Yöntem makalesi

Burada: Silico Konakçı-Patojen Etkileşimleri Sırasında SirkRNA'ların Tanımlanması ve Karakterizasyonu

DOI:

10.3791/64565

⸱

21 Ekim 2022

 ,  ,  , 
1Institute of Biological Sciences, Faculty of Science, Universiti Malaya, 2Centre for Research in Biotechnology for Agriculture (CEBAR), Universiti Malaya

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol, konakçı-patojen etkileşimlerini inceleyen RNA dizileme transkriptom verilerinden sirkRNA'ları tahmin etmek ve işlevsel olarak karakterize etmek için gereken in silico boru hattının tamamını açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar), geri ekleme yoluyla oluşturulan kodlamayan RNA'ların bir sınıfıdır. Bu sirkRNA'lar ağırlıklı olarak çeşitli biyolojik süreçlerin düzenleyicileri olarak rolleri için incelenmiştir. Özellikle, ortaya çıkan kanıtlar, konakçı sirkRNA'ların patojenlerle (örneğin, influenza ve koronavirüsler) enfeksiyon üzerine farklı şekilde eksprese edilebileceğini (DE) göstermektedir, bu da sirkRNA'ların konakçı doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini düzenlemede bir rol oynadığını düşündürmektedir. Bununla birlikte, patojenik enfeksiyonlar sırasında sirkRNA'ların rolü üzerine yapılan araştırmalar, RNA dizileme (RNA-seq) verilerinden DE sirkRNA'larını tanımlamak için gerekli biyoinformatik analizi yapmak için gerekli bilgi ve becerilerle sınırlıdır. Biyoinformatik tahmin ve sirkRNA'ların tanımlanması, herhangi bir doğrulamadan önce ve maliyetli ve zaman alıcı ıslak laboratuvar tekniklerini kullanan fonksiyonel çalışmalardan önce çok önemlidir. Bu sorunu çözmek için, RNA-seq verilerini kullanarak sirkRNA'ların in silico tahmini ve karakterizasyonunun adım adım bir protokolü verilmiştir. Protokol dört adıma ayrılabilir: 1) CIRIquant boru hattı aracılığıyla DE sirkRNA'larının tahmini ve nicelleştirilmesi; 2) circBase yoluyla ek açıklama ve DE sirkRNA'larının karakterizasyonu; 3) Circr boru hattı üzerinden CircRNA-miRNA etkileşim tahmini; 4) Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) kullanılarak sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel zenginleştirme analizi. Bu boru hattı, sirkRNA'ların konakçı-patojen etkileşimlerindeki rolünü daha da çözmek için gelecekteki in vitro ve in vivo araştırmaları yönlendirmede yararlı olacaktır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konakçı-patojen etkileşimleri, patojenler ve konakçı organizmalar arasındaki karmaşık bir etkileşimi temsil eder, bu da konakçıların doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tetikler ve sonuçta istilacı patojenlerin uzaklaştırılmasıyla sonuçlanır 1,2. Patojenik enfeksiyonlar sırasında, konakçı immün genlerinin çoğu, patojenlerin replikasyonunu ve salınımını inhibe etmek için düzenlenir. Örneğin, patojenik enfeksiyonlar üzerinde düzenlenen yaygın interferon ile uyarılmış genler (ISG'ler) ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ve OASL 3,4'ü içerir. Protein kodlayan genlerin yanı sıra, çalışmalar ayrıca uzun kodlamayan RNA'lar (lncRNA'lar), mikroRNA'lar (miRNA'lar) ve dairesel RNA'lar (sirkRNA'lar) gibi kodlamayan RNA'ların da rol oynadığını ve patojenik enfeksiyonlar sırasında eşzamanlı olarak düzenlendiğini bildirmiştir 5,6,7. Proteinleri esas olarak fonksiyonel moleküller olarak kodlayan protein kodlayan genlerin aksine, kodlamayan RNA'ların (ncRNA'lar) transkripsiyonel ve transkripsiyon sonrası seviyelerde genlerin düzenleyicileri olarak işlev gördüğü bilinmektedir. Bununla birlikte, kodlamayan RNA'ların, özellikle sirkRNA'ların, konakçıların bağışıklık genlerini düzenlemeye katılımını içeren çalışmalar, protein kodlayan genlere kıyasla iyi rapor edilmemiştir.

