Method Article

E. coli Rosetta pLysS Hücrelerinde Rekombinant Kitin Deasetilaz Ekspresyonunun İstatistiksel Bir Teknik Kullanılarak Proses Değerlendirmesi ve Kinetiği

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokolde, E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde rekombinant bakteriyel kitin deasetilazın (BaCDA) ekspresyonu için işlem koşullarını optimize etmek için istatistiksel bir teknik olan merkezi kompozit tasarım (CCD) uygulandı. CCD'nin istihdamı, BaCDA'nın ekspresyonunda ve aktivitesinde ~ 2.39 kat artışla sonuçlandı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, kitin deasetilaz enzimi kullanılarak kitinin kitosana deasetilasyonunun daha yeşil yolu önem kazanmıştır. Taklit edici özelliklere sahip enzimatik olarak dönüştürülmüş kitosan, özellikle biyomedikal alanda geniş bir uygulama alanına sahiptir. Çeşitli çevresel kaynaklardan birkaç rekombinant kitin deasetilaz bildirilmiştir, ancak bu rekombinant kitin deasetilazların üretimi için proses optimizasyonu üzerine herhangi bir çalışma yoktur. Bu çalışmada, E. coli Rosetta pLysS'de rekombinant bakteriyel kitin deasetilaz (BaCDA) üretimini maksimize etmek için yanıt yüzeyi metodolojisinin merkezi kompozit tasarımı kullanılmıştır. Optimize edilmiş proses koşulları %0,061 glikoz konsantrasyonu, %1 laktoz konsantrasyonu, 22 °C'lik bir inkübasyon sıcaklığı, 128 rpm'de çalkalama hızı ve 30 saatlik fermantasyon idi. Optimize edilmiş koşullarda, laktoz indüksiyonuna bağlı ekspresyon, 16 saatlik fermantasyondan sonra başlatıldı. Maksimum ekspresyon, biyokütle ve BaCDA aktivitesi indüksiyondan 14 saat sonra kaydedildi. Optimize edilmiş durumda, eksprese edilen BaCDA'nın BaCDA aktivitesi ~ 2.39 kat artmıştır. Proses optimizasyonu, indüksiyondan sonra toplam fermantasyon döngüsünü 22 saat ve ekspresyon süresini 10 saat azalttı. Bu, merkezi bir kompozit tasarım ve kinetik profillemesi kullanarak rekombinant kitin deasetilaz ekspresyonunun süreç optimizasyonunu bildiren ilk çalışmadır. Bu optimal büyüme koşullarının uyarlanması, daha az keşfedilen moneran deasetilazın uygun maliyetli, büyük ölçekli üretimi ile sonuçlanabilir ve biyomedikal sınıf kitosan üretimi için daha yeşil bir rotaya girebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yapısal bir β, 1-4 glikozidik bağlı doğal polimer olan kitin, selülozdan sonra doğada en bol bulunan ikinci polisakkarittir. Bu gerçeğe rağmen, kitin çözünmezliği nedeniyle sınırlı endüstriyel uygulamalara sahiptir1. Bu darboğaz, kitin'in pozitif bir yük veren ve elde edilen polimerin, kitosan1'in çözünürlüğünü artıran N-deasetilasyona tabi tutulmasıyla giderilir. Kitin, iki farklı yolla kitosan olarak modifiye edilebilir: kimyasal ve enzimatik. Kitosanın biyomedikal uygulaması, kimyasal yollarda 2,3 kısıtlanan kontrollü ve tanımlanmış deasetilasyon gerektirir. Bu sınırlama, deasetilasyon işlemi için yeşil bir enzimatik yaklaşım olan kitin deasetilazlar (CDA'lar) kullanılarak ele alınabilir 4,5.

