Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mevcut protokolde, E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde rekombinant bakteriyel kitin deasetilazın (BaCDA) ekspresyonu için işlem koşullarını optimize etmek için istatistiksel bir teknik olan merkezi kompozit tasarım (CCD) uygulandı. CCD'nin istihdamı, BaCDA'nın ekspresyonunda ve aktivitesinde ~ 2.39 kat artışla sonuçlandı.
Son yıllarda, kitin deasetilaz enzimi kullanılarak kitinin kitosana deasetilasyonunun daha yeşil yolu önem kazanmıştır. Taklit edici özelliklere sahip enzimatik olarak dönüştürülmüş kitosan, özellikle biyomedikal alanda geniş bir uygulama alanına sahiptir. Çeşitli çevresel kaynaklardan birkaç rekombinant kitin deasetilaz bildirilmiştir, ancak bu rekombinant kitin deasetilazların üretimi için proses optimizasyonu üzerine herhangi bir çalışma yoktur. Bu çalışmada, E. coli Rosetta pLysS'de rekombinant bakteriyel kitin deasetilaz (BaCDA) üretimini maksimize etmek için yanıt yüzeyi metodolojisinin merkezi kompozit tasarımı kullanılmıştır. Optimize edilmiş proses koşulları %0,061 glikoz konsantrasyonu, %1 laktoz konsantrasyonu, 22 °C'lik bir inkübasyon sıcaklığı, 128 rpm'de çalkalama hızı ve 30 saatlik fermantasyon idi. Optimize edilmiş koşullarda, laktoz indüksiyonuna bağlı ekspresyon, 16 saatlik fermantasyondan sonra başlatıldı. Maksimum ekspresyon, biyokütle ve BaCDA aktivitesi indüksiyondan 14 saat sonra kaydedildi. Optimize edilmiş durumda, eksprese edilen BaCDA'nın BaCDA aktivitesi ~ 2.39 kat artmıştır. Proses optimizasyonu, indüksiyondan sonra toplam fermantasyon döngüsünü 22 saat ve ekspresyon süresini 10 saat azalttı. Bu, merkezi bir kompozit tasarım ve kinetik profillemesi kullanarak rekombinant kitin deasetilaz ekspresyonunun süreç optimizasyonunu bildiren ilk çalışmadır. Bu optimal büyüme koşullarının uyarlanması, daha az keşfedilen moneran deasetilazın uygun maliyetli, büyük ölçekli üretimi ile sonuçlanabilir ve biyomedikal sınıf kitosan üretimi için daha yeşil bir rotaya girebilir.
Yapısal bir β, 1-4 glikozidik bağlı doğal polimer olan kitin, selülozdan sonra doğada en bol bulunan ikinci polisakkarittir. Bu gerçeğe rağmen, kitin çözünmezliği nedeniyle sınırlı endüstriyel uygulamalara sahiptir1. Bu darboğaz, kitin'in pozitif bir yük veren ve elde edilen polimerin, kitosan1'in çözünürlüğünü artıran N-deasetilasyona tabi tutulmasıyla giderilir. Kitin, iki farklı yolla kitosan olarak modifiye edilebilir: kimyasal ve enzimatik. Kitosanın biyomedikal uygulaması, kimyasal yollarda 2,3 kısıtlanan kontrollü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. İfade ortamı ve kültür durumu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
E. coli'de periplazmik rekombinant enzim kitin deasetilazın ekspresyonunun merkezi kompozit tasarım (CCD) kullanılarak proses optimizasyonu
pET22b-Ba CDA yapısı, optimize edilmemiş koşullarda yetiştirildiğinde, sırasıyla 22,26 ± 0,98 g/L ve 84,67 ± 0,56 U/L'lik bir maksimum biyokütle verimi ve BaCDA aktivitesi vermiştir15. Bu çalışmada, E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde periplazmik rekombinant enzim kitin deasetilazın eksprese edilmesi için .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Deasetillenmiş kitin, kitosan, özellikle biyomedikal alanda birçok uygulamaya sahiptir30. Bununla birlikte, kitosanın asetilasyon derecesi (DA) ve asetilasyon paterni (PA) ile ilgili tekrarlanabilirliği, diğer çevresel endişelere ek olarak önemli bir endişe kaynağıdır. Böylece enzimleri kullanan daha yeşil rotadan yararlanıldı. CDA'ların dizisi, biyomedikal uygulamalarınıartıracak benzersiz bir deasetilasyon modeline sahip kitosan oluşturmak için kullanılabilir 4,5
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Yazarlar, MAHE UNSW fonu için Manipal Yüksek Öğrenim Akademisi'ne (MAHE) teşekkür eder ve yazarlar, Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi - İnsan Kaynakları Geliştirme Grubu (CSIR-MHRD), Govt. Hindistan Hükümeti, kıdemli bir araştırma bursu için, 31.3.2019 tarihli 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I numaralı ödül mektubu için.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Kits | |||
| Asetat tahlil kiti | Megazyme, İrlanda | K-ACETAK | Protokol, testi 96 kuyulu plakada gerçekleştirmek için biraz modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir |
| Glikoz tahmin kiti | Agappe diagnosis Ltd., Hindistan | 12018013 | Protokol, testi 96 kuyulu plakada |
