Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Tiffany Snow; Jon Roussey; Casey Wegner; Brandon McNaughton

doi:10.3791/64573

Yöntem makalesi

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

DOI:

10.3791/64573

⸱

23 Aralık 2022

Tiffany Snow¹ , Jon Roussey¹ , Casey Wegner¹ , Brandon McNaughton²

¹Research and Development, Akadeum Life Sciences, ²Akadeum Life Sciences

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC'lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC'lerden CD3 ⁺ hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28'e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB'ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1'in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şu anda dünya çapında 500'den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır¹. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyo....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu

NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli CD3⁺ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar.

Ticari olarak elde edilen 3 x 10⁸ PBMC'leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
Streptavidin mikrokabarcıklarını (SAMB'lar) üreticinin rapor ettiği SAMB konsantrasyonuna göre 0.5 (SAMB miktarı):....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücreleri satın alınan PBMC'lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC'ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmamasını sağladı. Şekil 2'deki deneyse.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunun a.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, gönderim sırasında, mikrokabarcık ayırma ürünleri üreten ve satan Akadeum Life Sciences'ın çalışanlarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Merkaptoetanol	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Biologix Çok Kuyulu Kültür Plakaları 24 kuyulu plakalar	VWR	76081-560
Biotin anti-insan CD28 (28.2) Antikor	Biolegend	302904
Biotin anti-insan CD3 (OKT3) Antikor	Biolegend	317320
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Gibco	14190-136
GlutaMAX Takviyesi	Thermofisher	35050061
İnsan Rekombinant IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Lentiviral Parçacık rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Lökopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
Normal İnsan PBMC'leri	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Doku kültürü için Penisilin / Streptomisin 100X	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polibren Enfeksiyon / Transfeksiyon Reaktifi	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS: 28728-55-4
Havuzlanmış İnsan AB Serumu Plazmadan Türetilmiş Isı İnaktive	Edilmiş Yenilikçi Araştırma	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi, HEPES	Gibco	72400047
Streptavidin Mikrokabarcık Kiti (Akadeum'un ayırma tamponunu içerir)Akadeum		11110-000

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

T Cell Isolation Microbubble Activation Peripheral Blood Mononuclear T Cell Expansion Buoyancy Activated Cell Sorting CD3 Positive Selection Anti CD28 Microbubbles Flow Cytometry T Cell Exhaustion Activation Marker CD69

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler