Method Article

Virüs Yayılımı ve Hücre Bazlı Kolorimetrik Miktar Tayini

DOI:

10.3791/64578

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Tropical Infectious Diseases Research and Education Centre (TIDREC), Higher Institution Center of Excellence (HICoE), Universiti Malaya, 2Department of Medical Microbiology, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, Zika virüsünün (ZIKV) Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinde yayılımını ve 24 oyuklu ve 96 oyuklu (yüksek verimli) formatlarda hücre bazlı kolorimetrik immüno-tespit yöntemleri kullanılarak ZIKV'nin miktar tayinini açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika virüsü (ZIKV), Flavivirus cinsine ait sivrisinek kaynaklı bir virüstür. ZIKV enfeksiyonu, yetişkinlerde konjenital beyin anormallikleri ve potansiyel olarak Guillain-Barré sendromu ile ilişkilendirilmiştir. Hastalık mekanizmalarını anlamak için ZIKV ile ilgili araştırmalar, aşı ve tedavi geliştirmeyi kolaylaştırmak için önemlidir. Virüsleri ölçme yöntemi, viroloji alanında çok önemli ve temeldir. Odak oluşturma testi (FFA), viral antijeni antikorlarla tespit eden ve peroksidaz immün boyama tekniğini kullanarak hücrelerin enfeksiyon odaklarını tanımlayan bir virüs miktar tayini testidir. Mevcut çalışma, hem 24 kuyulu hem de 96 kuyulu (yüksek verimli) formatları kullanarak virüs yayılım ve miktar tayini protokolünü açıklamaktadır. Diğer benzer çalışmalarla karşılaştırıldığında, bu protokol, bu testin diğer virüsler için kullanımını genişletmek için bir kılavuz görevi görebilecek odak boyutu optimizasyonunu daha ayrıntılı olarak tanımlamıştır. İlk olarak, 3 gün boyunca Vero hücrelerinde ZIKV yayılımı gerçekleştirilir. ZIKV içeren kültür süpernatanı, FFA kullanılarak hasat edilir ve miktar tayini yapılır. Kısaca virüs kültürü Vero hücrelerine aşılanır ve 2-3 gün inkübe edilir. Odak oluşumu daha sonra hücre fiksasyonu, geçirgenleştirme, blokaj, antikor bağlanması ve peroksidaz substratı ile inkübasyon dahil olmak üzere optimize edilmiş boyama işlemlerinden sonra belirlenir. Boyanmış virüs odakları, bir stereo mikroskop (24 oyuklu formatta manuel sayım) veya yazılım analizörü (96 oyuklu formatta otomatik sayım) kullanılarak görselleştirilir. FFA, tekrarlanabilir, nispeten hızlı sonuçlar (3-4 gün) sağlar ve plak oluşturmayan virüsler de dahil olmak üzere farklı virüsler için kullanılmaya uygundur. Daha sonra, bu protokol ZIKV enfeksiyonunun incelenmesi için yararlıdır ve klinik olarak önemli diğer virüsleri tespit etmek için kullanılabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zika virüsü (ZIKV) enfeksiyonu, sivrisinek kaynaklı viral bir hastalıktır. ZIKV'nin ilk izolasyonu 1947'de Uganda'daydı 1,2; 1947'den 2007'ye kadar ihmal edildi, çünkü klinik semptomlar en sık asemptomatik ve kendi kendini sınırlayan ateşli hastalık ile karakterizedir. 2007 yılında, Zika salgını Yap adalarındabaşladı 3,4, ardından Pasifik bölgelerinde (Fransız Polinezyası, Paskalya Adası, Cook Adaları ve Yeni Kaledonya) 2013'ten 2014'e kadar daha büyük salgınlar 5,6,7,8, burada ciddi nörolojik komplikasyon Guillain-Barré sendromu (GBS) yetişkinlerde ilk kez bildirildi9. 2015 ve 2016 yıllarında, ilk yaygın ZIKV salgını, 2013 gibi erken bir tarihte Brezilya'da ZIKV'nin Asya genotipinin ortaya çıkmasından sonra Amerika'yı kasıp kavurdu10. Bu salgın sırasında, yeni doğan bebeklerde 440.000 ila 1.3 milyon mikrosefali ve diğer nörolojik bozukluklar bildirilmiştir11. Şu anda ZIKV enfeksiyonu için spesifik bir tedavi veya tedavi yoktur; bu nedenle, özellikle hamilelik sırasında enfeksiyonları önleyebilen ZIKV aşılarına acil bir tıbbi ihtiyaç vardır.

Virüs ölçümü, bir numunede bulunan virüslerin sayısını belirleme işlemidir. Araştırmada önemli bir rol oynar ve akademik laboratuvarlar tıp ve yaşam bilimleri gibi birçok alanı içerir. Bu süreç, viral aşıların, rekombinant proteinlerin, viral antijenlerin veya antiviral ajanların üretimi gibi ticari sektörlerde de önemlidir. Virüs ölçümü için birçok yöntem veya tahlil kullanılabilir12. Yöntemlerin veya tahlillerin seçimi normalde virüs özelliklerine, istenen doğruluk düzeyine ve deney veya araştırmanın doğasına bağlıdır. Genel olarak, virüsleri ölçme yöntemleri iki kategoriye ayrılabilir: viral nükleik asidin (DNA veya RNA) varlığını tespit eden moleküler testler ve in vitro12'de virüs enfektivitesini ölçen testler. Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR, DNA için) veya kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR, RNA için)13 ve dijital damlacık PCR14 , belirli bir numunedeki viral nükleik asidi ölçmek için kullanılan yaygın moleküler tekniklerin örnekleridir15. Bununla birlikte, bu son derece hassas moleküler teknikler, canlı ve cansız virüsler arasında ayrım yapamaz15. Bu nedenle, hücreler üzerindeki virüs enfektivitesi gibi biyolojik özellikler hakkında bilgi gerektiren araştırmalar, yukarıda belirtilen moleküler teknikler kullanılarak tamamlanamaz; Canlı virüslerin varlığını ölçebilen ve belirleyebilen tahlillere ihtiyaç vardır. Virüs enfektivitesini ölçen testler arasında plak oluşturma testi (PFA), %50 doku kültürü enfeksiyöz dozu (TCID50), floresan odak testi ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM)12 bulunur.

1952'de Renato Dulbecco tarafından geliştirilen PFA, ZIKV16 da dahil olmak üzere virüs titrasyonu için en yaygın kullanılan yöntemlerden biridir. Enfeksiyöz litik viryonlar için viral konsantrasyonları doğrudan belirlemek için kullanılır. Yöntem, bir litik virüsün, viral enfeksiyondan sonra aşılanmış bir hücre tek tabakasında sitopatik etkiler (CPE'ler; hücre ölümü veya plaklar, enfekte olmamış hücrelerle çevrili bir enfeksiyon alanı) üretme yeteneğine dayanmaktadır. Bununla birlikte, tahlilin faydasını etkileyen birkaç dezavantajı vardır. Test zaman alıcıdır (virüslere bağlı olarak yaklaşık 7-10 gün sürer), CPE'ye bağımlıdır ve hatalara eğilimlidir. Bu çalışmada, 24 oyuklu plaka ve 96 oyuklu plaka formatlarında ZIKV'yi tespit etmek ve ölçmek için bir immünokolorimetrik teknik olan odak oluşturma testi (FFA) bildirilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Virüs yayılımı

  1. Hücre hazırlığı
    1. Vero hücrelerini,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş 12 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) içeren 75cm'lik 2 hücre kültürü şişesinde büyütün (bkz. Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    2. Hücreleri mikroskop altında izleyin; hücreler %70-90 birleşmeye ulaştığında kullanıma hazırdır (Şekil 1A).
      NOT: Vero hücreleri yaklaşık olarak her 24 saattebir ikiye katlanır. 1:10'luk seyreltmelerin 75cm2'lik bir şişede %80-90 birleşmeye ulaşması 3 ila 4 gün sürmelidir. Hücreleri günlük veya gün aşırı izleyin.
  2. Hücre tek tabakasının enfeksiyonu
    1. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak büyüme ortamını hücre kültürü şişesinden çıkarın. Şişeyi 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 3 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (dPBS) 2x ile durulayın.
      NOT: Şişelerden/plakalardan atılan bulaşıcı sıvı atıkları dezenfekte etmek için %10 sodyum hipoklorit içeren bir beher hazırlanmalıdır.
    2. Hücre kültürü şişesine 2 mL serumsuz DMEM (FBS'siz 2 mM L-glutamin ile desteklenmiş DMEM) ve 20 μL ZIKV aşısı ekleyin. Virüs adsorpsiyonuna izin vermek için şişeyi oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayarak inkübe edin.
      NOT: İlk ZIKV stoğunun titrasyonu, ZIKV aşı ilavesinin hacmini belirlemeye yardımcı olacaktır (2. adım).
      DİKKAT: ZIKV, biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) patojen olarak sınıflandırılmıştır. ZIKV içeren malzemelerle yapılan tüm prosedürler sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde yürütülmeli ve uygun kişisel koruyucu ekipmanla tüm laboratuvar standart işletim prosedürlerine (SOP'ler) uyulmalıdır.
  3. Bindirme ortamının eklenmesi
    1. 1 saatlik inkübasyondan sonra, seyreltilmiş virüs inokulumunu 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak çıkarın ve atın. Hücre kültürü şişesini 3 mL dPBS 2x ile durulayın.
    2. Enfekte olmuş hücreleri korumak için hücre kültürü şişesine 12 mL bakım ortamı (% 2 FBS, 2 mM L-glutamin ve 100 U / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM) ekleyin.
    3. Enfekte olmuş Vero hücrelerini% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir hücre kültürü inkübatöründe 3 gün boyunca inkübe edin.
      NOT: Enfekte Vero hücrelerinin CPE'sini mikroskop altında günlük olarak izleyin.
  4. ZIKV içeren hücre kültürü süpernatantının toplanması
    1. Enfeksiyondan sonraki 3. günde, hücre yuvarlaklaşması ve ayrılması (CPE) gözlenebilir (Şekil 1B-D). ZIKV içeren hücre kültürü süpernatanı, 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne hasat edin.
    2. Hücre kültürü süpernatantını filtrelemek için 0.22 μm Polietersülfon şırınga filtresi ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. 500 μL filtrelenmiş hücre kültürü süpernatantını 2.0 mL'lik vidalı kapaklı tüplere ayırın ve daha fazla kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Hasat edilen ZIKV, uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir.
      DİKKAT: Şırınga iğnesi kullanılıyorsa, iğne cildi delebileceğinden ekstra önlemler alınmalıdır. Laboratuvar SÇP'leri oluşturulmalıdır.

2. Virüs ölçümü

  1. Hücre hazırlığı
    1. Belirlenmiş plakalarda (24 oyuklu plaka: 0.5 mL/oyuk, 7.5 x 104 hücre/oyuk; 96 oyuklu plaka: 0.1 mL/oyuk, 1.5 x 104 hücre/oyuk) tohum Vero hücreleri ve plakayı gece boyunca bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de %5 CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Test edilecek beş farklı zaman noktası vardır (24 oyuklu plaka: enfeksiyondan sonra 48 saat, 60 saat, 72 saat, 84 saat ve 96 saat; 96 oyuklu plaka: 24 saat, 36 saat, 48 saat, 60 saat ve enfeksiyondan 72 saat sonra); Bu nedenle, her zaman noktası için bir tabak hazırlayın.
    2. 24 saatlik inkübasyondan sonra ve hücreler %70-90 birleşmeye ulaştığında (Şekil 1E), plak enfeksiyona hazırdır. Hücre tek tabakasının enfeksiyonundan önce seyreltilmiş virüs stoğunu (adım 2.2) hazırlamaya devam edin.
  2. Virüs seyreltme
    1. 24 ve 96 oyuklu plakalar için, negatif kontrol de dahil olmak üzere on kat seyreltme (10-1 ila 10-5) gerçekleştirmek için her plaka için altı steril 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın. 24 oyuklu bir plaka için deney kurulumu için, altı mikrosantrifüj tüpünün tümüne 450 μL serumsuz DMEM ekleyin. 96 oyuklu bir plaka için deney kurulumu için, altı tüpe 135 μL serumsuz DMEM ekleyin.
      NOT: On kat seri seyreltmeyi gerçekleştirmeden önce içeriğinin seyreltilmesini belirtmek için her tüpü açıkça etiketleyin.
    2. Seri seyreltme gerçekleştirmek için, 24 oyuklu plaka deney kurulumu için, 1. adımdan hasat edilen 50 μL ZIKV stoğunu, 450 μL serumsuz DMEM içeren 10-1 tüpüne ekleyin. 96 oyuklu plaka deney düzeneği için, 135 μL serumsuz DMEM içeren 10-1 tüpe 15 μL ZIKV stoğu ekleyin.
    3. Virüsü ve ortamı karıştırmak için her tüpü girdaplayın. Bu ilk on kat seyreltmedir.
      NOT: Doğru seri seyreltmeyi sağlamak için her bir seyreltme tüpünde virüs ve kültür ortamının uygun şekilde karıştırılması gerekir.
    4. 24 oyuklu plaka deney düzeneği için, 10-1 tüpü yeniden süspanse etmek için yeni bir pipet ucu kullanın ve 50 μL seyreltilmiş ZIKV'yi ikinci bir on kat seyreltme olarak 10-2 tüpe aktarın. 96 oyuklu plaka deney düzeneği için, 10-1 tüpü yeniden süspanse etmek için yeni bir pipet ucu kullanın ve 15 μL seyreltilmiş ZIKV'yi ikinci bir on kat seyreltme olarak 10-2 tüpe aktarın.
    5. Beşinci tüpe kadar 2.2.4 adımını dört kez tekrarlayın (negatif kontrol hariç).
      NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için her pipetleme adımından sonra yeni bir pipet ucu kullanın.
  3. Hücre tek tabakasının enfeksiyonu
    1. Şartlandırılmış ortamı her bir oyuktan çıkarın ve atın (24 oyuklu plaka: 0,5 mL/oyuk; 96 oyuklu plaka: 0,1 mL/oyuk).
    2. Her bir kuyucuğu dPBS 2x (24 oyuklu plaka: 300 μL/oyuk; 96 oyuklu plaka: 60 μL/oyuk) ile durulayın.
    3. En yüksekten en düşüğe doğru çalışarak, seri olarak seyreltilmiş her bir virüs aşısını kuyucuğa ekleyin (24 oyuklu plaka: 200 μL/oyuk; 96 oyuklu plaka: 40 μL/oyuk).
      NOT: Her seyreltmenin enfeksiyonu, çoğaltılmış kuyucuklarda gerçekleştirilecektir. Negatif kontrol olarak enfekte olmamış iki kuyu koruyun. Karışıklığı önlemek için plakayı ve kuyuları net bir şekilde etiketleyin. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her pipetleme adımından sonra pipet uçlarını değiştirin.
    4. Virüs adsorpsiyonuna izin vermek için plakayı oda sıcaklığında 1 saat hafifçe sallayarak inkübe edin.
  4. Kaplama hücre kültürü ortamının eklenmesi
    1. 1 saatlik inkübasyondan sonra, virüs süspansiyonunu en düşük konsantrasyondan en yükseğe çıkarın ve atın.
    2. Enfekte olmuş hücreleri dPBS 2x ile yıkayın (24 oyuklu plaka: 300 μL/kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 60 μL/kuyucuk).
    3. Kuyuyu DMEM (% 2 FBS, 2 mM L-glutamin ve 100 U / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş) ve% 1.5 düşük viskoziteli karboksimetil selüloz (CMC; Malzeme Tablosuna bakınız) (24 oyuklu plaka: 1 mL / oyuk; 96 oyuklu plaka: 0,2 mL / oyuk).
    4. Plakayı bir hücre kültürü inkübatöründe 37 °C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
      NOT: Bu inkübasyon süresi boyunca plakayı rahatsız etmeyin.
    5. Farklı zaman noktalarında boyama için plakayı hücre kültürü inkübatöründen çıkarın (24 oyuklu plaka: enfeksiyondan sonra 48 saat, 60 saat, 72 saat, 84 saat ve 96 saat; 96 oyuklu plaka: 24 saat, 36 saat, 48 saat, 60 saat ve enfeksiyondan 72 saat sonra).

3. Boyama

  1. Hücre fiksasyonu
    1. Belirli inkübasyon saatlerinden sonra (24 oyuklu plaka: enfeksiyondan sonra 48 saat, 60 saat, 72 saat, 84 saat ve 96 saat; 96 oyuklu plaka: 24 saat, 36 saat, 48 saat, 60 saat ve enfeksiyondan sonra 72 saat), kaplama ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın. 96 oyuklu plaka için, kaplama ortamını çıkarın ve atın ve hücreleri çok kanallı bir pipetle 3x 60 μL/kuyucuk 1x PBS ile yıkayın.
    2. Hücreleri sabitlemek için% 4 paraformaldehit ekleyin (24 oyuklu plaka: 300 μL/kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 60 μL/oyuk). Plakayı oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
      DİKKAT: Paraformaldehit, katı polimerize bir formaldehittir. Su ile karıştırıldığında veya ısıtıldığında formaldehit gazı açığa çıkaran yanıcı, katı, beyaz kristal bir tozdur. Paraformaldehit kullanımını içeren tüm prosedürler, formaldehit içeren kimyasallara özgü laboratuvar SOP'lerine uygun olarak sertifikalı bir kimyasal çeker ocakta veya onaylı tükenmiş muhafazalarda gerçekleştirilmelidir.
    3. 20 dakika sonra paraformaldehiti atın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın. 3.2-3.5 adımlarını izleyerek geçirgenlik, blokaj ve antikor inkübasyonlarını gerçekleştirin.
      NOT: %4 paraformaldehit atarken, üniversite veya enstitünün atık bertaraf prosedürünü izleyin.
  2. Hücre geçirgenliği
    1. Hücrelere nüfuz etmek için% 1 oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanol ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (24 oyuklu plaka: 200 μL/kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 40 μL/kuyucuk). Plakayı oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
    2. 15 dakika sonra, oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanolü atın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın.
  3. Engelleme
    1. Numunedeki spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için %3 yağsız süt ekleyin (24 oyuklu plaka: 500 μL/kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 100 μL/oyuk). Plakayı oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
    2. 2 saat sonra,% 3 yağsız sütü atın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın.
      NOT: Bu bir durma noktasıdır. % 3 yağsız süt eklendikten sonra, plakalar primer antikor yerleştirilmeden 2 gün öncesine kadar 4 ° C'de saklanabilir.
  4. Primer antikor inkübasyonu
    1. % 1 yağsız süt (1: 1.000 oranı) (24 oyuklu plaka: 200 μL / kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 40 μL / kuyucuk) ile seyreltilmiş anti-flavivirüs monoklonal antikoru, 4G2 (klon D1-4G2-4-15; birincil antikor, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Plakayı 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    2. 1 saat sonra, monoklonal antikor içeren çözeltiyi çıkarın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın.
  5. İkincil antikor inkübasyonu
    1. % 1 yağsız sütte (1: 1.000 oranında) seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG ikincil antikoru ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (24 oyuklu plaka: 200 μL / kuyu; 96 oyuklu plaka: 40 μL / kuyu). Plakaları 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    2. 1 saat sonra, ikincil antikoru içeren çözeltiyi çıkarın ve hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın.
