Method Article

Flotasyon Bazlı T Hücresi İzolasyonu, Aktivasyonu ve Mikrokabarcıklar Kullanılarak İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücre Örneklerinden Genişleme

DOI:

10.3791/64573

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  , 
1Research and Development, Akadeum Life Sciences, 2Akadeum Life Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, primer insan T hücrelerini izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için yüzdürme bazlı ayırmanın fizibilitesini göstermektir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücrelerini ex vivo kültürler oluşturmak için periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) izole etme süreci, araştırma, klinik testler ve hücre bazlı tedaviler için çok önemlidir. Bu çalışmada, PBMC'lerden T hücrelerini ex vivo olarak izole etmek, aktive etmek ve genişletmek için basit, yeni bir protokol sunulmuştur. Bu çalışma, T hücrelerini izole etmek ve aktive etmek için işlevselleştirilmiş yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) teknolojisini kullanmaktadır. Kısaca, protokol, lökopak türevi PBMC'lerden CD3 + hücrelerinin pozitif seçimini içerir, ardından 24 delikli plakalarda transdüksiyondan önce önceden konjuge anti-CD28'e bağlı streptavidin mikrokabarcıkları (SAMB'ler) ile 48 saatlik bir birlikte stimülasyon yapılır. İşlevselleştirilmiş mikro kabarcıklar, hücreleri yüzdürücü bir şekilde aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunarak, minimum tükenme ile genişlemeye izin veren proliferatif fenotiplere yol açar. Bu teknik, yardımcı uyarıcı mikro kabarcıklar yüzer kalır ve kültür ortamının tepesine geri döner, böylece genişleyen hücrelerin birlikte uyarıcı faktörlerle temas halinde olduğu süreyi azaltır. Sonuçlar, izole edilmiş ve kültürlenmiş T hücrelerinin aktive etmek ve çoğalmak için yeterli stimülasyon aldığını, ancak aşırı PD-1'in varlığının gösterdiği gibi aşırı aktivasyona yol açacak ölçüde değil, daha sonra tükenmeye yol açtığını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şu anda dünya çapında 500'den fazla kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücre tedavisi klinik çalışması yürütülmektedir ve piyasada dört CAR-T hücre tedavisi ürünü bulunmaktadır1. Bununla birlikte, bu potansiyel olarak iyileştirici tedavilerin etkinliğini, ölçeklenebilirliğini ve uzun vadeli başarısını artırmak için ele alınması gereken çok sayıda CAR-T hücre araştırması ve üretim ihtiyacı hala mevcuttur 2,3,4,5. Evlat edinilmiş CAR-T hücresi klinik araştırması ve üretimi, periferik bir kan örneğinden T hücresi izolasyonu ve ardından izole hücrelerin uyarılması, transdüksiyonu ve genişlemesi ile başlar. T hücresi geri kazanımı, saflık ve aktivasyon / tükenme sinyalleri gibi parametreler, CAR-T hücre araştırması ve üretimi için hücre izolasyonu ve stimülasyon tekniklerini seçerken dikkatli bir şekilde dikkate alınmalıdır 3,4,6. Önemli olarak, terapötik etkinliği arttırmak için T hücresi tükenmesi gibi mevcut üretim süreçlerinden kaynaklanan biyolojik engelleri en aza indirgeyerek CAR-T hücre tedavilerinin terapötik kalıcılığında iyileşme gereklidir 6,7.

Floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve manyetik aktive hücre sıralama (MACS) gibi geleneksel hücre izolasyon yöntemlerine alternatif olarak, burada, T hücresi izolasyonu için mikro kabarcıklarla yüzdürme ile aktive edilmiş hücre sıralama (BACS) gösterilmektedir. Mikrokabarcık ayırma, hedefleri bağlamak ve bunları sıvı numunelerinin yüzeyine yüzdürmek için yüzdürücü, içi boş mikrosferler (mikro kabarcıklar) kullanır 8,9. Mikrokabarcıkları antikorlarla (yani anti-CD3) işlevselleştirerek, istenen T hücresi popülasyonları periferik kan örneklerinden pozitif olarak seçilebilir. Daha sonra, süspansiyonda pozitif seçilmiş T hücrelerini birlikte uyarmak ve aktive etmek için farklı bir antikor işlevselleştirilmiş mikrokabarcık popülasyonunun (yani, anti-CD28) kullanımı bu çalışmada gösterilmiştir. Mikrokabarcıklar, askıya alınmış hücre kültürü ve genetik modifikasyon ve genişleme gibi aşağı akış uygulamaları için hazır T hücreleri üreten basit ve oldukça ayarlanabilir bir izolasyon ve aktivasyon iş akışı sunar. Kritik olarak, mikro kabarcıklarla yüzdürücü hücre aktivasyonu, aşırı T hücresi tükenmesini önlemek için kısıtlanmış hücre stimülasyonunu teşvik eder7.