Kitin deasetilaz, karbonhidrat aktif enzimler (CAZY) veritabanında tanımlanan karbonhidrat esteraz 4 (CE-4) ailesine aittir. CE-4 ailesinin enzimleri, korunan bölge olarak NodB homolojisini veya polisakkarit deasetilaz alanını paylaşır. İstatistiksel bir araç olan merkezi kompozit tasarım (CCD), birkaç vahşi tip kitin modifiye edici enzimin optimizasyonu için kullanılır 6,7,8,9. Bununla birlikte, vahşi tip organizmaların kullanımındaki aşağı akış adımları sıkıcı hale gelir, bu nedenle rekombinant enzimlere doğru kayma 10,11,12,13,14,15,16,17. Son yıllarda, deniz kaynaklarından elde edilen halofilik rekombinant CDA, biyomedikal sınıf kitosanın endüstriyel uygulaması ve üretimindeki kolaylığı nedeniyle önem kazanmıştır18,19.

E. coli'de rekombinant enzim üretiminin işlem üzerinde bir sınırlaması vardır ve E. coli'deki ekspresyonu kullanılan gen ve plazmide bağlı olarak değiştiğinden ortam optimizasyonu gereklidir20. Bu nedenle, uygun bir proses ve besin parametrelerinin taranması önemli hale gelir. Yaygın olarak kullanılan optimizasyon yöntemi olan Her Seferinde Bir Faktör (OFAT), adım adım deneyler yapmak için muazzam kaynaklar ve zaman gerektirir. Bu yöntem,20,21,22,23 parametreleri arasındaki etkileşime ilişkin istatistiksel bilgi eksikliğinden muzdariptir. Bu nedenle, E. coli Rosetta pLysS'de halofilik bakteriyel kitin deasetilaz (BaCDA) ekspresyon verimini ve BaCDA aktivitesini incelemek için yanıt yüzeyi metodolojisinin (RSM) CCD'si benimsenmiştir. E. coli konakçısında ekspresyon optimizasyonu için dikkate alınan parametreler laktoz konsantrasyonu, glikoz konsantrasyonu, inkübasyon sıcaklığı, ajitasyon hızı ve inkübasyon süresidir. Çoğu E. coli ekspresyon çalışmasında, indükleyici olarak İzopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) içeren Luria Bertani (LB) ortamı kullanılmıştır. IPTG'nin bu ilavesi, düzenli büyüme izlemesi gerektirdi24. Fermantasyon işlemi sırasındaki bu tekrarlayan aracılıklar da kontaminasyon için yollar açar. Bu nedenle, araştırma grupları, indükleyici olarak laktoz içeren müthiş et suyuna (TB) kaymıştır. Laktozun IPTG yerine medyaya dahil edilmesi bu endişeyi giderir; E. coli bu laktozu tüketir ve yan ürün olarak allo-laktoz üretir, bu da otomatik indüksiyon durumuna neden olur. Bu otomatik indükleyici ortam, rekombinant protein25'in gelişmiş verimlerini sergileyen gliserol içerir.  TB ortamındaki rekombinant proteinlerin bu aşırı ekspresyonu, proses parametrelerinin optimize edilmesiyle daha da iyileştirildi. Bu çalışmada, E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde halofilik BaCDA'nın heterolog ekspresyonunu optimize etmek için merkezi bir kompozit tasarım uygulandı. Seçilen proses parametreleri inkübasyon sıcaklığı, çalkalama hızı ve inkübasyon süresi idi ve değerlendirilen besin parametreleri glikoz ve laktoz konsantrasyonu idi. Halofilik BaCDA ekspresyonu, tahmin edilen optimize edilmiş koşulla değerlendirildi ve SDS-PAGE kullanılarak çapraz doğrulandı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. İfade ortamı ve kültür durumu

  1. BaCDA genini içeren pET-22b vektörünü,15'te tarif edildiği gibi ısı şoku yöntemini kullanarak E. coli Rosetta pLysS yetkin hücrelere dönüştürün.
    NOT: Mikroorganizmalarla çalışırken dikkatli olunmalıdır. Kontaminasyonu önlemek için tüm mikrobiyolojik çalışmalar bir biyogüvenlik kabini davlumbazı içinde yapılmalıdır.
  2. Ön ekspresyon çalışmasını %0,05 (a/h) glikoz ve %0,2 (a/h) laktoz içeren TB ortamında 16 °C ve 180 rpm'de gerçekleştirin. 6.792 x 107 E. coli Rosetta pLysS hücrelerini, durağan faza ulaşana kadar BaCDA klonlanmış plazmit içeren 100 mL ortamda büyütün. Bahsedilen büyüme koşullarında, E. coli Rosetta pLysS hücreleri 10.85 ± 0.21'lik bir optik yoğunluk 600'e (OD600) ulaşır.
    NOT: TB ortamının bileşimi (% a/h): tripton, 1.2; maya özü, 2.4; gliserol, 0.6; ve 1x TB tuzu (17 mM KH2PO4 ve 74 mM K2HPO4)17.

2. Optimizasyon ve deneysel tasarım

  1. Deneyleri tasarlayın ve istatistiksel araç yazılımını kullanarak ikinci dereceden polinom modelini merkezi kompozit tasarıma sığdırın. Bu çalışmada kullanılan istatistik yazılımı MINITAB 17.0 (deneme sürümü) idi.
    1. Bunu yapmak için yazılımı açın ve aşağıdaki düğmelere tıklayın: Stat > DoE > Yanıt yüzeyi > Yanıt yüzeyi oluştur > Yanıt tasarımı > Merkezi kompozit. Çıktı bir iletişim kutusu olarak görünür.
  2. Beş parametreyi, inkübasyon sıcaklığını, çalkalama hızını, inkübasyon süresini, glikoz konsantrasyonunu ve laktoz konsantrasyonunu diyalog kutusundaki beş seviyede (-2, -1, 0, +1, +2) besleyin.
    1. Bunu yapmak için, diyalog kutusundaki seviyelerle birlikte parametreleri girin, tüm parametrelerin ayrıntılarını girin ve Tamam'a basın. Bu, 32 deneysel çalışma gerektiren, merkez noktasında altı kopya ile deneysel tasarım matrisini oluşturur. Yazılım, CCD kullanarak süreç optimizasyonunda kullanılan, kodlanmış ve kodlanmamış terimlerle parametreleri ve seviyelerini içeren bir tablo oluşturur (Tablo 1).
  3. Yazılım tarafından oluşturulan koşullarla 32 deney gerçekleştirin. Deneysel sonuçları, kodlanmış ve kodlanmamış birimler açısından seviyeler ve parametreler içeren deneysel tasarım matrisine (yazılım tarafından oluşturulan) besleyin (Tablo 2).
  4. Yazılımı kullanarak deneysel tasarım matrisini (Tablo 2) analiz edin. Bunu yapmak için yazılımı açın ve yanıtı veri sayfasına besleyin. Yanıt sütunu > Stat > DoE > Yanıt yüzeyi > Yanıt yüzeyi tasarımını analiz et > Tamam'ı seçin. Çıktı, istatistiksel anlamlılık için analiz edilir ve yazılım tarafından bir model tahmin edilir.

Tablo 1: E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde rekombinant kitin deasetilaz ekspresyonunu tahmin etmek için deneysel tasarımda kullanılan kodlanmış ve kodlanmamış terimlerdeki parametreler ve seviyeleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde rekombinant kitin deasetilazın deneysel ve tahmin edilen BaCDA aktivitesi (ekspresyonu) ile deneysel tasarım matrisi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Modelin doğrulanması

  1. Yazılımda bulunan yanıt iyileştirici aracını kullanarak tasarlanan modeli doğrulayın.
  2. Fermantasyonu yazılım tarafından tahmin edilen optimum koşullarda tekrarlayın ve deneysel değeri yazılım tarafından tahmin edilen değerle karşılaştırın.
    1. Bunu yapmak için yazılımı açın ve DoE > Yanıt yüzeyi > Yanıt iyileştirici > Yanıt >iyileştirici Yanıt sütunu > Maksimize > Tamam'ı seçin. Çıktı, yazılım tarafından tahmin edilen optimum proses koşulları ve değerleridir. Fermantasyonu öngörülen optimum koşullarda tekrarlayın ve değerleri karşılaştırın.

4. Analitik yöntemler

  1. Ekspresyon, biyokütle ve protein miktar tayini
    1. Fermantasyonu, deneysel tasarım matrisinde yazılım tarafından verilen 32 koşulda gerçekleştirin (Tablo 2). Her çalıştırmadan sonra kültürü 5.405 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyerek peleti elde edin. Biyokütle verimini belirlemek için hücre peletini tartın.
      NOT: Tüm mikrobiyal işlemler aseptik koşullarda (yani biyogüvenlik kabinlerinin içinde) yapılmalıdır.
    2. Sonikasyon ile periplazmik protein elde etmek için hücre peletini parçalayın. Her gram hücre peletine 5 mL lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM İmidazol) ekleyin ve% 60 genlikte 10 s açık ve 10 s kapalı bir darbe ile 10 döngü boyunca sonikasyon yaparak bozun. Lizatı 5,405 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyerek toplayın. Bradford'un tahlili26 ile protein konsantrasyonunu ölçün.
      NOT: Protein denatürasyonunu önlemek için, sonikasyon soğuk koşullar altında yapılmalıdır. Sonikasyon yaparken örnekleri buz üzerine yerleştirin.
    3. SDS-PAGE ve ardından ImageJ yazılımını kullanarak BaCDA ifadesini analiz edin. % 12 bis-akrilamid jel üzerine 10 μL çözünür hücre lizatı (periplazmik protein) yükleyin ve 2 saat boyunca 100 V akımda 1x tris-glisin-SDS (TGS) tamponu altında çalıştırın. Çalışma tamamlandıktan sonra, jeli Coomassie mavisi ile boyayın ve arka planı27 çıkarmak için lekeyi çıkarın.
    4. Bir jel dokümantasyon ünitesi kullanarak bir görüntü yakalayın. ImageJ yazılımını kullanarak bant yoğunluğunu piksel değerleri biçiminde karşılaştırarak BaCDA ifadesini belirleyin. Referans piksel 28 olarak en düşük BaCDA aktivitesi ve biyokütle ile deneysel çalışmayı düşünün.
      1. Bunu yapmak için yazılımı açın ve görüntü dosyasını açın, ardından dikdörtgen kutuyu kullanarak her bir şeridi seçin. Çözüm'e gidin ve her şeridi %100 olarak ayarlayın, ardından dikdörtgen kutuyu kullanarak her şeritte fazla ifade edilen bandı seçin. Analiz Et'e gidin ve bandın yoğunluğunu belirleyin, işlemi her şeritte tekrarlayın ve sonucu .xls dosya olarak dışa aktarın. Referans yoğunluğu olarak en düşük BaCDA aktivitesine sahip deneysel çalıştırmanın bant yoğunluğunu göz önünde bulundurun ve her şeridin ifadesini analiz edin.
  2. Enzim aktivitesi deneyi
    1. Etilen glikol kitin (1 mg / mL; EGC) substrat olarak29.
    2. 20 μL BaCDA'nın, 800 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de 1 saat boyunca 40 μL 50 mM Tris-HCl (pH 7) tamponu varlığında 40 μL substrat ile reaksiyona girmesine izin verin.
    3. 1 saat sonra, 100 μL'lik reaktanı 3 kDa'lık bir kolondan 2,111 x g'de 15 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. BaCDA'dan oluşan retentatı atın ve reaksiyon sırasında salınan asetat içeren süzüntüyü toplayın. BaCDA aktivitesini belirlemek için asetat testi için süzüntüyü kullanın.
      NOT: Enzimin bir birimi, dakikada mikrolitre enzim başına substrattan 1 μM asetat salan aktivite olarak tanımlanır. Enzim aktivitesi testi üç kopya halinde gerçekleştirildi ve ilgili enzim aktivitesi buna göre hesaplandı.
  3. Laktoz indüksiyonunun fermantasyon kinetiği
    1. Laktoz indüksiyon noktasını ve ekspresyon başlangıç noktasını belirlemek için aktivite profilini araştırın. Aktivite profili, optimize edilmiş fermantasyon koşulları ile biyokütle ve BaCDA aktivitesinin tahmin edilmesiyle yapılır.
    2. Bir glikoz tahmin kiti kullanarak ortamdaki glikoz konsantrasyonunu belirleyin. Fermantasyon süresine karşı biyokütle, glikoz konsantrasyonu ve BaCDA aktivitesini kullanarak aktivite profilini çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

E. coli'de periplazmik rekombinant enzim kitin deasetilazın ekspresyonunun merkezi kompozit tasarım (CCD) kullanılarak proses optimizasyonu
pET22b-Ba CDA yapısı, optimize edilmemiş koşullarda yetiştirildiğinde, sırasıyla 22,26 ± 0,98 g/L ve 84,67 ± 0,56 U/L'lik bir maksimum biyokütle verimi ve BaCDA aktivitesi vermiştir15. Bu çalışmada, E. coli Rosetta pLysS hücrelerinde periplazmik rekombinant enzim kitin deasetilazın eksprese edilmesi için ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deasetillenmiş kitin, kitosan, özellikle biyomedikal alanda birçok uygulamaya sahiptir30. Bununla birlikte, kitosanın asetilasyon derecesi (DA) ve asetilasyon paterni (PA) ile ilgili tekrarlanabilirliği, diğer çevresel endişelere ek olarak önemli bir endişe kaynağıdır. Böylece enzimleri kullanan daha yeşil rotadan yararlanıldı. CDA'ların dizisi, biyomedikal uygulamalarınıartıracak benzersiz bir deasetilasyon modeline sahip kitosan oluşturmak için kullanılabilir 4,5

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, MAHE UNSW fonu için Manipal Yüksek Öğrenim Akademisi'ne (MAHE) teşekkür eder ve yazarlar, Bilimsel ve Endüstriyel Araştırma Konseyi - İnsan Kaynakları Geliştirme Grubu (CSIR-MHRD), Govt. Hindistan Hükümeti, kıdemli bir araştırma bursu için, 31.3.2019 tarihli 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I numaralı ödül mektubu için.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Asetat tahlil kitiMegazyme, İrlandaK-ACETAKProtokol, testi 96 kuyulu plakada gerçekleştirmek için biraz modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir
Glikoz tahmin kitiAgappe diagnosis Ltd., Hindistan12018013Protokol, testi 96 kuyulu plakada
gerçekleştirmek için biraz modifiye edilmiş ve optimize edilmiştir. Kimyasallar< / güçlü >
Asetik asitHi-media, HindistanAS001SDS-PAGE boyama ve destaing solüsyonu hazırlamak için kullanılır
AkrilamidHi-media, HindistanMB068SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
Amonyum pursülfatHi-media, HindistanMB003SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
Bis-akrilamidHi-media, HindistanMB005SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, HindistanMB092SDS-PAGE boyama ve destaing solüsyonu hazırlamak için kullanılır
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, HindistanMB153Bardford tahlilini hazırlamak için kullanılır
Etilen glikol kitosanSigma-aldrich, ABDE1502Etilen glikol kitin hazırlamak için kullanılır ve Etilen glikol kitin, enzimatik reaksiyon için substrat olarak kullanıldı
D-glikozHi-medya, HindistanMB037Bir medya bileşeni olarak kullanılır.
İmidazolHi-media, HindistanGRM1864Lizis tamponunda kullanılan
LaktozHi-media, HindistanGRM017Bir medya bileşeni olarak kullanılır.
MetanolFinar, Hindistan30930LC250SDS-PAGE boyama ve destaing çözeltisi hazırlamak için kullanılır
Sodyum klorür (NaCl)Hi-media, HindistanMB023Lizis tamponunda kullanılır
Fosforik asitHi-media, HindistanMB157Bardford tahlilini hazırlamak için kullanılır
sodyum dodesil sülfat (SDS)Hi-media, HindistanGRM6218SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
Sodyum fosfat dibazik susuzHi-medya, HindistanMB024Ortam için TB sald ve enzimatik reaksiyon için tampon hazırlamak için kullanılır.
Sodyum fosfat monobazik susuzHi-medya, HindistanGRM3964Ortam için TB sald ve enzimatik reaksiyon için tampon hazırlamak için kullanılır.
Tetrametiletilendiamin (TEMED)Hi-media, HindistanMB026SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
Tris baseHi-media, HindistanMB029SDS-PAGE jeli hazırlamak için kullanılır
TriptonHi-media, HindistanRM7707Medya bileşeni olarak kullanılır.
Maya özüHi-media, HindistanRM027Medya bileşeni olarak kullanılır.
Equipment
AlphaImager HP jel dokümantasyon birimiProteinSimple, ABD92-13823-00SDS-PAGE fotoğrafları çekmek için kullanılır
Tezgah üstü mikserEppendorf, Almanya 9.776 6602 mL adaptör ile enzimatik reaksiyonu sürdürmek için kullanılır
Biyoinkübatör çalkalayıcıTrishul aletleri, Hindistan13410622Bakteri kültürünü farklı sıcaklıklarda ve RPM'de inkübe etmek için kullanılır
BiyospektrofotometreEppendorf, Almanya 6135000009Tüm spektroskopik okumaları almak için kullanılır
Soğutma santrifüjüEppendorf, Almanya 5805000017Kültür, lizat ve diğer tüm santrifüj protokollerini santrifüjlemek için kullanılır
Kuru banyoLabnet International, ABDS81522039SDS-PAGE Mikropipetler için protein örneğini denatüre etmek için kullanılır
Eppendorf, Almanya 3123000900Hacim ölçümleri için protokol boyunca kullanılır
Rocker çalkalayıcıTrishul aletleri, Hindistan11770719Boyama ve leke çıkarma için SDS-PAGE jeli sallamak için kullanılır
SDS-PAGE ünitesiBio-Rad, ABD1658001FCSS-PAGE jeli dökmek ve çalıştırmak için kullanılır
Ultra sonikatörSonics & Materials, Inc., ABDVCX 130Bakteri hücresini ultrasonikasyon ile parçalamak için kullanılır
Tartı terazisiSartorius, AlmanyaBSA124 SProtokol boyunca ağırlığı ölçmek için kullanılır
Devices
Nanosep Omega Membranlı Santrifüj Cihazlar (3 kDa)PALL yaşam bilimleri, ABDOD003C33Substrattan sonra enzimi ayırmak için kullanılır treatment
SoftwaresMINITAB
17.0  (Deneme sürümü)  Pennsylvania Eyalet ÜniversitesiDeneysel modeli tasarlamak ve verileri analiz etmek için kullanılır
ImageJ1.53oUlusal Sağlık Enstitüleri (NIH)SS-PAGE kullanarak ifade seviyesini analiz etmek için kullanılır image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, ABD69744& eksi 20 ° C'de saklanır; C
Hücreler< / güçlü >
E. coli Rosetta pLysS & mdash; NovagenMerck- Millipore, ABD70956Luria&ndash'ta Bakımlı; & eksi oranında% 25 gliserol içeren Bertani (LB) suyu; 80 derece > Ç

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yadav, M., et al. Seafood waste: a source for preparation of commercially employable chitin/chitosan materials. Bioresources and Bioprocessing. 6 (1), 1-20 (2019).
  2. Anil, S. Potential medical applications of chitooligosaccharides. Polymers. 14 (17), 3558(2022).
  3. Amiri, H., et al. Chitin and chitosan derived from crustacean waste valorization streams can support food systems and the UN Sustainable Development Goals. Nature Food. 3 (10), 822-828 (2022).
  4. Wattjes, J., et al. Patterns matter part 1: Chitosan polymers with non-random patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104583(2020).
  5. Cord-Landwehr, S., et al. Patterns matter part 2: Chitosan oligomers with defined patterns of acetylation. Reactive and Functional Polymers. 151, 104577(2020).
  6. He, Y., Xu, J., Wang, S., Zhou, G., Liu, J. Optimization of medium components for production of chitin deacetylase by Bacillus amyloliquefaciens Z7, using response surface methodology. Biotechnology and Biotechnological Equipment. 28 (2), 242-247 (2014).
  7. Pareek, N., Vivekanand, V., Saroj, S., Sharma, A. K., Singh, R. P. Purification and characterization of chitin deacetylase from Penicillium oxalicum SAE M-51. Carbohydrate Polymers. 87 (2), 1091-1097 (2012).
  8. Yonis, R. W., Luti, K. J. K., Aziz, G. M. Statistical optimization of chitin bioconversion to produce an effective chitosan in solid state fermentation by Asperigellus flavus. Iraqi Journal of Agricultural Sciences. 50 (3), 916-927 (2019).
  9. Deeba, F., Shakir, H. A., Irfan, M., Khan, M., Qazi, J. I. Utilization of agro-industrial waste for chitinase production by locally isolated bacillus subtilis using response surface methodology. Pakistan Journal of Zoology. 54 (2), 551-560 (2022).
  10. Pandey, A., Tripathi, A. H., Tripathi, P. H. Production, purification, and application of the microbial enzymes. Industrial Applications of Microbial Enzymes. , CRC Press. 19-39 (2022).
  11. Bhat, P., et al. Expression of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli pLysS: Sustainable production, purification and characterisation. International Journal of Biological Macromolecules. 131, 1008-1013 (2019).
  12. Hamer, S. N., et al. Enzymatic production of defined chitosan oligomers with a specific pattern of acetylation using a combination of chitin oligosaccharide deacetylases. Scientific Reports. 5, 8716(2015).
  13. Kadokura, K., et al. Production of a recombinant chitin oligosaccharide deacetylase from Vibrio parahaemolyticus in the culture medium of Escherichia coli cells. Biotechnology Letters. 29 (8), 1209-1215 (2007).
  14. Liu, J., et al. Identification and characterization of a chitin deacetylase from a metagenomic library of deep-sea sediments of the Arctic Ocean. Gene. 590 (1), 79-84 (2016).
  15. Pawaskar, G. M., Raval, K., Rohit, P., Shenoy, R. P., Raval, R. Cloning, expression, purification and characterization of chitin deacetylase extremozyme from halophilic Bacillus aryabhattai B8W22. Biotech. 11 (12), 515(2021).
  16. Raval, R., Simsa, R., Raval, K. Expression studies of Bacillus licheniformis chitin deacetylase in E. coli Rosetta cells. International Journal of Biological Macromolecules. 104, 1692-1696 (2017).
  17. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: Advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).
  18. Yang, G., et al. Enzymatic modification of native chitin and chitin oligosaccharides by an alkaline chitin deacetylase from Microbacterium esteraromaticum MCDA02. International Journal of Biological Macromolecules. 203, 671-678 (2022).
  19. Amer, O. A., et al. Exploring new marine bacterial species, Alcaligenes faecalis Alca F2018 valued for bioconversion of shrimp chitin to chitosan for concomitant biotechnological applications. International Journal of Biological Macromolecules. 196, 35-45 (2022).
  20. Packiam, K. A. R., Ramanan, R. N., Ooi, C. W., Krishnaswamy, L., Tey, B. T. Stepwise optimization of recombinant protein production in Escherichia coli utilizing computational and experimental approaches. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (8), 3253-3266 (2020).
  21. Jayakumar, D., Sachith, S. K., Nathan, V. K., Rishad, K. S. M. Statistical optimization of thermostable alkaline protease from Bacillus cereus KM 05 using response surface methodology. Biotechnology Letters. 43 (10), 2053-2065 (2021).
  22. Balakrishnan, R., Mohan, N., Sivaprakasam, S. Application of design of experiments in bioprocessing: process analysis, optimization, and reliability. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 289-319 (2022).
  23. Papaneophytou, C. P., Kontopidis, G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli: A general review. Protein Expression and Purification. 94, 22-32 (2014).
  24. Tang, S. R., Somasundaram, B., Lua, L. H. L. Protein expression optimization strategies in E. coli: a tailored approach in strain selection and parallelizing expression conditions. Methods in Molecular Biology. 2406, 93-111 (2022).
  25. Nag, N., Khan, H., Tripathi, T. Strategies to improve the expression and solubility of recombinant proteins in E. coli. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , Academic Press. 1-12 (2022).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  27. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Variations of staining sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels with coomassie brilliant blue. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
  28. Etemadzadeh, M. H., Arashkia, A., Roohvand, F., Norouzian, D., Azadmanesh, K. Isolation, cloning, and expression of E. coli BirA gene for biotinylation applications. Advanced Biomedical Research. 4, 149(2015).
  29. Yin, L., Wang, Q., Sun, J., Mao, X. Expression and molecular modification of chitin deacetylase from Streptomyces bacillaris. Molecules. 28 (1), 113(2023).
  30. Hamedi, H., Moradi, S., Hudson, S. M., Tonelli, A. E., King, M. W. Chitosan based bioadhesives for biomedical applications: A review. Carbohydrate Polymers. 282, 119100(2022).
  31. Falak, S., Sajed, M., Rashid, N. Strategies to enhance soluble production of heterologous proteins in Escherichia coli. Biologia. 77 (3), 893-905 (2022).
  32. Shahzadi, I., et al. Scale-up fermentation of Escherichia coli for the production of recombinant endoglucanase from Clostridium thermocellum. Scientific Reports. 11 (1), 7145(2021).
  33. Ganjave, S. D., Dodia, H., Sunder, A. V., Madhu, S., Wangikar, P. P. High cell density cultivation of E. coli in shake flasks for the production of recombinant proteins. Biotechnology Reports. 33, 00694(2022).
  34. Wurm, D. J., et al. The E. coli pET expression system revisited-mechanistic correlation between glucose and lactose uptake. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (20), 8721-8729 (2016).
  35. Gennari, A., et al. Recombinant production in Escherichia coli of a β-galactosidase fused to a cellulose-binding domain using low-cost inducers in fed-batch cultivation. Process Biochemistry. 124, 290-298 (2023).
  36. Mostovenko, E., Deelder, A. M., Palmblad, M. Protein expression dynamics during Escherichia coli glucose-lactose diauxie. BMC Microbiology. 11, 126(2011).
  37. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-32 (2014).
  38. Studier, F. W. Stable cultures and auto-induction for inducible protein production in E. coli. Methods in Molecular Biology. 1091, 17-22 (2014).
  39. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  40. Selvaraj, S., Natarajan, K., Nowak, A., Murty, V. R. Mathematical modeling and simulation of newly isolated bacillus cereus M1GT for tannase production through semi-solid state fermentation with agriculture residue triphala. South African Journal of Chemical Engineering. 35 (1), 89-97 (2021).
  41. Ghahremanifard, P., Rezaeinezhad, N., Rigi, G., Ramezani, F., Ahmadian, G. Designing a novel signal sequence for efficient secretion of Candida antarctica lipase B in E. coli: The molecular dynamic simulation, codon optimization and statistical analysis approach. International Journal of Biological Macromolecules. 119, 291-305 (2018).
  42. Vuillemin, M., Malbert, Y., Laguerre, S., Remaud-Siméon, M., Moulis, C. Optimizing the production of an α-(1→2) branching sucrase in Escherichia coli using statistical design. Applied Microbiology and Biotechnology. 98 (12), 5173-5184 (2014).
  43. Sattari, F., Rigi, G., Ghaedmohammadi, S. The first report on molecular cloning, functional expression, purification, and statistical optimization of Escherichia coli-derived recombinant Ficin from Iranian fig tree (Ficus carica cv.Sabz). International Journal of Biological Macromolecules. 165, 2126-2135 (2020).
  44. Hajihassan, Z., Biroonro, N. Enhanced expression of recombinant activin A in Escherichia coli by optimization of induction parameters. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran. 29 (2), 105-111 (2018).
  45. Rigi, G., Mohammadi, S. G., Arjomand, M. R., Ahmadian, G., Noghabi, K. A. Optimization of extracellular truncated staphylococcal protein A expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Biotechnology and Applied Biochemistry. 61 (2), 217-225 (2014).
  46. Faust, G., Stand, A., Weuster-Botz, D. IPTG can replace lactose in auto-induction media to enhance protein expression in batch-cultured Escherichia coli. Engineering in Life Sciences. 15 (8), 824-829 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Chitin DeacetylaseRecombinant ExpressionE Coli RosettaChitosan ProductionProcess OptimizationCentral Composite DesignResponse Surface MethodologyEnzyme KineticsLactose InductionFermentation Process
Video Coming Soon

Related Articles