| gerçekleştirmek için biraz modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir. Kimyasallar< / güçlü > | |||
| Asetik asit | Hi-media, Hindistan | AS001 | SDS-PAGE boyama ve destaing solüsyonu hazırlamak için kullanılır |
| Akrilamid | Hi-media, Hindistan | MB068 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Amonyum pursülfat | Hi-media, Hindistan | MB003 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Bis-akrilamid | Hi-media, Hindistan | MB005 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Coomassie briliiant blue G-250 | Hi-media, Hindistan | MB092 | SDS-PAGE boyama ve destaing solüsyonu hazırlamak için kullanılır |
| Coomassie briliiant blue R-250 | Hi-media, Hindistan | MB153 | Bardford tahlilini hazırlamak için kullanılır |
| Etilen glikol kitosan | Sigma-aldrich, ABD | E1502 | Etilen glikol kitin hazırlamak için kullanılır ve Etilen glikol kitin, enzimatik reaksiyon için substrat olarak kullanıldı |
| D-glikoz | Hi-medya, Hindistan | MB037 | Bir medya bileşeni olarak kullanılır. |
| İmidazol | Hi-media, Hindistan | GRM1864 | Lizis tamponunda kullanılan |
| Laktoz | Hi-media, Hindistan | GRM017 | Bir medya bileşeni olarak kullanılır. |
| Metanol | Finar, Hindistan | 30930LC250 | SDS-PAGE boyama ve destaing çözeltisi hazırlamak için kullanılır |
| Sodyum klorür (NaCl) | Hi-media, Hindistan | MB023 | Lizis tamponunda kullanılır |
| Fosforik asit | Hi-media, Hindistan | MB157 | Bardford tahlilini hazırlamak için kullanılır |
| sodyum dodesil sülfat (SDS) | Hi-media, Hindistan | GRM6218 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Sodyum fosfat dibazik susuz | Hi-medya, Hindistan | MB024 | Ortam için TB sald ve enzimatik reaksiyon için tampon hazırlamak için kullanılır. |
| Sodyum fosfat monobazik susuz | Hi-medya, Hindistan | GRM3964 | Ortam için TB sald ve enzimatik reaksiyon için tampon hazırlamak için kullanılır. |
| Tetrametiletilendiamin (TEMED) | Hi-media, Hindistan | MB026 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Tris base | Hi-media, Hindistan | MB029 | SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır |
| Tripton | Hi-media, Hindistan | RM7707 | Medya bileşeni olarak kullanılır. |
| Maya özü | Hi-media, Hindistan | RM027 | Medya bileşeni olarak kullanılır. |
| Equipment | |||
| AlphaImager HP jel dokümantasyon birimi | ProteinSimple, ABD | 92-13823-00 | SDS-PAGE fotoğrafları çekmek için kullanılır |
| Tezgah üstü mikser | Eppendorf, Almanya | 9.776 660 | 2 mL adaptör ile enzimatik reaksiyonu sürdürmek için kullanılır |
| Biyoinkübatör çalkalayıcı | Trishul aletleri, Hindistan | 13410622 | Bakteri kültürünü farklı sıcaklıklarda ve RPM'de inkübe etmek için kullanılır |
| Biyospektrofotometre | Eppendorf, Almanya | 6135000009 | Tüm spektroskopik okumaları almak için kullanılır |
| Soğutma santrifüjü | Eppendorf, Almanya | 5805000017 | Kültür, lizat ve diğer tüm santrifüj protokollerini santrifüjlemek için kullanılır |
| Kuru banyo | Labnet International, ABD | S81522039 | SDS-PAGE Mikropipetler için protein örneğini denatüre etmek için kullanılır |
| Eppendorf, Almanya | 3123000900 | Hacim ölçümleri için protokol boyunca kullanılır | |
| Rocker çalkalayıcı | Trishul aletleri, Hindistan | 11770719 | Boyama ve leke çıkarma için SDS-PAGE jeli sallamak için kullanılır |
| SDS-PAGE ünitesi | Bio-Rad, ABD | 1658001FC | SS-PAGE jeli dökmek ve çalıştırmak için kullanılır |
| Ultra sonikatör | Sonics & Materials, Inc., ABD | VCX 130 | Bakteri hücresini ultrasonikasyon ile parçalamak için kullanılır |
| Tartı terazisi | Sartorius, Almanya | BSA124 S | Protokol boyunca ağırlığı ölçmek için kullanılır |
| Devices | |||
| Nanosep Omega Membranlı Santrifüj Cihazlar (3 kDa) | PALL yaşam bilimleri, ABD | OD003C33 | Substrattan sonra enzimi ayırmak için kullanılır treatment |
| Softwares | MINITAB | ||
| 17.0 (Deneme sürümü) | Pennsylvania Eyalet Üniversitesi | Deneysel modeli tasarlamak ve verileri analiz etmek için kullanılır | |
| ImageJ | 1.53o | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) | SS-PAGE kullanarak ifade seviyesini analiz etmek için kullanılır image |
| Plasmid | |||
| pET22b (+) DNA— Novagen | Merck- Millipore, ABD | 69744 | & eksi 20 ° C'de saklanır; C |
| Hücreler< / güçlü > | |||
| E. coli Rosetta pLysS & mdash; Novagen | Merck- Millipore, ABD | 70956 | Luria&ndash'ta Bakımlı; & eksi oranında% 25 gliserol içeren Bertani (LB) suyu; 80 derece > Ç |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında