresel oluşum 3^{. günden sonra} başlar. Video 1 , bir hidrojel kubbede farklı seviyelerde sferoidlerin yerini göstermektedir.
    NOTLAR: Hidrojeli çevreleyen sıvının nazikçe aspire edilmesi ve hidrojel damlalarının zarar görmesini önlemek için yeni sıvının yavaşça çevreye eklenmesi şiddetle tavsiye edilir.

2. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin hematoksilin ve Eozin boyanması

1. Fiksatifi ısıtın (% 4 paraformaldehit; PFA), PBS ve hematoksilin (bkz. malzeme tablosu) 37 °C'ye kadar.
2. Hidrojel damlasını çevreleyen ortamı bir pipetle aspire edin, sabitlemek için 100-200 μL% 4 PFA ekleyin ve 37 ° C'de 15-20 dakika kuluçkaya yatırın.
3. % 4 PFA'yı aspire edin ve 37 ° C'de her biri 5 dakika boyunca 3x'i yıkamak için 200 μL PBS ekleyin. Daha sonra, PBS'yi aspire edin ve 37 ° C'de 15-20 dakika boyunca 200 μL Hematoksilin çözeltisi ile inkübe edin.
4. Hematoksilin'i aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca 3x'i yıkamak için₂₀₀μL dH 2 O ekleyin. dH₂O'yu aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 200 μL etanol ile inkübe edin.
5. Etanol aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca 200 μL Eozin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin. Eozini aspire edin ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika yıkamak için₂₀₀μL dH 2 O ekleyin.
6. dH₂O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak örtmek için 100 μL gliserol ekleyin.
7. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak kayması ile monte edin. Bu adım, önemli büyüklükteki organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için atlanabilir.
8. Muayeneye kadar kurumasını önlemek için MD'nin kapağını sıkıca kapatın. Numune en az 6 ay boyunca muayene için stabildir.

3. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin immünohistokimyası

1. İmmünohistokimya için ticari olarak elde edilen çözeltiyi (S-IHC; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
2. Hidrojeldeki organoidleri veya sferoidleri, 37 ° C'de 5 dakika boyunca₂₀₀μL dH 2 O'da% 3 hidrojen peroksit (_{H2 O 2}) ile inkübe edin.
3. Hidrojen peroksit çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca dH₂O'da yıkayın. dH₂O'yu aspire edin ve her biri 10 dakika boyunca 37 ° C'de 100 μL S-IHC ile iki kez inkübe edin.
4. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 1-2 saat boyunca S-IHC'de seyreltilmiş 100 μL birincil antikor (bkz. Malzeme Tablosu) ile inkübe edin (üreticinin çalışma seyreltmesi ile ilgili tavsiyelerini takiben).
5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
6. 100 μL S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca biyotinile ikincil bir antikor (bakınız Malzeme Tablosu) ile inkübe edin.
7. Sekonder antikor çözeltisini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin. S-IHC'yi aspire edin ve streptavidin etiketli 100 μL yaban turpu peroksidaz (HRP) ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
8. HRP etiketli streptavidini aspire edin ve her biri 37 ° C'de 5 dakika boyunca 100 μL S-IHC 3x ile inkübe edin.
9. S-IHC'yi aspire edin ve 37 ° C'de 5-10 dakika boyunca 100 μL DAB / AEC kromojen çözeltisi karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
10. Boyama yoğunluğunu bir ışık mikroskobu altında izleyin.
11. Her biri 2 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
12. İsteğe bağlı: 37 ° C'de 5 dakika boyunca nükleer karşı boyama için 100 μL Hematoksilin (Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
13. Hematoksilin aspire edin ve dH₂O'da 5 dakika yıkayın.
14. dH₂O'yu aspire edin ve hidrojel damlasını montaj ortamı olarak 100 μL gliserol ile örtün.
15. Mikroskobik incelemeye kadar MD'nin kapağını sıkıca kapatın.
    NOTLAR: Antijen alımı ve protein bloke etme adımları bu protokolde ihmal edilir, çünkü S-IHC bu adımları ortadan kaldırır.

4. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin/sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi

1. Aşağıdaki malzemeleri 37 °C'ye ısıtın:% 4 PFA, PBS, S-IF, S-IF'de birincil antikor çözeltisi, S-IF'de ikincil antikor çözeltisi, nükleer leke ve gliserol (bkz.
2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve 37 ° C'de 15-30 dakika boyunca 200 μL% 4 PFA ile sabitleyin. Fiksatifi aspire edin ve her biri 37 ° C'de 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
3. Aşağıdaki adımlar sırasında nem sağlamak için nişi çevreleyen tarafa dH₂O ekleyin.
4. Hidrojel damlasını çevreleyen S-IF'yi aspire edin ve hidrojel damlasını 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL birincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
5. Birincil antikor çözeltisini aspire edin ve 37 ° C'de her biri 10 dakika boyunca S-IF 3x'te yıkayın.
6. S-IF'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de 30-60 dakika boyunca S-IF'de 100 μL ikincil antikor çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile inkübe edin.
7. İkincil antikor solüsyonunu aspire edin ve karanlıkta 37 °C'de her biri 10 dakika boyunca PBS 3x ile yıkayın.
8. PBS'yi aspire edin ve karanlıkta 37 ° C'de montaj ortamı veya gliserol içeren 100 μL nükleer-DNA lekesi ile inkübe edin.
9. Kurumasını önlemek için nişi gliserol ile doldurun.
10. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak fişi ile örtün. Organoidlerin / sferoidlerin sıkılmasını önlemek için bu adım atlanabilir.
11. MD'yi sıkıca kapatın. MD'lerdeki numuneler, en az floresan kaybı ile karanlıkta en az 6 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
12. Konfokal mikroskobik inceleme için aşağıdaki ayarları kullanın: tüm kanalların iğne deliği değerini 20,1 olarak ayarlayın, kazanç ana sabitini 488 nm için 550, 550 nm için 485 ve 594 nm için 450 olarak tutun, tüm deneyler için lazer gücünü sabit tutun ve en düşük yüzdeyi 2,0'da tutun.
    NOTLAR: Primer antikorlar: Anti-Na-K ATPaz (1:100), Anti-Arginaz (1:50), Anti-Albümin (1:50), Anti-Beta-galaktosidaz (1:25), Antimitokondriyal antikor (1:100), Anti-Golgi Antikoru (1:50), Anti-Sitokeratin 5 (1:100), Ov6 antikoru (1:100). İkincil antikorlar: Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) - 488, Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) -550, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -488, Keçi anti-Fare IgG (H + L) -550, Keçi anti-Tavuk IgY (H + L) -647. Tüm sekonder antikorlar için seyreltme 1:100'dür. Ek olarak, konjuge bir antikor olan FITC-Phalloidin (1:100 ) de kullanılır (bkz.

5. Bir hidrojel içinde canlı organoidlerin ve sferoidlerin plazma zarı ve çekirdeğin etiketlenmesi

1. Üreticinin tavsiyelerine göre (bkz. Malzeme Tablosu) Hank'in dengeli tuz çözeltisinde Alexa flor buğday tohumu aglutinin (5.0 μg / mL) ve Hoechst (2 μM) içeren etiketleme çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye kadar ısıtın.
2. Hücre kültürü ortamını aspire edin ve hidrojel damlasını örtmek için 100 μL etiketleme çözeltisi ekleyin. 37 °C'de 15-30 dakika kuluçkaya yatırın.
3. Etiketleme solüsyonunu çıkarın ve PBS 2x'te her biri 37 °C'de 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. İsteğe bağlı: 37 °C'de 15 dakika boyunca 200 μL %4 formaldehit ile sabitleyin.
4. Hidrojel damlasını montaj ortamı olarak gliserol ile örtün. İsteğe bağlı: Nişi bir kapak camı ile monte edin.
5. MD'nin kapağını sıkıca kapatın ve floresan / konfokal mikroskobik incelemeye kadar karanlıkta buzdolabında saklayın. En az 6 ay boyunca stabildir.

6. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin bir hidrojel içinde dondurulması ve çözülmesi

1. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri dondurun.
   1. Ticari olarak elde edilen dondurma çözeltisini (FS; bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'ye ısıtın.
   2. Hidrojel kubbeyi çevreleyen hücre kültürü ortamını nazikçe aspire edin.
   3. Yavaşça 200 μL FS ekleyin. Numuneyi FS ile 1 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   4. Cihazın kapağını sıkıca kapatın ve bir köpük kutuya yerleştirin. Bu köpük kutusunu, Ek Şekil 3'te gösterildiği gibi başka bir köpük kutuya yerleştirin. Her iki köpük kutuyu da sıkıca kapatın. Birbirinin içindeki iki köpük kutu, -20 °C'lik bir dondurucuda numunenin 1 ila 2°C/dak'lık bir sıcaklık soğutma gradyanı aralığını sağlar.
   5. Kutuyu 2 saat boyunca -20 °C'ye yerleştirin. Kutuyu -80 ° C'lik bir dondurucuya aktarın ve gece boyunca bırakın.
   6. Numuneyi kutulardan çıkarın. MD'deki numune -80 °C dondurucuda 6 ay boyunca saklanabilir.
   7. Numuneyi içeren MD'yi daha uzun süreli depolama için sıvı azot tankına aktarın.
2. Aşağıdaki adımları izleyerek organoidleri çözün.
   1. Numuneyi içeren MD'yi dondurucu/azot tankından çıkarın ve doğrudan 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
   2. Nişe 200 μL ılık kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 1'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   3. Nişe daha sıcak kültür ortamı ekleyin (FS'nin hücre kültürü ortamına oranı 1: 2'dir) ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
   4. Ortam ve FS karışımını nazikçe aspire edin. Hidrojeldeki tüm montajlı organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskobu (adım 7) ve iletim elektron mikroskobu (adım 8) görüntülemesine devam edin.

7. Tüm monte organoidlerin / sferoidlerin taramalı elektron mikroskopisi

1. Karnovsky'nin fiksatif ve post-fiksatif çözeltisini (bakınız Malzeme Tablosu) oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
2. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin. Numuneyi MD'de laminer akış başlığındaki buz üzerine 15 dakika boyunca yerleştirin.
3. Organoidleri / sferoidleri çevreleyen sıvılaştırılmış hidrojeli çok nazikçe aspire edin. Sınırlı miktarda matrigel, numuneye zarar vermemek ve kaybetmemek için niş içinde kalabilir.
4. Karnovsky'nin fiksatif (% 2 PFA,% 2.5 glutaraldehit 0.15 M Kakodilat tamponunda ve 2 mM CaCl₂; bakınız Malzeme Tablosu) ile RT'de 1 saat boyunca sabitleyin.
5. Fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış suyla (dH₂O) 3x yıkayın.
6. dH₂O'yu nazikçe aspire edin ve 1 saat boyunca RT'de post-fiksatif çözelti (% 1 sulu osmiyum tetroksit [OsO₄]; Malzeme Tablosuna bakınız) ile sabitleyin.
7. Post-fiksatifi nazikçe aspire edin ve her biri 15 dakika boyunca damıtılmış su (dH₂O) 3x ile yıkayın.
8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde dehidrat (% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 96,% 100), etanol / aseton karışımı (1: 1; 1: 2) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak aseton.
9. Kritik noktalı kurutucu ile kurulayın.
10. Cihazdaki numuneyi 90 sn boyunca bir püskürtme kaplayıcı kullanarak 6 nm altın / paladyum ile kaplayın (bkz.
11. Vakum modunda (5 x 10-6 mA) 2-3 kV'ta lens içi ikincil elektron dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 8,1-8,2 mm çalışma mesafesi ve 675x, 1050x ve 1570x büyütmelerde görüntüler çekin.
    NOTLAR: Tüm adımlar MD'de gerçekleştirilir. Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın.

8. Bir hidrojel içinde bütün montajlı organoidlerin / sferoidlerin iletim elektron mikroskobu

1. Karnovsky'nin sabitleyicisini 37 ° C'ye ısıtın. MD'deki hidrojeli çevreleyen hücre kültürü ortamını aspire edin.
2. Numuneyi Karnovsky'nin RT'deki fiksatif ile 1 saat sabitleyin. Her biri 15 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
3. RT'de₄₅ dakika boyunca% 2 sulu OsO 4 ve% 2.5 potasyum ferrosiyanür ile post-fix. Her biri 10 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
4. RT'de 30 dakika boyunca% 0.5 Tiyokarbohidrazit (TCH; Malzeme Tablosuna bakınız) içinde inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
5. RT'de %2 sulu OsO_4'te 30 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
6. RT'de 1 saat boyunca% 2 uranil asetat çözeltisinde (Malzeme Tablosuna bakınız) inkübe edin.
   NOT: Bu adımda, sferoidler gece boyunca 4 ° C'de tutulabilir.
7. Kurşun aspartat çözeltisinde (bakınız Malzeme Tablosu) 60 °C'de 45 dakika boyunca inkübe edin. Her biri 10 dakika boyunca dH₂O 3x ile yıkayın.
8. Derecelendirilmiş bir etanol serisinde (% 50,% 70,% 90,% 100 [x2]) ve RT'de her biri 15 dakika boyunca mutlak asetonda dehidratasyon.
9. RT'de her biri 2 saat boyunca (1:1; 1:2) aseton/Epon reçinesi ve saf Epon reçinesi (bkz. Malzeme Tablosu) karışımı ile muamele edin.
10. Reçineyi gece boyunca 60 °C'de polimerize edin (en az 16 saat). Polimerizasyondan sonra, Ek Şekil 4'te gösterildiği gibi reçine bloğunu MD'den çıkarın.
11. Reçine bloğunu reçine yapıştırıcı ile daha büyük bir bloğa takın. Bloğu kesin ve organoidlerin veya sferoidlerin konumuna ulaşın.
12. Bir ultramikrotom kullanarak yarı ince (1.000 nm) ve ultra ince kesitler (60 nm) alın (bkz.
13. Ultra ince kesitleri 100 örgü bakır ızgaraya yerleştirin ve 30 kV'luk hızlanan voltajda bir STEM dedektörü ile taramalı elektron mikroskobu altında gözlemleyin. 44 mm çalışma mesafesi ve 2580x, 5020x ve 6060x büyütmelerde görüntüler yakalayın.
    NOTLAR: Her adım için 200-250 μL çözelti kullanın. MD'de 8.1-8.10 arası adımlar gerçekleştirilir.

Bu makale, çok amaçlı bir cihazı (MD) ve kültürleme, dondurma, çözme, histolojik boyama, immünohistokimyasal boyama, immünofloresan etiketleme, kaplama ve tüm organoidlerin veya sferoidlerin işlenmesi için metodolojileri tamamlayan metodolojileri benzersiz bir şekilde tasarlanmış tek bir ortamda bir hidrojel içinde temsil etmektedir. Mevcut çalışma, 35 MD'de 35 hidrojel damlasında HepG2 karaciğer kanseri sferoidlerini hazırlamak için tasarlanmıştır. Ek olarak, MD'lerdeki akciğer organoidleri, organoid çalışmalar için mevcut metodolojilerin sonuçlarını göstermek için örnek olarak immünofloresan olarak etiketlenmiştir.

Şekil 1 , bir hidrojel kubbe içeren cihaza yakından bakmayı göstermektedir. Nişin büyüklüğü ve şekli, organoidleri / sferoidleri içeren hidrojel için koruyucu bir ortam sağlamak ve çeşitli işlemler sırasında kullanılan reaktifleri kaydetmek için tasarlanmıştır. Ek olarak, nişi çevreleyen cihazın yan kısmı, immün boyama deneyleri sırasında nem odası olarak kullanılabilir. Numuneyi besleyecek ortam, hidrojel damlasının yüksekliğine bağlı olarak 100-200 μL arasında değişebilir. Mevcut çalışma, kubbe tabanlı yönteme odaklanmaktadır, çünkü birçok hidrojel, ticari hücre dışı matris bileşenleri ve bazal membran ekstraktları kullanıcının damla hazırlamasına izin vermektedir. Bununla birlikte, MD'nin nişini hidrojel ile doldurmak ve daha sonra organoidler / sferoidler üretmek için içindeki hücreleri tohumlamak da mümkündür. Bu yöntem, matrisin viskozitesi kubbelerin hazırlanmasına izin vermiyorsa veya deney büyük miktarlarda organoid içeriyorsa tercih edilebilir. Damlaların hazırlanması için hidrojel tipi ve hidrojel / orta oran, hücre tipine, deneysel tasarıma ve ortama göre değişebilir. Şekil 1  Ayrıca, organoidler / sferoidler hala doğal in vitro ortamlarındayken, organoidleri / sferoidleri parlak alan, konfokal ve taramalı elektron mikroskopları altında araştırmayı mümkün kılan cihazın tasarımını temsil eder.

Şekil 2 , bir hidrojeldeki hücrelerin nasıl tohumlanacağını ve sferoidlerin veya organoidlerin gelişimini nasıl inceleyeceğini göstermektedir. Çok amaçlı cihazın tasarımı ve boyutları da bu şekilde sunulmuştur. Video 1, bir hidrojel içinde 3D büyüyen sferoidlerin yerini göstermektedir. Şekil 3, 3. günden 21. güne kadar büyüyen sferoidlerin canlı görüntülerini temsil etmektedir. Sferoidlerin ve organoidlerin oluşum süresi, numunenin doğasına göre değişebilir. Örneğin, HepG2 hücrelerinden ve HEK hücrelerinden gelen sferoidler 3 gün içinde oluşurken, karaciğer ve safra organoidlerinin oluşumu deneyler sırasında 2 hafta sürdü.

Hematoksilin ve Eozin lekeli sferoidler Şekil 4'te görülmektedir. Görüntü, farklı boyutlarda iyi korunmuş ve homojen olarak lekelenmiş sferoidleri ve sferoidlerin füzyonlarını temsil etmektedir. Sferoidlerin merkezindeki canlı hücreler dikkat çekicidir. Görüntü ayrıca farklı sferoidlerden gelen hücreler arasındaki hassas bağlantıları da göstermektedir. Bu kırılgan bağlantılar, aktarım, pipetleme veya santrifüjleme onlara zarar vereceğinden geleneksel iş akışlarından sonra görselleştirilemedi. Şekil 5  hepatosellüler karsinomun tanı ve prognozunda en sık görülen belirteçlerden biri olan Arginaz için spesifik antikor ile sferoidlerin immünoboyamasını gösterir42,43. Mikrograflar, aynı sferoidlerde farklılaşmış ve farklılaşmamış karaciğer kanseri hücrelerini ortaya koymaktadır. Bu şekil, Hematoksilin ile karşı boyama yapan ve olmayan görüntüleri içerir. Araştırmacılar, 3D yapıdaki etiketli alanları ayırt etmenin zor olacağı durumlarda Hematoksilin ile karşı boyamayı atlamayı seçebilirler.

Şekil 6 , bir hidrojeldeki canlı organoidlerin / sferoidlerin tam montajlı görselleştirilmesi için başka bir basit protokolü temsil eder: canlı hücre zarı ve çekirdek boyama. Metodoloji, çevre ve merkezde aynı etiketleme yoğunluğuna izin verir ve tam reaktif penetrasyonunu gösterir. Şekil 7, Şekil 8 ve Şekil 9 , sırasıyla bir, iki veya üç antikor ile etiketlenmiş sferoidlerin temsili görüntülerini göstermektedir. Bir ila üç primer antikor aynı anda S-IF'de seyreltilir. Benzer şekilde, deney için uygun olan bir ila üç eşleşen ikincil antikor aynı anda S-IF'de seyreltilir. İmmünoetiketleme protokolü, araştırmacıların 3D yapıları kaybetmeden veya zarar vermeden 4-6 saat içinde işaretlemelerini sağlar. Arka plan şeffaftır ve burada kullanılan teknoloji ek temizleme, antijen alımı veya bloke etme yöntemleri/çözümleri gerektirmez. Yöntem ayrıca araştırmacıların numuneyi tek bir adımda birden fazla antikor ile etiketlemelerini sağlar. Başka bir deyişle, kullanıcı bir ila üç birincil antikor içeren bir çözelti ve bir ila üç ikincil antikor ile eşleşen başka bir çözelti hazırlar. Burada açıklanan protokol, geleneksel metodolojilerde farklı antikorlarla sıralı etiketleme adımlarını ortadan kaldırır.

Şekil 10 , sferoidlerin tarama ve iletim elektron mikroskobik görüntülerini temsil etmektedir. İlk satır, MD'deki tüm sferoidlerin resimlerini taramalı elektron mikroskobu altında göstermektedir. İkinci sıra, MD'de bütün monte sferoidleri içeren reçine bloklarının hazırlanmasından sonra sferoidlerin iletim elektron mikroskobik görüntülerini ve ayrıca kesitli ve lekeli sferoidlerin görüntülerini içerir. İyi korunmuş sitoplazmik organeller ve hücrelerin diğer ultrayapısal özellikleri, tüm numunenin 3D yapısını koruyan bu basit protokolün etkinliğini göstermektedir. MD ayrıca araştırmacıların tüm monte edilmiş örnekleri bir hidrojel içinde dondurmalarına ve çözmelerine izin verir. Şekil 11  hidrojel kubbeleri ve sferoidleri donmadan önce ve sonra daha yüksek bir büyütmede gösterir. Hidrojel kubbenin sınırlarındaki düzensizlik dikkat çekicidir. Bununla birlikte, kriyokorunmuş sferoidlerin yuvarlaklığı, çözülmeden önce sferoidlere kıyasla çözüldükten sonra neredeyse kararlıdır. Canlı hücre zarı ve çekirdek etiketleme yöntemleri, donma / çözülme prosedürünün 3D mimarisini, hücre zarını ve hücre canlılığını nasıl etkilediğini göstermek için çözülmeden 48 saat sonra da uygulanır. Dimetil sülfoksit içeren geleneksel dondurma çözeltisi ve mevcut yeni formüle edilmiş çözelti SF, benzer sonuçlar göstermektedir. 3D yapıların% 75'inden fazlası bu protokolde hayatta kalabilir. Bununla birlikte, her formülasyonun organoidler ve sferoidler üzerindeki uzun vadeli yan etkilerini ortaya çıkarmak için daha fazla deneye ihtiyaç vardır.

Tablo 1 ve Tablo 2, geleneksel iş akışlarını adım sayısına, süreye ve atık üretimine (yani, her iş akışı için toplam plastik eldiven, pipet uçları, serolojik pipetler, santrifüj tüpleri, mikrosantrifüj tüpleri, hücre kültürü kapları, kriyovyaller vb.) göre burada açıklananlarla karşılaştırır.

Ek Şekil 1 , şematik olarak tek bir MD'de gerçekleştirilebilecek sıralı adımları temsil eder. Ek Şekil 2 , bir MD veya geleneksel cam tabanlı bir tabakta HepG2 hücrelerinin hücre canlılığını, toksisitesini ve çoğalma oranlarını karşılaştırmak için tasarlanmış deneylerin sonuçlarını göstermektedir. Ek Şekil 3 , MD'lerdeki numuneleri dondurmak için kullanılan köpük kutuları göstermektedir. Ek Şekil 4 , bir MD'den bir reçine bloğu çıkarma adımlarını özetlemektedir. Ek Şekil 5 , immünofloresan etiketli ve daha sonra hala MD'lerde iken görselleştirilen hava yolu organoidlerinin görüntülerini içerir. Benzer şekilde, Video 2, bir MD'de iki immünofloresan etiketli hava yolu organoidini göstermektedir. Son olarak, Ek Şekil 6 , geleneksel iş akışını ve burada açıklanan iş akışını kullanarak donmadan önce ve sonra canlı sferoidlerdeki hücre zarı etiketleme yoğunluğunun ortalama yoğunluğunu karşılaştıran bir grafiktir. Analiz için Image J yazılımı kullanılmıştır.

Şekil 1: Çok amaçlı hücre kültürü aygıtı (MD). (A) Cihazın orta kısmı olan niş (N), sıralı işlemler sırasında bir hidrojel damlasında (D) yetiştirilen organoidler / sferoidler için koruyucu bir ortam oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Nişin çevresindeki kısım olan yan (S), immün boyama deneyleri sırasında nemlendirici oda olarak kullanılabilir. (B) Kapaktaki şeffaf merkez, cihaz kapalıyken kullanıcının organoidleri/sferoidleri gözlemlemesini sağlar. (C) MD'deki organoidleri içeren hidrojel kubbe, iletim elektron mikroskobu için boyanabilir veya bir reçine bloğuna gömülebilir. Kapak ayrıca asılı damla metodolojisi için niş (N) içerir. Cihazın boyutu ve tasarımı, kullanıcının organoidleri / sferoidleri (D) parlak alan, (E) konfokal ve (F) taramalı elektron mikroskopları altında incelemesine izin verir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Bir hidrojel içindeki hücrelerin tohumlanması. (A) Pipetteki hücre peleti kubbenin üst kısmına yerleştirilir. 3-5 gün sonra, sferoidler kubbede, özellikle de damlanın çevresinde görünür hale gelir. (B) Bir kubbede her çeyrekten büyüyen sferoidlerin dört canlı görüntüsü yakalandı ve birleştirildi. Ölçek çubuğu = 200 μm. (C)Çok amaçlı cihazın (MD) tasarımı ve boyutları (santimetre cinsinden).

Şekil 3: 3 . günden 21. güne kadar bir hidrojel damlasında sferoidlerin geliştirilmesi. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: MD içindeki hematoksilin ve Eozin lekeli bütün montajlı sferoidler. Bitişik veya kaynaşan sferoidlerde bulunan hücreler arasındaki bağlantıların görselleştirilmesi. Hücreler (oklar) arasındaki hassas süreçler görülebilir, çünkü hidrojeldeki bütün montajlı numune, 3D büyüyen yapılara zarar vermeden sabitlenir, lekelenir ve incelenir. Ölçek çubuğu: gün 3, gün 9 = 50 μm; 7. gün, 17. gün = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MD içindeki hidrojeldeki bütün montajlı sferoidlerin immünohistokimyasal boyanması. Örnekler Arginaz'a özgü bir antikor ile immünoboyalıydı. Sereoidlerde arginaz pozitif (kırmızı oklar) ve negatif (siyah oklar) hücreler görülür. Görüntüler iki deneyden alınmıştır: (A-C) olmadan ve (D-F) Hematoksilin ile karşı boyama ile. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Hidrojeldeki canlı bir organoidin konfokal görüntüsü. Canlı organoidler canlı hücre zarı (WGA) ve çekirdek boyaları (Hoechst) ile etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Bir hidrojel içinde bir antikor ve nükleer leke (Hoechst) ile bütün monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-C) Üst panel, hücre zarındaki Na-K ATPaz için spesifik bir antikor ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. (D-F) Alt panel, karaciğer kanseri sferoidlerinde hepatosellüler karsinom için spesifik bir sitozolik protein olan Arginaz için spesifik başka bir antikorun yerini göstermektedir. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: İki antikor ve bir nükleer boya (Hoechst) içeren bir hidrojel içindeki tüm monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-C) Üst panel, albümin ve Ov6 için spesifik iki antikor ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm. (D-F) Alt panel, karaciğer kanseri sferoidlerinde alfa feto proteini ve Ov6'nın yerini gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Üç antikor ve bir nükleer boya (Hoechst) içeren bir hidrojel içindeki tüm monte sferoidlerin immünofloresan etiketlemesi. (A-E) Üst paneldeki sferoid, Arginaz, Na-K ATPaz ve beta-galaktosidaz için spesifik antikorlarla etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (F-J) Orta panel, Ov6, beta-galaktosidaz ve alfa-feto proteini ile etiketlenmiş bir sferoid gösterir. Ölçek çubuğu = 20 μm. (K-O) Alt paneldeki sferoid, FITC-faloidin, anti-mitokondriyal antikor ve anti-Golgi antikoru ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 20 μm. Yüksek etiketleme özgüllüğüne ve azaltılmış arka plana dikkat edin. Boyama protokolünün süresi: 6 saat. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Elektron mikroskobu görüntüleri. (A-C) MD'deki hidrojeldeki tüm sferoidlerin elektron mikroskobik görüntülerinin taranması. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D-F) Bir küredeki hücrelerin ultrayapısal özellikleri de bir transmisyon elektron mikroskobu altında görselleştirilmiştir. Ölçek çubukları: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: Donmadan önce ve sonra sferoidlerin canlı görüntüleri. (A-F) Hidrojel kubbelerin sınırlarının düzensizliği donma işleminden sonra belirgindir. Bununla birlikte, sferoidlerin büyüklüğü ve yuvarlaklığı benzer kalır. (F) Kültür yüzeyindeki hücre göçü çözülmeden sonra görülebilir. (G-L) Canlı hücre zarı (WGA) ve çekirdek boyama (Hoechst), MD'deki bir hidrojelde tüm sferoidlerin dondurulmasından önce ve sonra benzer hücre canlılığını ve sağlam hücre zarlarını gösterir. Ölçek basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Kısa süreli bir deney sırasında geleneksel ve yeni iş akışları arasındaki adım sayısı, zaman ve atık üretiminin karşılaştırılması.

Tablo 2: Konvansiyonel immünoetiketleme ile yeni immünoetiketleme protokolünün karşılaştırılması.

Video 1: Ters faz kontrast mikroskobu altında sferoidler içeren bir hidrojelin farklı seviyelerinde görüntülerin zaman serisi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Video 2: Sitokeratin 5 ve DAPI antikorları ile etiketlenmiş iki hava yolu organoidinin 3D yapısı. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 1: Deneye genel bakış. Bu şema, bir hidrojelde bütün monte organoidlerin yetiştirilmesi ve incelenmesi için sıralı deneysel adımları göstermektedir. Burada açıklanan teknoloji, organoidlerin farklı mikroskoplar altında yetiştirilmesini, dondurulmasını, çözülmesini, etiketlenmesini ve incelenmesini mümkün kılar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 2: Geleneksel cam tabanlı bir tabakta veya bir MD'de HepG2 hücrelerinin hücre canlılığı, toksisitesi ve çoğalma oranlarının karşılaştırılması. HepG2 hücreleri, hücre canlılığını ve toksisitesini karşılaştırmak için geleneksel bir cam tabanlı hücre kültürü kabında (A) veya (B) bir MD'de yetiştirildi. (C) Uygulanabilirliği göstermek için Trypan mavi dışlama testi kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Sonuçlar (D-E) CCK8 sitotoksisitesi ve (F) hücre proliferasyon testleri kullanılarak karşılaştırıldı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 3: İki köpük kutunun düzenlenmesi. MD'deki tüm organoidlerin veya sferoidlerin yavaş donma işlemi sırasında bir köpük kutusu diğerinin içine yerleştirilir. *iki kutuyu gösterir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 4: Reçinenin polimerizasyonundan sonra reçine bloğunun MD'den nasıl çıkarılacağını gösteren adımlar. (A) Sferoidleri veya organoidleri çevreleyen reçine bloğu, MD nişinin içinde hazırlanır ve daha sonra polimerize edilir. (B-D) Daha sonra, uygun bir ince çubukla, reçine bloğu nişten çıkarmak için itilir. (E) Daha sonra, aşağıdaki plastikle birlikte reçine bloğu çıkarılır. (F-G) Son olarak, blok hala plastiğe bağlıysa bunları ayırmak için bir çift cımbız kullanılır. (H) Blok ince kesitleme için hazırdır. Reçine bloğundaki (*) bütün montajlı organoidler veya sferoidler, iletim elektron mikroskobu için bölümlemeye hazırdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Şekil 5: İmmünofloresan etiketli ve daha sonra hala MD'lerde iken görselleştirilen hava yolu organoidleri. (A-C) Üst panel, merkezi lümenli dairesel hava yolu organoidlerini gösterir. Yeşil, organoidin en dış halkasında Sitokeratin 5'i eksprese eden hava yolu progenitör hücrelerini temsil eder ve mavi çekirdeği temsil eder. Ölçek çubuğu = 50 μm. (D-F) Alt panel, (D) DAPI ve (E) Alexa 488 filtrelerindeki iki yan yana organoidin üç boyutlu görüntüsünü ve (F) birleştirilmiş görüntüyü gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Hücrelerin canlı hücre zarları üzerindeki etiketleme yoğunluğunun karşılaştırılması. Grafik, geleneksel ve şu anda benimsenen iş akışını kullanarak donmadan önce ve sonra sferoidleri karşılaştırır. Analiz, Image J görüntü analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Kısaltmalar: IntDen = Entegre Yoğunluk (seçilen sferoidlerde floresan yoğunluğu). CTCF = Düzeltilmiş toplam hücre floresansı. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ranan Gülhan Aktaş, MD, S-IHC, S-IF ve FS patent başvurularının sahibidir. Olgu Enis Tok bu ürünlerin geliştirilmesinde yer aldı. Olgu Enis Tok ve Gamze Demirel, Celorama isimli şirketin Ar-Ge ekibi üyeleridir. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut ve Özgecan Kayalar'ın beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.