Bu çalışma için, akış sitometrisi, işlevselleştirilmiş mikrokabarcıkların izolasyon, aktivasyon ve transdüksiyon başarısını analiz etmek ve transdüksiyon sonrası büyüme ve genişleme aşamalarında mevcut olan spesifik alt popülasyonlar hakkında ayrıntılı bilgi sağlamak için kullanılan birincil araçtır. Akım sitometrisine ek olarak, hücre sağlığını, morfolojisini ve transdüksiyon başarısını doğrulamak için parlak alan ve floresan mikroskobu kullanıldı. Bu sonuçlara dayanarak, mikrokabarcık teknolojisi ve protokolü, günümüzde kullanılmakta olan geleneksel izolasyon ve aktivasyon yöntemlerine daha ayarlanabilir ve daha yumuşak bir alternatif sunmaktadır; Özellikle, mikrokabarcıkla aktive olmuş hücreler, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunu, endüstri standardı aletler ve kitlerle tipik olarak gözlemlenenden önemli ölçüde daha düşük gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pozitif seleksiyon kullanılarak T hücrelerinin mikrokabarcıklarla izolasyonu

NOT: Bu protokol, SAMB'leri kullanan küçük ölçekli CD3+ pozitif seçim yaklaşımını ayrıntılarıyla açıklar.

  1. Ticari olarak elde edilen 3 x 108 PBMC'leri, 1 milyon hücre (25 ng / M) başına 25 ng antikor konsantrasyonunda biyotinile anti-CD3 (OKT3) antikoru ile 2.5 mL ayırma tamponunda inkübe edin. Yukarı ve aşağı pipetleyerek, yavaşça karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
  2. Streptavidin mikrokabarcıklarını (SAMB'lar) üreticinin rapor ettiği SAMB konsantrasyonuna göre 0.5 (SAMB miktarı):1 (hücre miktarı) oranında ekleyin.
  3. Oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 20 rpm'de ticari bir uçtan uca (EOE) rotatör kullanarak karıştırın. Oda sıcaklığında 400 x g'da 5 dakika santrifüj.
  4. Santrifüjlemeden sonra, pozitif olarak seçilen hücreler SAMB'lerle süspansiyonun en üstünde olacaktır. Kalan seçilmemiş hücreler, tüpün altındaki hücre peletinde olacaktır. 9 inç cam pipet kullanarak, ucu kabarcık hücresi tabakasının altına tüpün altına yerleştirin, hücre peletini ve subnatantını elektronik bir pipetle aspire edin ve yeni bir tüpe aktarın.

2. Pozitif seçilmiş T hücrelerinin birlikte uyarılması (aktivasyonu)

  1. Orijinal tüpte kalan kabarcık hücresi katmanını 1 mL'lik tam T hücre ortamında (veya istenen başka bir ortamda) yeniden askıya alın.
  2. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak brightfield mikroskobu ile subnatanttaki hücreleri sayın ve kabarcık hücresi katmanında yakalanan hücre sayısını belirlemek için bu değeri başlangıç hücre numarasından çıkarın.
  3. Bu adımdan önce, konjuge anti-CD28 SAMB'leri oluşturmak için biyotinile anti-CD28 antikoru ticari SAMB'lerle en az 2 saat karıştırın. Konjugasyon için gereken anti-CD28 antikoru miktarını belirlemek için SAMBs üreticisine başvurun. Anti-CD28 konjuge SAMB'leri, 1.5 (anti-CD28 SAMB'ler):1 (hücreler) oranını kullanarak adım 2.1'den kaynaklanan kabarcık hücresi süspansiyonuna ekleyin.
  4. EOE rotasyonunu kullanarak 15 dakika boyunca karıştırın ve ardından toplam hacmi, adım 2.2'de elde edilen hücre sayısına göre tam T hücre ortamı veya istenen başka bir ortam ile mL başına 2 milyon hücreye ayarlayın.