SirkRNA'lar, geri ekleme8 adı verilen kanonik olmayan bir ekleme işlemi ile üretilen kovalent kapalı sürekli döngü yapıları ile yaygın olarak karakterize edilir. Geri ekleme işlemi, konyak lineer RNA'ların ekleme işleminden farklı olarak, aşağı akış donör bölgesinin yukarı akış alıcı bölgesine bağlanmasını ve dairesel şekilli bir yapı oluşturmasını içerir. Şu anda, sirkRNA'ların biyogenezi için üç farklı geri ekleme mekanizması önerilmiştir. Bunlar RNA bağlayıcı protein (RBP) aracılı daireselleştirme 9,10, intron eşleştirme güdümlü daireselleştirme 11 ve lariat güdümlü daireselleştirme12,13,14'tür. SirkRNA'ların dairesel bir yapıda uçtan uca bağlandığı göz önüne alındığında, normal ekzonükleaz sindirimlerine karşı doğal olarak dirençli olma eğilimindedirler ve bu nedenle doğrusal muadillerinden daha kararlı oldukları düşünülmektedir15. SirkRNA'lar tarafından sergilenen bir diğer ortak özellik, konakçılardaki hücre veya doku tipine özgü ekspresyonu içerir16.

Benzersiz yapıları ve hücre veya dokuya özgü ekspresyonları ile ima edildiği gibi, sirkRNA'ların hücrelerde önemli biyolojik işlevler oynadığı keşfedilmiştir. Bugüne kadar, sirkRNA'ların öne çıkan işlevlerinden biri, mikroRNA (miRNA) süngerleri olarak rolleridir17,18. SirkRNA'ların bu düzenleyici rolü, sirkRNA nükleotidlerinin miRNA'ların tohum bölgesi ile tamamlayıcı bağlanmasıyla gerçekleşir. Böyle bir sirkRNA-miRNA etkileşimi, miRNA'ların hedef mRNA'lar üzerindeki normal düzenleyici fonksiyonlarını inhibe eder, böylece19,20 genlerinin ekspresyonunu düzenler. Ek olarak, sirkRNA'ların, RNA bağlayıcı proteinlerle (RBP'ler) etkileşime girerek ve RNA-protein kompleksleri21'i oluşturarak gen ekspresyonunu düzenlediği de bilinmektedir. Her ne kadar sirkRNA'lar kodlamayan RNA'lar olarak sınıflandırılsa da, sirkRNA'ların protein translasyonu için şablon görevi görebileceğine dair kanıtlar da vardır22,23,24.

Son zamanlarda, sirkRNA'ların, özellikle konakçılar ve virüsler arasında, konakçı-patojen etkileşimlerinin düzenlenmesinde önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Genel olarak, konakçı sirkRNA'ların, istilacı patojenleri ortadan kaldırmak için konağın bağışıklık tepkilerini düzenlemeye yardımcı olduğu varsayılır. Konakçı bağışıklık tepkilerini destekleyen bir sirkRNA örneği, Guo ve ark.25 tarafından bildirilen circRNA_0082633'dir. Bu sirkRNA, A549 hücreleri içindeki tip I interferon (IFN) sinyallemesini arttırır ve bu da influenza virüsü replikasyonunu baskılamaya yardımcı olur25. Dahası, Qu ve ark. ayrıca, IFN-β 26,27'nin bir sinyal dönüştürücüsü olan CREB-bağlayıcı proteinin (CREBBP) ekspresyonunu düzenleyerek bağışıklığı teşvik eden sirkRNA AIVR adı verilen bir insan intronik sirkRNA'sını da bildirmiştir. Bununla birlikte, enfeksiyon üzerine hastalığın patogenezini desteklediği bilinen sirkRNA'lar da mevcuttur. Örneğin, Yu ve ark. yakın zamanda, konakçı hücre otofajisi28'in inhibisyonu yoluyla H1N1 virüs replikasyonunu teşvik etmede 2A genini (circGATAD2A) içeren GATA çinko parmak alanından eklenmiş bir sirkRNA'nın oynadığı rolü bildirmiştir.

SirkRNA'ları etkili bir şekilde incelemek için, genellikle genom çapında bir sirkRNA tahmin algoritması uygulanır, ardından herhangi bir fonksiyonel çalışma yapılmadan önce tahmin edilen sirkRNA adaylarının in silico karakterizasyonu yapılır. SirkRNA'ları tahmin etmek ve karakterize etmek için böyle bir biyoinformatik yaklaşım daha az maliyetli ve daha fazla zaman verimlidir. İşlevsel olarak incelenecek aday sayısını iyileştirmeye yardımcı olur ve potansiyel olarak yeni bulgulara yol açabilir. Burada, konakçı-patojen etkileşimleri sırasında sirkRNA'ların in silico tanımlaması, karakterizasyonu ve fonksiyonel ek açıklaması için ayrıntılı bir biyoinformatik tabanlı protokol sunuyoruz. Protokol, RNA dizileme veri kümelerinden sirkRNA'ların tanımlanması ve nicelleştirilmesini, circBase aracılığıyla ek açıklama yapılmasını ve sirkRNA adaylarının sirkRNA tipleri, örtüşen genlerin sayısı ve öngörülen sirkRNA-miRNA etkileşimleri açısından karakterizasyonunu içerir. Bu çalışma aynı zamanda Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizi yoluyla sirkRNA ebeveyn genlerinin fonksiyonel ek açıklamasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden hazırlanan kimliksizleştirilmiş ribozomal RNA (rRNA)-tükenmiş RNA-seq kütüphanesi veri setleri, Gen İfade Omnibus (GEO) veritabanından indirilmiş ve kullanılmıştır. Tahminden sirkRNA'ların fonksiyonel karakterizasyonuna kadar tüm biyoinformatik boru hattı Şekil 1'de özetlenmiştir. Boru hattının her bir parçası aşağıdaki bölümlerde daha ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

1. Veri analizinden önce hazırlık, indirme ve kurulum

NOT: Bu çalışmada kullanılan tüm yazılım paketleri ücretsiz ve açık kaynaklıdır.

  1. Linux platformunda gerekli araçları indirme
    1. Malzeme Tablosunda listelenen gerekli yazılım ve araçları, geliştirici tarafından sağlanan talimatları kullanarak Linux yüksek performanslı bir bilgisayara indirin ve yükleyin.
      NOT: Araçların ve yazılımların çoğunun, araçlarını yükleme ve kullanma talimatlarını içeren kendi çevrimiçi GitHub sayfaları veya belgeleri vardır ( Malzeme Tablosuna bakın).
    2. SirkRNA tespiti ve analizi için istenen RNA-seq veri setlerini dizi arşivi web sitelerinden indirin (örneğin, Avrupa Nükleotidler Arşivi ve Gen İfadesi Omnibus).
    3. RNA-seq veri setinin hazırlandığı konakçıyla uyumlu referans genomları (FASTA formatı) ve ek açıklama dosyalarını (GTF/GFF3 formatı) indirin. Ana bilgisayar referans genomları ve ek açıklama dosyaları genellikle Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI), California Santa Cruz Üniversitesi (UCSC) ve Ensembl web siteleri gibi çevrimiçi genom tarayıcılarında bulunur.
  2. RNA-seq kalite kontrolü
    1. RNA dizilerinin kalitesini belirlemek için FASTQ dosyalarını FASTQC programına girin. FASTQ dosyalarının kalitesi düşükse (örneğin, 29,30 gibi araçlar kullanılarak daha fazla kırpma gerekebilir.

2. CIRIquant kullanarak sirkRNA'ların tahmin ve diferansiyel ekspresyon analizi

NOT: Diferansiyel ifade analizinin yüklenmesi ve gerçekleştirilmesiyle ilgili daha ayrıntılı bir kılavuz, CIRIquant kağıt31'in kod kullanılabilirliği bölümünde bulunabilir. Ek veriler, bu protokolde kullanılan bazı temel komutları da içerir.

  1. CircRNA tahminleri
    1. BWA ve HISAT2 hizalayıcılarını kullanarak önce konağın referans genomunu indeksleyin. Daha sonra, bir Linux terminalinde, dizine eklemek için ana bilgisayarın referans genomunun dizininde bwa index 32 ve hisat2-build33 komutlarını çalıştırın.
    2. Ardından, dosyanın adını, araçların yolunu (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), indirilen referans dosyalarının yolunu (ana bilgisayarın referans genomu FASTA dosyaları, ek açıklama dosyaları) ve adım 2.1.1'den itibaren dizin dosyalarının yolunu içeren bir YML yapılandırma dosyası hazırlayın.
    3. Varsayılan veya manuel parametreleri kullanarak CIRIquant aracını terminalden yürütün. Kullanıcı, CIRIquant aracını çalıştırırken RNA-seq verilerinin kütüphane türünü (sarmallı veya zincirsiz) belirtebilir.
      NOT: RNA-SEQ verilerinin kütüphane tipi, kullanılan kütüphane hazırlama kitinin türü bilinerek belirlenebilir. Kütüphane hazırlama kitinin kimliği bilinmiyorsa, RNA-seq verilerinin kısıtlılığını belirlemek için RSeQC36 adı verilen bir RNA-seq kontrol biyoinformatik paketi kullanılabilir.
  2. Diferansiyel ifade analizi
    NOT: CIRIquant paketi prep_CIRIquant, prepDE.py ve CIRI_DE_replicate içerir; bu nedenle, bu üç araç için ek indirme gerekmez.
    1. Aşağıdakileri içeren bir veri listesi içeren bir metin dosyası (.lst) hazırlayın:
      1. sütun: Adım 2.1.3'te kullanılan RNA-seq verilerinin kimlikleri
      2. sütun: CIRIquant tarafından çıkarılan GTF dosyalarının yolu
      3. sütun: RNA-seq verilerinin gruplandırılması, kontrol veya tedavi edilen bir grup olup olmadığı.
    2. Bir örnek için, aşağıdaki Tablo 1'e bakın.
      NOT: Sadece referans amaçlı oldukları için başlıkları koymak gerekli değildir.
    3. Linux terminalinde, adım 2.2.1'de hazırlanan metin dosyasıyla (.lst) giriş olarak prep_CIRIquant çalıştırın. Çalıştırma bir dosya listesi oluşturur: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv ve circRNA_ratio.csv.
    4. RNA-seq ID'lerini ve ilgili StringTie çıktılarının yolunu içeren bir veri listesi içeren ikinci bir metin dosyası hazırlayın. Dosya düzeni, gruplandırma sütunu olmadan adım 2.2.1'deki metin dosyasına benzer olmalıdır.
    5. Gen sayısı matris dosyalarını oluşturmak için adım 2.2.4'te hazırlanan metin dosyasıyla prepDE.py giriş olarak çalıştırın.
    6. Son circRNA_de.tsv dosyasının çıktısını almak için adım 2.2.3'teki library_info.csv ve circRNA_bsj.csv dosyalarıyla ve adım 2.2.5'teki gene_count_matrix.csv dosyasıyla giriş olarak CIRI_DE_replicate yürütün.
  3. DE sirkRNA'larının filtrelenmesi
    1. Diferansiyel olarak ifade edilen (DE) sirkRNA'ların sayısını filtrelemek ve belirlemek üzere adım 2.2.6'dan oluşturulan circRNA_de.tsv dosyasını açmak için R (bilgisayar terminalinde veya RStudio'da) veya herhangi bir elektronik tablo yazılımını (örneğin, Microsoft Excel) kullanın.
    2. DE sirkRNA'larını LogFC kriterlerine göre filtreleyin > |2| ve FDR < 0.05.
    3. DE sirkRNA'larının bilgilerini depolamak için DE_circRNAs.txt adlı bir dosya oluşturun.

3. Öngörülen DE sirkRNA'larının karakterizasyonu ve ek açıklaması

  1. DE sirkRNA'larının ek açıklama durumu
    1. Adım 2.3.3'ten filtrelenen DE sirkRNA'larının listesinden oluşan RStudio'da DE_circRNAs.txt adlı dosyayı yükleyin. Genomik pozisyonlar (Chr, Start, End), iplikçik oryantasyonları (+ veya -), gen adı ve circRNA tipi gibi diğer bilgileri de dahil edin. Devam etmeden önce, sirkRNA genomik başlangıç koordinatlarını CIRIquant'tan 1 baz çiftini çıkararak 0 tabanlıya dönüştürün.
      NOT: Yukarıda belirtilen diğer bilgiler, CIRIquant (Ek Dosya 1) tarafından çıkarılan GTF dosyalarından elde edilebilir.
    2. Tahmin edilen DE sirkRNA'larının ek açıklama durumunu, circRNA veritabanının (örneğin, circBase) biriktirilen sirkRNA'ların genomik konumlarını içeren bir kütüphane indirerek belirleyin.
      NOT: Karşılaştırmayı yapmadan önce sirkRNA'ları tahmin etmek için kullanılan genom versiyonunun circRNA veritabanı kütüphanesi ile aynı olduğundan emin olun. Burada kullanılan circBase veri dosyası, Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37'de sağlanan sürücü klasöründe ücretsiz olarak kullanılabilir.
    3. Adım 3.1.1 ve adım 3.1.2'deki her iki dosya da hazırlandıktan sonra, Ek Dosya 1'de verilen R betiğini çalıştırın. DE sirkRNA'larının kromozomal konumları, Açıklamalı veya Açıklamasız durumu atanmadan önce kütüphaneye sorgulanır.
  2. DE sirkRNA'larının karakterizasyonu
    1. SirkRNA tiplerine (yani ekzon, intron, intergenik ve antisens) göre sirkRNA'ların sayısını ve sirkRNA'ların yayıldığı gen sayısını (1 veya >1) özetlemek için R ve diğer elektronik tablo yazılımlarını kullanın (Ek Dosya 1).NOT: CIRIquant sadece dört tip sirkRNA'yı (ekzon, intron, intergenik ve antisens) tespit edebilir. ElciRNA'lar olarak da bilinen ekzon-intron sirkRNA'lar, CIRIquant tarafından tespit edilemez.

4. Circr kullanarak circRNA-miRNA etkileşimini tahmin etme

NOT: CircRNA-miRNA etkileşim analizi için Circr'nin nasıl kurulacağı ve kullanılacağı hakkında daha ayrıntılı bir kılavuz şu adreste bulunabilir: https://github.com/bicciatolab/Circr37.

  1. Dosyaların hazırlanması
    1. "WinRar" veya "7-zip" gibi ilgili yazılımları kullanarak Circr GitHub sayfasından indirdikten sonra Circr.zip dosyasının içeriğini açın ve analizin yapılacağı yeni bir dizine çıkarın.
    2. CircRNA-miRNA analizini yapmadan önce önkoşul yazılım uygulamalarını (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools ve samtools) yükleyin.
    3. İlgilenilen çeşitli organizmalar için referans genomlar ve ek açıklama dosyaları, rRNA koordinatları dosyası, doğrulanmış miRNA etkileşim dosyası ve circBase circRNA dosyaları, Circr yazarı tarafından Github sayfasında (https://github.com/bicciatolab/Circr)37 sağlanmıştır. Sürücü klasöründeki destek dosyalarına tıkladıktan sonra, ilgilenilen organizmanın klasörünü, miRNA klasörünü ve circBase metin dosyasını seçin ve indirin.
    4. Adım 4.1.3'te gerekli dosyaları indirdikten sonra, adım 4.1.1'de belirtilen dizinde support_files adında yeni bir dizin oluşturun. Ardından, sıkıştırılmış içeriği açın ve support_files dizinine ayıklayın.
    5. Samtools faidx komutunu kullanarak ilgili organizmanın referans genom dosyasını indeksleyin (Ek Dosya 1).
    6. Tablo 2'de gösterildiği gibi, sekmeyle ayrılmış bir BED dosyasındaki ilgili DE sirkRNA'larının koordinatlarından oluşan bir giriş dosyası hazırlayın.
      NOT: CIRIquant tarafından tahmin edilen sirkRNA'lar 0 tabanlı olmadığından, bunları BED formatına dönüştürmeden önce başlangıç koordinatında (adım 3.1.1'de belirtildiği gibi) eksi 1 bp olması gerekir. Tablo 2'de gösterilen başlıklar yalnızca referans amaçlıdır ve BED dosyalarında gerekli değildir.
    7. Bu noktada, Circr analizi için beklenen klasör ağacı yapısının Şekil 2'deki gibi olduğundan emin olun.
  2. Koşu Circr.py
    1. Python 3 kullanarak Circr.py yürütün ve bağımsız değişkenler olarak, circRNA giriş dosyasını, ilgili organizmanın FASTA genomunu, seçilen organizmanın genom sürümünü, iş parçacığı sayısını ve çıktı dosyasının adını komut satırında belirtin.
    2. İlgilenilen organizma adım 4.1.3'te listelenen sürücü klasöründe sağlanmamışsa veya kullanıcı analizi çalıştırmak için özel bir dosya kümesine sahip olmayı tercih ediyorsa, Circr.py yürütülürken bu dosyaların konumunu belirten ek komutların eklenmesi gerekir.
    3. Circr analizi tamamlandıktan sonra, program csv formatında bir circRNA-miRNA etkileşim dosyası çıkarır.
    4. SirkRNA-miRNA etkileşim sonuçlarını kullanıcıya özel tercihe göre filtreleyin. Bu çalışma için, tahminler aşağıdaki kriterlere göre Rstudio kullanılarak filtrelenir:
      -Her üç yazılım aracı tarafından da algılandı
      -Hem Targetscan hem de miRanda tarafından bildirilen iki veya daha fazla bağlama bölgesi
      -"AGO" veya "doğrulanmış" sütunlarında tanımlanır
      -Hiçbir tohum bölgesi etkileşimini filtreleme
    5. Adım 4.2.3'teki filtrelenmiş koşulları geçiren sirkRNA'ları circRNA_miRNA.txt adlı yeni bir metin dosyasına yazın. Bu tür filtreleme, tahmin edilen etkileşimlerin güvenilirliğini artırabilir.

5. CeRNA ağının inşası

NOT: Cytoscape'in nasıl kullanılacağına dair ayrıntılı bir kılavuz şu adreste bulunabilir: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ ve https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

  1. İndirme ve hazırlama
    1. Cytoscape38'in en son sürümünü şuradan indirin: https://cytoscape.org/download.html.
    2. Adım 5.1.1'de indirilen yükleyici sihirbazını çalıştırın ve Cytoscape yazılımı için dosya konumunu seçin.
    3. İlgilenilen sirkRNA'ları ve hedef miRNA'larını içeren sekmeyle ayrılmış bir dosya hazırlayın. İlk sütun circRNA adından oluşur; ikinci sütun, ilk sütundaki RNA tipini belirtir; üçüncü sütun hedef miRNA'dır; ve dördüncü sütun, üçüncü sütundaki RNA tipini belirtir. Dosyanın bir örneği Tablo 3'te gösterilmiştir.
  2. CeRNA ağ haritasının oluşturulması
    1. Adım 5.1.2'de yüklü olan Cytoscape yazılımını açın.
    2. Cytoscape'te, Dosya'ya gidin > Dosya'dan > Ağı İçe Aktar'a gidin. 5.1.3 adımında hazırlanmış olan dosyayı seçin.
    3. Yeni sekmede, birinci ve ikinci sütunu "Kaynak Düğüm" ve "Kaynak Düğüm Özniteliği" olarak seçerken, üçüncü ve dördüncü sütunu sırasıyla "Hedef Düğüm" ve "Hedef Düğüm Özniteliği" olarak seçin. Tamam'a tıklayın ve ağ Cytoscape'in sağ üst tarafında görünecektir.
    4. Ağın görsel stilini değiştirmek için, Cytoscape'in sol tarafındaki Stil düğmesine basın.
    5. Dolgu Rengi'nin sağ tarafındaki oka basın. Sütun için Tür'ü ve eşleme türü için Ayrık Eşleme'yi seçin. Ardından, RNA tiplerinin her biri için istenen rengi seçin.
    6. Rengi değiştirdikten sonra, Şekil'e gidip adım 5.2.5'i izleyerek düğümlerin şeklini değiştirin.

6. Fonksiyonel zenginleştirme analizi

  1. SirkRNA'ların ebeveyn geni için Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) analizi
    1. clusterProfiler 39,40 ve org'dan emin olun. Hs.eg.db Rstudio'ya 41 paket yüklendi. Kuruluş. Hs.eg.db41 paketi, yalnızca insanlar için genom çapında bir ek açıklama paketidir. İlgilenilen organizma başka bir türse, aşağıdakilere bakın: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
    2. Adım 2.3.1'deki DE_circRNA bilgilerini Rstudio çalışma alanına aktarın.
    3. Sonraki adımlarda zenginleştirme analizi için bu dosyada sağlanan sirkRNA'ların ebeveyn genini kullanın. Bununla birlikte, kullanıcı gen sembolünü Entrez ID gibi diğer biçimlere dönüştürmek isterse, "bitr" gibi bir işlev kullanın.
    4. Gen kimliğini girdi olarak kullanarak, varsayılan parametreleri kullanarak clusterProfiler 39,40 paketindeki enrichGO işlevini kullanarak GO zenginleştirme analizini çalıştırın.
    5. Gen kimliğini girdi olarak kullanarak, varsayılan parametreleri kullanarak clusterProfiler39,40 paketindeki enrichKEGG işlevini kullanarak KEGG zenginleştirme analizini çalıştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki bölümde listelenen protokol, Linux OS sistemine uyacak şekilde değiştirilmiş ve yapılandırılmıştır. Bunun temel nedeni, sirkRNA'ların analizinde yer alan çoğu modül kütüphanesinin ve paketinin yalnızca Linux platformunda çalışabilmesidir. Bu analizde, Influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden hazırlanan tanımlanmamış ribozomal RNA (rRNA) tükenmiş RNA-seq kütüphanesi veri setleri, GEOveritabanı 42'den indirildi ve temsili sonuçları üretmek için kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün faydasını göstermek için, influenza A virüsü ile enfekte olmuş insan makrofaj hücrelerinden RNA-seq örnek olarak kullanılmıştır. Konakçı-patojen etkileşimlerinde potansiyel miRNA süngerleri olarak işlev gören sirkRNA'lar ve bir konakçı içinde GO ve KEGG fonksiyonel zenginleştirmeleri araştırıldı. Çevrimiçi olarak çeşitli sirkRNA araçları olmasına rağmen, her biri birbiriyle etkileşime girmeyen bağımsız bir pakettir. Burada, sirkRNA tahmini ve nicelleştirmesi, sirkRNA fonksiyonel zenginleştirme, sirkRNA-miRN...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar, bu makaleyi eleştirel bir şekilde gözden geçirdikleri için Tan Ke En ve Dr. Cameron Bracken'e teşekkür eder. Bu çalışma, Temel Araştırma Hibe Programı (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ve Malaya Üniversitesi Yüksek Etkili Araştırma Bursu (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BedtoolsGitHubhttps://github.com/arq5x/bedtools2/Bölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr için gerekli.
BWABurrows-Wheeler Hizalayıcıhttp://bio-bwa.sourceforge.net/Bölüm 2.1.1 ve 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant'ı çalıştırmak ve genomu indekslemek için
gereklidir CircrGitHubhttps://github.com/bicciatolab/CircrBölüm 4'e atıfta bulunarak. miRNA bağlanma bölgelerini tahmin etmek için kullanın
CIRIquantGitHubhttps://github.com/bioinfo-biols/CIRIquantBölüm 2.1.3'e atıfta bulunarak. CircRNA'ları tahmin etmek için
ClusterprofilerGitHubhttps://github.com/YuLab-SMU/clusterProfilerBölüm 7'ye atıfta bulunarak. GO ve KEGG fonksiyonel zenginleştirme
CPUIntel  Intel(R) Xeon(R) CPU E5-2620 V2 @ 2.10 GHz    Çekirdekler: 6 çekirdekli CPU Bellek: 65 GB Ekran kartı: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000) Bu protokolün tamamını çalıştırmak için kullanılan özellikler.
CytoscapeCytoscapehttps://cytoscape.org/download.htmlBölüm 5.2'ye atıfta bulunarak. CeRNA ağını planlamak için gerekli
FastQCBabraham Bioinformaticshttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Bölüm 1.2.1'e atıfta bulunarak. Fastq dosyalarında kalite kontrolü
HISAT2http://daehwankimlab.github.io/hisat2/Bölüm 2.1.1 ve 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant'ı çalıştırmak ve Linux
Ubuntu 20.04.5 LTS (Focal Fossa)https://releases.ubuntu.com/focal/Tüm protokolü çalıştırmak için gereklidir. Diğer Ubuntu sürümleri, protokolü yürütmek için hala geçerli olabilir.
miRandahttp://www.microrna.org/microrna/getDownloads.doBölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr
Pybedtoolsiçin gereklidir pybedtools 0.8.2https://pypi.org/project/pybedtools/BED dosyası genomik manipülasyonu Python
Python 2.7 ve 3.6 veya aboverhttps://www.python.org/downloads/Gerekli kütüphane modüllerini çalıştırmak için
RKapsamlı R Arşiv Ağıhttps://cran.r-project.org/Veri çerçevelerini
RNAhybridBiBiServhttps://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybridBölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr
RStudioRStudioiçin gereklidir https://www.rstudio.com/ R samtools'uçalıştırmak için bir çalışma alanı
 SAMtoolshttp://www.htslib.org/Bölüm 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant StringTie'yi çalıştırmak için gereklidir
Johns Hopkins Üniversitesi: Hesaplamalı Biyoloji Merkezihttp://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtmlBölüm 2.1.2'ye atıfta bulunarak. CIRIquant TargetScan GitHub'ı çalıştırmak için gereklidir
https://github.com/nsoranzo/targetscanBölüm 4.1.2'ye atıfta bulunarak. Circr için gerekli
genomunu indekslemek için gereklidir için gereklidir işlemek için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Raman, K., Bhat, A. G., Chandra, N. A systems perspective of host-pathogen interactions: predicting disease outcome in tuberculosis. Molecular BioSystems. 6 (3), 516-530 (2010).
  2. Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
  3. Yang, E., Li, M. M. H. All About the RNA: Interferon-stimulated genes that interfere with viral RNA processes. Frontiers in Immunology. 11, 605024(2020).
  4. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: A complex web of host defenses. Annual Review of Immunology. 32 (1), 513-545 (2014).
  5. Shirahama, S., Miki, A., Kaburaki, T., Akimitsu, N. Long non-coding RNAs involved in pathogenic infection. Frontiers in Genetics. 11, 454(2020).
  6. Chandan, K., Gupta, M., Sarwat, M. Role of host and pathogen-derived microRNAs in immune regulation during infectious and inflammatory diseases. Frontiers in Immunology. 10, 3081(2019).
  7. Chen, X., et al. Circular RNAs in immune responses and immune diseases. Theranostics. 9 (2), 588-607 (2019).
  8. Kristensen, L. S., et al. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nature Reviews Genetics. 20 (11), 675-691 (2019).
  9. Ashwal-Fluss, R., et al. circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Molecular Cell. 56 (1), 55-66 (2014).
  10. Conn, S. J., et al. The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs. Cell. 160 (6), 1125-1134 (2015).
  11. Zhang, X. O., et al. Complementary sequence-mediated exon circularization. Cell. 159 (1), 134-147 (2014).
  12. Robic, A., Demars, J., Kuhn, C. In-depth analysis reveals production of circular RNAs from non-coding sequences. Cells. 9 (8), 1806(2020).
  13. Eger, N., Schoppe, L., Schuster, S., Laufs, U., Boeckel, J. N. Circular RNA splicing. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1087, 41-52 (2018).
  14. Barrett, S. P., Wang, P. L., Salzman, J. Circular RNA biogenesis can proceed through an exon-containing lariat precursor. eLife. 4, 07540(2015).
  15. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  16. Misir, S., Wu, N., Yang, B. B. Specific expression and functions of circular RNAs. Cell Death and Differentiation. 29 (3), 481-491 (2022).
  17. Bai, S., et al. Construct a circRNA/miRNA/mRNA regulatory network to explore potential pathogenesis and therapy options of clear cell renal cell carcinoma. Scientific Reports. 10 (1), 13659(2020).
  18. Sakshi, S., Jayasuriya, R., Ganesan, K., Xu, B., Ramkumar, K. M. Role of circRNA-miRNA-mRNA interaction network in diabetes and its associated complications. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 26, 1291-1302 (2021).
  19. Hansen, T. B., et al. miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA. The EMBO Journal. 30 (21), 4414-4422 (2011).
  20. Lu, M. Circular RNA: functions, applications, and prospects. ExRNA. 2 (1), 15(2020).
  21. Liu, K. S., Pan, F., Mao, X. D., Liu, C., Chen, Y. J. Biological functions of circular RNAs and their roles in occurrence of reproduction and gynecological diseases. American Journal of Translational Research. 11 (1), 1-15 (2019).
  22. Pamudurti, N. R., et al. Translation of CircRNAs. Molecular Cell. 66 (1), 9-21 (2017).
  23. Legnini, I., et al. Circ-ZNF609 Is a circular RNA that can be translated and functions in myogenesis. Molecular Cell. 66 (1), 22-37 (2017).
  24. Weigelt, C. M., et al. An insulin-sensitive circular RNA that regulates lifespan in Drosophila. Molecular Cell. 79 (2), 268-279 (2020).
  25. Guo, Y., et al. Identification and characterization of circular RNAs in the A549 cells following Influenza A virus infection. Veterinary Microbiology. 267, 109390(2022).
  26. Qu, Z., et al. A novel intronic circular RNA antagonizes influenza virus by absorbing a microRNA that degrades CREBBP and accelerating IFN-β production. mBio. 12 (4), 0101721(2021).
  27. Kawarada, Y., et al. TGF-β induces p53/Smads complex formation in the PAI-1 promoter to activate transcription. Scientific Reports. 6 (1), 35483(2016).
  28. Yu, T., et al. Circular RNA GATAD2A promotes H1N1 replication through inhibiting autophagy. Veterinary Microbiology. 231, 238-245 (2019).
  29. Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  30. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  31. Zhang, J., Chen, S., Yang, J., Zhao, F. Accurate quantification of circular RNAs identifies extensive circular isoform switching events. Nature Communications. 11 (1), 90(2020).
  32. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  33. Kim, D., Paggi, J. M., Park, C., Bennett, C., Salzberg, S. L. Graph-based genome alignment and genotyping with HISAT2 and HISAT-genotype. Nature Biotechnology. 37 (8), 907-915 (2019).
  34. Pertea, M., et al. StringTie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nature Biotechnology. 33 (3), 290-295 (2015).
  35. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  36. Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).
  37. Dori, M., Caroli, J., Forcato, M. Circr, a computational tool to identify miRNA:circRNA associations. Frontiers in Bioinformatics. 2, 852834(2022).
  38. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  39. Wu, T., et al. clusterProfiler 4.0: A universal enrichment tool for interpreting omics data. The Innovation. 2 (3), 100141(2021).
  40. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS: A Journal of Integrative Biology. 16 (5), 284-287 (2012).
  41. Carlson, M. org.Hs.eg.db: Genome wide annotation for human. 2022. R package version 3.15.0. , Available from: https://bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html (2022).
  42. Barrett, T., et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets-update. Nucleic Acids Research. 41, 991-995 (2012).
  43. Gao, Y., Zhang, J., Zhao, F. Circular RNA identification based on multiple seed matching. Briefings in Bioinformatics. 19 (5), 803-810 (2018).
  44. Zhang, X. O., et al. Diverse alternative back-splicing and alternative splicing landscape of circular RNAs. Genome Research. 26 (9), 1277-1287 (2016).
  45. Memczak, S., et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature. 495 (7441), 333-338 (2013).
  46. Wang, K., et al. MapSplice: Accurate mapping of RNA-seq reads for splice junction discovery. Nucleic Acids Research. 38 (18), 178(2010).
  47. Song, X., et al. Circular RNA profile in gliomas revealed by identification tool UROBORUS. Nucleic Acids Research. 44 (9), 87(2016).
  48. Hansen, T. B. Improved circRNA identification by combining prediction algorithms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 20(2018).
  49. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: A bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  50. Ma, X. K., et al. CIRCexplorer3: A CLEAR pipeline for direct comparison of circular and linear RNA expression. Genomics Proteomics Bioinformatics. 17 (5), 511-521 (2019).
  51. Gaffo, E., Buratin, A., Dal Molin, A., Bortoluzzi, S. Sensitive, reliable and robust circRNA detection from RNA-seq with CirComPara2. Briefings in Bioinformatics. 23 (1), (2022).
  52. Glažar, P., Papavasileiou, P., Rajewsky, N. circBase: a database for circular RNAs. RNA. 20 (11), New York, N.Y. 1666-1670 (2014).
  53. Tan, S., et al. Circular RNA F-circEA-2a derived from EML4-ALK fusion gene promotes cell migration and invasion in non-small cell lung cancer. Molecular Cancer. 17 (1), 138(2018).
  54. Guarnerio, J., et al. Oncogenic role of Fusion-circRNAs Derived from cancer-associated chromosomal translocations. Cell. 165 (2), 289-302 (2016).
  55. McGeary, S. E., et al. The biochemical basis of microRNA targeting efficacy. Science. 366 (6472), (2019).
  56. Enright, A. J., et al. MicroRNA targets in Drosophila. Genome Biology. 5 (1), 1(2003).
  57. Rehmsmeier, M., Steffen, P., Hochsmann, M., Giegerich, R. Fast and effective prediction of microRNA/target duplexes. RNA. 10 (10), 1507-1517 (2004).
  58. Zhang, D., et al. AllEnricher: a comprehensive gene set function enrichment tool for both model and non-model species. BMC Bioinformatics. 21 (1), 106(2020).
  59. Zhou, Y., et al. Metascape provides a biologist-oriented resource for the analysis of systems-level datasets. Nature Communications. 10 (1), 1523(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

D ng sel RNA larDiferansiyel EkspresyonRNA DizilemeBiyoenformatik AnalizCircRNA TahminiCircRNA KarakterizasyonuGen Ontolojisi AnaliziKEGG Zenginle tirmeCircRNA MiRNA Etkile imi

İlgili makaleler