  6. Yüzey inkübasyonu
    1. 3,3'diaminobenzidin (DAB) peroksidaz substratı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve plakayı karanlıkta 30 dakika inkübe edin (24 oyuklu plaka: 200 μL/kuyucuk; 96 oyuklu plaka: 40 μL/kuyucuk). 30 dakika sonra, kuyucukları suyla yıkayarak reaksiyonu durdurun.
    2. Plakaları gece boyunca havayla kurutun ve plakalar tamamen kuruduktan sonra odak sayımına devam edin.

4. Virüs titresinin belirlenmesi

  1. Manuel odak sayım işlemi (24 kuyulu format)
    1. Odaklar stereo mikroskop altında görselleştirilebilir. 50-200 odak üreten seyreltmeyi seçin.
    2. Seçilen seyreltmenin her bir kopyası için odakları sayın. Seçilen dilüsyonların her biri için ortalama odak sayısını hesaplayın.
    3. Aşağıdaki formülle her numune için mL başına odak oluşturma birimini (FFU/mL) hesaplayın: FFU/mL = sayılan ortalama odak sayısı/(seyreltme x eklenen seyreltilmiş virüs hacmi).
  2. Otomatik odak sayma işlemi (96 kuyucuklu format)
    1. 96 kuyulu plakayı ticari bir yazılım analizöründe tarayın.
      1. Açmak için yazılıma çift tıklayın (Malzeme Tablosuna bakın).
      2. Paketleri Değiştir'e tıklayın ve paketin uygun olan herhangi birine geçtiğinden emin olun (Ek Şekil 1A). Tamam'a tıklayın.
      3. Scan > Full plate scan (Ek Şekil 1B) seçeneğine tıklayarak taramayı başlatın.
      4. Yakalama formatının 96 kuyucuklu format olduğundan emin olmak için Dashboard'a tıklayın (Ek Şekil 2A).
      5. Merkezleme modunu "Otomatik Ön Hizalama Kullanıcı Onaylı" olarak seçin (Ek Şekil 2B).
      6. Plakayı yüklemek için Çıkar'a tıklayın.
        NOT: Plakanın kapağını açın ve Sıra A üstte olacak şekilde yukarı doğru yerleştirin (Ek Şekil 3A).
      7. Plaka adını girin ve Tamam'a tıklayın. Plakayı yüklemek için Yükle'ye tıklayın.
      8. Taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın. Bundan sonra, "Yukarı, Aşağı, Sol, Sağ" düğmelerini kullanarak A1, A12 ve H1 konumlarını kalibre edin ve Onayla'ya tıklayın (Ek Şekil 3B).
        NOT: Yazılım her kuyuyu taramaya başlayacaktır.
      9. Tarama tamamlandığında, bir genel bakış görüntüsü açılacaktır. Kapat'a tıklayın.
      10. Panoya geri dön'e tıklayarak taramadan çıkın.
    2. Yazılımı kullanarak 96 oyuklu plakayı sayın.
      1. Count > Smart Count'u (Akıllı Sayım) tıklayın.
      2. Yazılımda, "Adım 1/5: Sayılacak plakaları seçin" gösterecektir. Yük plaka(lar)ına tıklayın. Tüm klasörü işaretleyin ve taranan plakayı içe aktarmak için Seç'e tıklayın (Ek Şekil 4A).
      3. Yazılımda, "Adım 2/5: Sayma parametrelerini tanımlayın" gösterecektir. Parametreleri ayarla'ya tıklayın, parametreler görüntülenecektir (dağıtma işlemi; küçük/normal/büyük/en büyük/en büyük +1; nokta ayrımı; sayılan alan; arka plan dengesi; lif çıkarma; geçit).
        NOT: Bir kuyu ile başlayın ve tüm kuyular için en iyi ayarları bulmak için ileri geri kontrol edin.
      4. İşiniz bittiğinde, İleri'ye tıklayın (Ek Şekil 4B).
      5. Yazılımda, "Adım 3/5: Kuyuları seçin/seçimi kaldırın" gösterecektir. Sayılacak kuyu seçimi tamamlandıktan sonra, devam etmek için İleri'ye tıklayın.
        NOT: Sayılmak üzere seçilen kuyucuklar, her kuyunun sağ üst köşesinde bir "C" ile görünecektir (Ek Şekil 5A).
      6. Yazılımda, "Adım 4/5: Çıktı Ayarları" gösterecektir. Ayarların (görüntü formatı gibi) uygun olup olmadığını kontrol etmek için Çıktı Ayarlarını Görüntüle/Değiştir'e tıklayın. Kaydet ve > Çık'a tıklayın (Ek Şekil 5B).
      7. Yazılımda, "Adım 5/5: Otomatik Sayımı Başlat" gösterecektir. Otomatik Sayımı Başlat'a tıklayın (Ek Şekil 6A).
      8. Tamamlandığında, Otomatik Sayımdan Çık'a tıklayın.
  3. Ticari yazılım analizöründe kalite kontrol (QC) gerçekleştirin.
    1. Santral sayfasında, Kalite Kontrol > Plaka(lar) ekle'ye tıklayın. Sayılan plakayı içe aktarmak için tüm klasörü işaretleyin, QC'yi Seç > Başlat'a tıklayın (Ek Şekil 6B).
    2. Noktaları denetlemek için her bir kuyuya çift tıklayın. Herhangi bir noktayı kaldırmak için Sayım'a tıklayın. Yazılım saymaya başlayacaktır.
      NOT: "Spotlar: Kaldır" seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Sayımın tamamlanması, sayılan odak sayısı, örneğin "30" ile gösterilebilir (Ek Şekil 7A).
    3. Sayım sona erdiğinde (sayılan odak sayısı ile gösterilir, örneğin "30"), noktaları kaldırmak için "Evet"e tıklayın (Ek Şekil 7B). Kaldırılacak noktaya üç kez sol tıklayın. Bitirmek için sağ tıklayın, ardından Evet'e tıklayın.
    4. Bitiş Plakası'na tıklayın ve QC tamamlandıktan sonra Projeye Genel Bakış'a gidin .
  4. Yazılım çözümleyicisini kullanarak görüntüleme gerçekleştirin.
    1. Taranan, sayılan ve QC plakası görüntüsünü kontrol edin (Şekil 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ZIKV, Şekil 3'te şematik olarak belirtildiği gibi FFA kullanılarak ölçülebilir. 24 oyuklu plaka için, enfekte Vero hücreleri enfeksiyondan 48 saat, 60 saat, 72 saat, 84 saat ve 96 saat sonra sabitlendi. Sonuçlar, enfeksiyondan 96 saat (4 gün) sonra hücrelerin bozulmadan kaldığını (hücre ayrılması gözlenmedi) gösterdi (Şekil 4 ve Ek Şekil 8A-E). Virüs odaklarının ortaya çıkışı ilk olarak enfeksiyondan 48 saat (2 gün) sonra gözlenmiştir (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Virüs titresini belirlemek için birkaç test vardır; PFA, tek tek plakların veya odakların ayırt edilmesine izin vermek için virüs aşısının seyreltildiği FFA ile benzer bir virüs kantitasyon protokolüne sahiptir. Boyamadan sonra, her plak veya odak, aşılamada19 tek bir enfeksiyöz partikülü gösterir. PFA, hücre lizizi veya ölümünün neden olduğu plak oluşumunu görselleştirmek için kristal viyole ile boyanır. Bu nedenle, PFA, virüsün CPE'lere neden olması için daha uzun bir süre gerektirdiğinden ve ya...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Malezya Yüksek Öğretim Bakanlığı'ndan Uzun Vadeli Araştırma Hibe Programı (LRGS MRUN Faz 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) kapsamında destek almış ve Yüksek Kurum Mükemmeliyet Merkezi (HICoE) programı (MO002-2019) için fon sağlamıştır. Bu çalışmada odak oluşturma testi için boyamanın iş akışını gösteren Şekil 3, BioRender.com (2022) tarafından "DAB İmmünohistokimya" dan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry'dan alındı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 ve mikro; m Polietersülfon şırınga filtresiSartoriusS6534-FMOSK
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüNest615601
10 mL steril serolojik pipetLabserv14955156
1x Dulbecco' s fosfat tamponlu salin (dPBS)Gibco14190-136
2.0 mL Vidalı kapaklı tüp AxygenSCT-200-SS-C-S
24 kuyulu plakaCorning3526
25 mL Steril serolojik pipetlerLabserv14955157
3,3'Diaminobenzidin (DAB) peroksidaz substratıThermo Scientific34065
37 derece %5 CO2SanyoMCO-18AIC
5 mL steril serolojik pipetLabserv14955155
50 mL santrifüj tüpüFalconLAB352070
75 cm2 doku kültürü şişesi Corning430725U
96 oyuklu plakaFalcon353072
Anti-flavivirüs monoklonal antikoru, 4G2 (klon D1-4G2-4-15)MilliporeSigmaMAB10216
Otoklavlanmış 20x Fosfat tamponlu salin (PBS)N/AN/A22.8 g 8 mM Na2HPO4, 4.0 g 1.5 mM KH2PO4, 160 g 0,14 M NaCl, 4,0 g 2,7 mM KCl, 1 L MilliQ H2O
Biyolojik güvenlik kabini, Sınıf IIHoltenHB2448
CTL S6 Üniversal ELISpot/FluoroSpot AnalizörüImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)CTL-S6UNV12Ticari yazılım analizörü
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Gibco12800-017
Fetal sığır serum (FBS)BovogenSFBS
Yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG ikincil antikoruMilliporeSigma12-349
HemasitometreLaboroptik LTDNeubauer geliştirilmiş
IGEPAL CA-630 deterjanSigma-AldrichI8896Oktilfenoksi poli (etilenoksi) etanolIGEPAL ve nbsp;
Ters mikroskopZEISSTELAVAL 31
Laboratuvar rockerFINEPCRCR300
L-GlutaminGibco25030-081
Düşük viskoziteli karboksimetil selüloz (CMC)Sigma-AldrichC5678
Çok kanallı mikropipet (10 - 100 & mikro; L)Eppendorf3125000036
Çok kanallı mikropipet (30 - 300 & mikro; L)Eppendorf3125000052
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148
Penisilin-streptomisinGibco15140-122
Tek kanallı pipetler (10 - 100 & mikro; L)Eppendorf3123000047
Tek kanallı pipetler (100 - 1000 & mikro; L)Eppendorf3123000063
Tek kanallı pipetler (20 - 200 & mikro; L)Eppendorf3123000055
Yağsız sütSunlac Az YağlıN/ABoyamada engelleme aşaması için 1x PBS'de %3 Yağsız süt hazırlayın
Sodyum HipokloritCloroxN/AŞişelerden/plakalardan atılan bulaşıcı sıvı atıkları dezenfekte etmek için
StereomikroskopNikonSMZ1000
Şırınga tek kullanımlık, Luer Kilidi, 10 mL, 21 G İğneTerumo ile
Vero Afrika yeşil maymun böbrek hücreleri -ECACC 88020401İşbirlikçiden alınmıştır. Bununla birlikte, diğer tedarikçilerden elde edilen Vero hücreleri, bazı optimizasyonlarla kullanılabilmelidir.
içeren C inkübatörü SS10L21G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
  2. Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
  3. Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
  4. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
  5. Cao-Lormeau, V. -M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
  6. Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
  7. Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929(2014).
  8. Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720(2014).
  10. Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
  11. Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome - 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control. , Stockholm. Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015).
  12. Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
  13. Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
  14. Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
  15. Bae, H. -G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
  18. Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
  19. Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
  20. Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183(2022).
  21. Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314(2021).
  22. Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
  23. Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
  24. Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
  25. Kang, W., Shin, E. -C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960(2012).
  26. Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632(2019).
  27. Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
  28. Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880(2018).
  29. Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
  30. Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544(2021).
  31. Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Zika VirusVirus QuantificationFocus Forming AssayVero CellsColorimetric QuantificationPeroxidase ImmunostainingSerial DilutionCell FixationAntibody DetectionHigh Throughput Assay

Related Articles