3. Hücre kültürü ortamında birlikte uyarılan hücrelerin genişlemesi

  1. Adım 2.4'ten 1 mL aktive edilmiş hücreyi, 24 delikli bir plakada kuyucuk başına 2 M / mL konsantrasyonda dağıtın. 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe inkübe edin.
  2. 24 saat sonra, 0. günde kaplanan ilk hücre sayısı kullanılarak hesaplandığı gibi, genişlemeyi daha da teşvik etmek için 50 U / mL IL-2 ve 25 ng / M çözünür anti-CD3 (OKT3) ekleyin. Hücre plakasını nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe etmesine izin verin.

4. İsteğe bağlı: Aktive olmuş T hücrelerinin lentivirüs ile transdüksiyonu

NOT: Burada kullanılan yaklaşım Prommersberger ve ark.'dan uyarlanmıştır. 10.

  1. Lentivirüsü oda sıcaklığında çözün ve pipetleyerek, kısaca karıştırın.
  2. Orta natant, 600 μL'yi, şu anda kuyunun dibinde bulunan yavru hücrelere veya çözeltinin yüzeyinde kalan kabarcık tabakasına dokunmadan her bir kuyucuktan yavaşça çıkarın.
  3. Viral transdüksiyonu arttırmak için kuyu başına 5 μg / mL hekzadimetrin bromür ekleyin. Lentiviral parçacıkları 3'lük bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) ekleyin (hücre başına lentiviral parçacıklar).
  4. Yavaş hızlanma ve yavaşlama için ara vermeden plakayı 800 x g ve 32 °C'de 45 dakika boyunca santrifüj yapın. Hücreleri nemlendirilmiş bir CO2 inkübatöründe 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
  5. 4 saat sonra, her bir kuyucuğa 600 μL ticari olarak temin edilebilen, taze tam T hücresi ortamı ve 50 U / mL IL-2 ekleyin ve hücre plakasını T hücresi genişlemesi için 37 ° C'de nemlendirilmiş CO2 inkübatörüne geri yerleştirin.

5. T hücrelerinin genişlemesi (önceden transdüksiyon olsun veya olmasın)

  1. Her 2 günde bir, ortamın yarısını orta natanttan çıkarın, taze, tam T hücresi ortamı ile değiştirin ve 50 U / mL'lik bir konsantrasyonda IL-2 ekleyin.
  2. Hücre yoğunluğunu değerlendirmek için T hücrelerini haftada iki kez sayın. Hücre yoğunluğu 2 x 10 6-2.5 x 106 hücre / mL'yi aştığında, hücreleri daha büyük bir kaba aktarın ve 5 x 105 hücre / mL'ye seyreltin.

6. T hücrelerinin toplanması ve akış sitometrisi

  1. Her bir kuyucuğun içeriğini yukarı ve aşağı pipetleyerek yavaşça karıştırın. Mikro kabarcıklar da dahil olmak üzere kuyunun tüm içeriğini çıkarın ve bunları 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
  2. Her bir oluğu 400 μL kalsiyum içermeyen ve magnezyum içermeyen DPBS (-/-) ile yıkayın ve çözeltiyi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj.
  3. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 50 μL ayırma tamponunda yeniden askıya alın.
  4. Aktivasyon ve tükenme antikoru / boyama kokteyli ile lekeleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Boyama kokteyllerini aşağıdaki gibi hazırlayın - aktivasyon kokteyli: AF700-CD3, PE / Göz Kamaştırma-CD4, PE / Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; Tükenme kokteyli: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
  5. 1 mL ayırma tamponu ekleyin ve yavaşça karıştırın. Fazla antikorları yıkamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin.
  6. Hücre peletini 1 mL ayırma tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometri analizi için uygun bir kaba (örneğin, bir FACS tüpü, 96 delikli bir plaka, vb.) aktarın. Önerilen akış sitometri analizi geçit şeması Şekil 1'de detaylandırılmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T hücreleri satın alınan PBMC'lerden izole edildi ve protokolde açıklandığı gibi aktivasyon için kaplandı. Negatif kontrol örnekleri (satın alınan PBMC'ler) etkinleştirilmedi. Bu kontrol örnekleri, mikrokabarcık aktivasyon sürecinin, el değmemiş ve uyarılmamış T hücresi kontrollerine kıyasla deneysel numuneler üzerindeki etkisini göstermek için dahil edildi ve gözlemlenen aktivasyon belirteçlerinin eklenen aktivasyon faktörlerinin sonucu olmasını ve T hücrelerinin kendilerine özgü olmamasını sağladı. Şekil 2'deki deneyse...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanan protokol, PBMC örneklerinden T hücrelerinin izolasyonuna ve mikrokabarcıklarla kültür ortamındaki askıya alınmış T hücrelerinin aktivasyonuna izin verir. Bu yöntem, doğal kaldırma kuvveti hücrelere eş-uyarıcı sinyaller vermek ve bir kültür ortamında askıya alınırken bunları aktive etmek için eşsiz bir fırsat sunan işlevselleştirilmiş mikro kabarcıklara dayanır, böylece genişleyen hücrelerin uzun süreli stimülasyona maruz kalmasını azaltır; Bu tür aşırı uyarım, T hücresi tükenme belirteçlerinin ekspresyonunun a...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, gönderim sırasında, mikrokabarcık ayırma ürünleri üreten ve satan Akadeum Life Sciences'ın çalışanlarıdır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-MerkaptoetanolGibco21985-023CAS: 60-24-2
Biologix Çok Kuyulu Kültür Plakaları 24 kuyulu plakalarVWR 76081-560
Biotin anti-insan CD28 (28.2) AntikorBiolegend302904
Biotin anti-insan CD3 (OKT3) AntikorBiolegend317320
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yokGibco14190-136
GlutaMAX TakviyesiThermofisher35050061
İnsan Rekombinant IL2 BioVision (vwr)10006-122
Lentiviral Parçacık rLV.EF1.zsGreen1-9Takara Bio0038VCT
LökopakBioIVTHUMANLMX100-0001129
Normal İnsan PBMC'leriBioIVTHUMANHLPB-0002562
Doku kültürü için Penisilin / Streptomisin 100XVWR97063-708CAS: 8025-06-7
Polibren Enfeksiyon / Transfeksiyon ReaktifiMillipore SigmaTR-1003-GCAS: 28728-55-4
Havuzlanmış İnsan AB Serumu Plazmadan Türetilmiş Isı İnaktiveEdilmiş Yenilikçi AraştırmaISERABHI100mL
RPMI 1640 Orta, GlutaMAX Takviyesi, HEPESGibco72400047
Streptavidin Mikrokabarcık Kiti (Akadeum'un ayırma tamponunu içerir)Akadeum11110-000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
  2. Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell manufacturing processes during pivotal clinical trials. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 16, 136-144 (2019).
  3. Stock, S., Schmitt, M., Sellner, L. Optimizing manufacturing protocols of chimeric antigen receptor T cells for improved anticancer immunotherapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (24), 6223(2019).
  4. Rohaan, M. W., Wilgenhof, S., Haanen, J. B. A. G. Adoptive cellular therapies: The current landscape. Virchows Archiv. 474 (4), 449-461 (2019).
  5. Abou-El-Enein, M., et al. Scalable manufacturing of CAR T cells for cancer immunotherapy. Blood Cancer Discovery. 2 (5), 408-422 (2021).
  6. Poltorak, M. P., et al. Expamers: A new technology to control T cell activation. Scientific Reports. 10, 17832(2020).
  7. Kagoya, Y., et al. Transient stimulation expands superior antitumor T cells for adoptive therapy. JCI Insight. 2 (2), 89580(2017).
  8. Snow, T., Roussey, J., Wegner, C., McNaughton, B. Application No. 63/326,446. US Patent. , 63/326,446 (2022).
  9. McNaughton, B., et al. Application No. 16/004,874. US Patent. , 16/004,874 (2018).
  10. Prommersberger, S., Hudecek, M., Nerreter, T. Antibody-based CAR T cells produced by lentiviral transduction. Current Protocols in Immunology. 128 (1), 93(2020).
  11. Wijewarnasuriya, D., Bebernitz, C., Lopez, A. V., Rafiq, S., Brentjens, R. J. Excessive costimulation leads to dysfunction of adoptively transferred T cells. Cancer Immunology Research. 8 (6), 732-742 (2020).
  12. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: Differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. Journal of Translational Medicine. 8, 104(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

T Cell IsolationMicrobubble ActivationPeripheral Blood MononuclearT Cell ExpansionBuoyancy Activated Cell SortingCD3 Positive SelectionAnti CD28 MicrobubblesFlow CytometryT Cell ExhaustionActivation Marker CD69

Related Articles