Bu yazıda, canlı dokuda in situ ışımayı ölçmek için bir yöntem anlatılmaktadır. Bu çalışma, farklı parlaklık ve ışıma ölçümleri için mikro ölçekli probların yapımının ayrıntılarını içerir, ışımanın karakterizasyonu için doku montajı için rehberlik sağlar ve elde edilen verileri analiz etmek için hesaplama yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Canlı Dokuda Yerinde Işılığı Ölçmek için Bir Doku İçi Radyometri Mikroprobu
Bu makalede
Özet
Özet
Organizmalar büyük ölçüde opak görünür, çünkü dış doku katmanları gelen ışığa güçlü bir şekilde saçılır; Kan gibi kuvvetle emici pigmentler tipik olarak dar absorbanslara sahiptir, öyle ki absorbans zirvelerinin dışındaki ışığın ortalama serbest yolu oldukça uzun olabilir. İnsanlar dokuların içini göremedikleri için, genellikle beyin, yağ ve kemik gibi dokuların çok az ışık içerdiğini veya hiç ışık içermediğini hayal ederler. Bununla birlikte, ışığa duyarlı opsin proteinleri bu dokuların çoğunda eksprese edilir ve işlevleri tam olarak anlaşılamamıştır. Fotosentezi anlamak için dokuya iç ışıma da önemlidir. Örneğin, dev istiridyeler güçlü bir şekilde emer, ancak dokunun derinliklerinde yoğun bir alg popülasyonunu korur. Tortular ve biyofilmler gibi sistemler aracılığıyla ışık yayılımı karmaşık olabilir ve bu topluluklar ekosistem verimliliğine büyük katkıda bulunabilir. Bu nedenle, canlı doku içindeki bu fenomenleri daha iyi anlamak için skaler ışımayı (bir noktayla kesişen foton akısı) ve aşağı inen ışımayı (bir düzlemi dik olarak geçen foton akısı) ölçmek için optik mikro-problar oluşturmak için bir yöntem geliştirilmiştir. Bu teknik saha laboratuvarlarında da uygulanabilir. Bu mikro problar, daha sonra çekilmiş cam pipetlere sabitlenen ısı ile çekilen optik fiberlerden yapılmıştır. Probun açısal kabulünü değiştirmek için, titanyum dioksit ile karıştırılmış 10-100 μm boyutunda bir UV kürlenebilir epoksi küresi daha sonra çekilmiş, kesilmiş bir elyafın sonuna sabitlenir. Prob canlı dokuya yerleştirilir ve konumu bir mikromanipülatör kullanılarak kontrol edilir. Bu problar, in situ doku parlaklığını 10-100 μm'lik uzamsal çözünürlüklerde veya tek hücre ölçeğinde ölçebilir. Bu problar, canlı bir farenin derisinin 4 mm altındaki yağ ve beyin hücrelerine ulaşan ışığı karakterize etmek ve canlı alg bakımından zengin dev istiridye dokusu içinde benzer derinliklere ulaşan ışığı karakterize etmek için kullanıldı.
Giriş
Şaşırtıcı bir şekilde, kara hayvanları ve sığ okyanus sakinleri vücutlarında görsel fizyoloji ve hatta fotosentez için yeterli ışığa sahiptir. Örneğin, bir farenin kafasının ortasındaki ışık seviyeleri (güçlü hemoglobin absorbans bantlarının dışında), dış dünyaya göre üç veya dört büyüklük sırası ile zayıflatılır. Bu, kabaca iç ve dış mekanlardaki ışık seviyeleri arasındaki farktır. Bu nedenle, güçlü saçılma nedeniyle bir dokunun veya malzemenin opaklığı, güçlü ışık emilimi nedeniyle opaklık ile aynı değildir. Işık, yüksek konsantrasyonlarda hücre ve parçacıklara sahip sucul sistemlerde yayılan ışığa benzer şekilde, güçlü bir ileri saçılma sisteminde uzun mesafelerde yayılmaya devam edebilir1. Bu gözlem, opsin proteinlerinin tüm hayvanların tüm dokularında neredeyse her yerde ifade edildiği gerçeği ışığında özellikle dikkat çekicidir. Bu nedenle, ışığın canlı doku içinde nasıl ve nerede zayıfladığını ve dağıldığını anlamak önemlidir. Bununla birlikte, su sistemlerinden farklı olarak, canlı doku ile, bir aleti su kolonuna batırmak ve parlaklık ve parlaklık ölçümleri elde etmek imkansızdır ve yeni bir teknik gereklidir.
Canlı dokunun emilim ve saçılma özelliklerini karakterize etmek için daha önce kullanılan diğer yöntemler arasında doku yansıtma problarının ölçülmesi ve / veya kürelerin entegre edilmesi2,3, tarama konfokal mikroskobu4 gibi mikroskobik yöntemler, yüzeydeki lazer ışığının difüzyonunu ölçme5 ve Monte Carlo ışınım transferi6 gibi modelleme teknikleri bulunmaktadır. Bahsedilen deneysel yöntemler genellikle spesifik, büyük ve pahalı ekipman veya doku yapısı hakkında ayrıntılı bilgi gerektirir ve genellikle dokunun derinliklerindeki ışığın mekansal yapısını karakterize etme yetenekleriyle sınırlıdır.
7,8,9 dokusundan optik fiber yerleştirmek için hipodermik iğne kullanan benzer prob bazlı yöntemler de vardır. Deneyimlerimize göre, modifiye iğneler dokuyu delmede etkilidir, ancak önemli ölçüde kuvvet gerektirir ve genellikle yoğun bir şekilde paketlenmiş hücrelerden geçerken hassas dokuları yırtar. Bu nedenle, bu iğneler genellikle bir doku tabakasına bir milimetreden daha fazlasını yerleştirmek için cerrahi bir prosedür gerektirir. Burada tarif edilen yöntem, yağlanmış, çekilmiş bir cam destek kullanarak, dokunun minimum yaralanmasıyla ve ek cerrahi olmadan hücreler arasında kayabilir.
Bu el yazması, Jorgenson ve meslektaşlarının alg paspasları10,11 içindeki ışığı ölçme konusundaki çalışmalarından esinlenerek, cam destekli optik mikroproblar ve yoğun dokunun derinliklerine inmeye ve sahada inşaat ve kullanıma uygun taşınabilir elektronikler kullanarak bir yöntem sunmaktadır. Bu problar, yüksek uzamsal çözünürlüklerde canlı doku içindeki skaler ışımayı (her yönden bir noktaya çarpan ışık) ve aşağı inen parlaklığı (yatay bir düzlemle kesişen ışık) karakterize etmek için inşa edilebilir. Bu problar başlangıçta fotosimbiyotik dev istiridye dokusu içindeki ışınım transferini ölçmek için geliştirilmiştir12. Toplam dokunun emilimi ve iletiminin standart ölçümleri, dokunun fotosentetik performansını karakterize etmek için yeterli değildi, çünkü tüm gelen ışığın, dokunun yüzeyinde yüksek yoğunluk yaşayan birkaç hücre tarafından mı yoksa doku hacmi boyunca düşük yoğunluklar yaşayan birçok hücre tarafından mı emildiği büyük bir fark yaratıyor. İkinci bir projede, bu problar bir farenin beynindeki in vivo ışımayı ölçmek için kullanıldı13,14, böylece beynin derinliklerinde ifade edilen opsinlerin ışık ortamını karakterize etti. Bu mikro problar, fare beyin dokusundaki parlaklığı tüm kürk, cilt ve kemik bozulmadan ölçecek kadar küçük ve hassastır ve fizyolojik ışık seviyelerinin derin beyin opsinlerini uyaracak kadar yüksek olduğunu göstermektedir.
Bu mikro-optik prob ve ölçüm kurulumu, biyolojik dokunun içindeki ışığı ölçmek ve karakterize etmek isteyen araştırmacılar için, özellikle fotosentezin veya gözlerin dışında ifade edilen görsel pigmentlerin işlevlerinin daha nüanslı bir şekilde anlaşılması için yararlı olabilir. Bu yöntem, canlı doku içindeki optik özellikleri ve ışık yayılımını düşük maliyetle, şirket içinde inşa edilmiş küçük taşınabilir ekipmanlarla ve göreve bağlı ayarlanabilir parametrelerle tam olarak karakterize etmek için tek başına veya diğer tekniklerle birlikte kullanılabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışma, Yale Üniversitesi'nin omurgalı ve omurgasız hayvan araştırmaları ile ilgili tüm ilgili etik düzenlemelerine uygundur.
1. Optik mikro probun oluşturulması
- Cam manşonun oluşturulması, malzeme: Pasteur pipet, 5,75 inç ( bkz.
- Takılabilir bir timsah klipsi (Malzeme Tablosu) kullanarak, cam pipeti, konik ucu yere bakacak ve pipetin yönü zemine dik olacak şekilde geniş uca monte edin.
- Pipetin konik ucundan 50 g'lık plastik bir mengene sapı (Malzeme Tablosu) asın. Kaymayı önlemeye yardımcı olmak için pipet ile mengene tutacağı arasına bir elektrik bandı pedi yerleştirin.
- Pipetin konik ucunu küçük bir bütan meşalesi kullanarak ısıtın (Malzeme Tablosu). Alevi mengene tutamağının 1 cm yukarısına uygulayın. Meşaleyi, alevin en parlak kısmı camdan 3 cm uzakta olacak ve cam alevin ucunda olacak şekilde tutun. Pipetin uzunluğu yaklaşık 5 inç arttığında alevi hemen çıkarın.
- Yeni çekilen çapın bir sonraki bölümde kullanılan optik fiberin kabaca iki katı olduğu noktada pipetin çekilmiş ucunu kesmek için küçük makas veya cam kesici kullanın (bkz. adım 1.2). Carborundum kağıdı kullanarak kesilmiş ucun keskin alanlarını dosyalayın (Malzeme Tablosu). Elde edilen küçük cam kırıklarını veya tozu bir şişe izopropil alkol ve ardından basınçlı hava kullanarak durulayın.
- Optik fiberin çekilmesi (Şekil 1D)
- Optik fiberi kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın ve 200 μm çapında SMA ile sonlandırılmış optik fiberin bir SMA konektörünü çıkarın (Malzeme Tablosu). SMA sonlandırmalarından birine yakın kesin. Ardından, sonraki 5 cm'lik plastik ve fiberglas kılıfı çıkarmak için tıraş bıçağını kullanın, böylece çıplak optik fiber açığa çıkar ve bozulmamış düzeneğin geri kalanından çıkıntı yapar.
- Poliimid polimer kaplamayı cam elyafından yakmak için bütan torcunu kullanın. İzopropanol ile durulayın. Tüy bırakmayan bir mendil kullanarak çıplak cam elyafını silin.
- Bir sonraki adım, çıplak elyafı monte etmektir, böylece bir alevle de çekilebilir. Optik fiberin çıplak ucunu doğrudan bir masa veya raf kenarındaki bir pense kelepçesine (Malzeme Tablosu) monte edin ve fiberin SMA ile sonlandırılmış ucunun zemine doğru sarkmasına izin verin. Fiberin ceketli ucuna, çıplak optik fiberin pense kelepçesinde tutulduğu yerden yaklaşık 12 inç aşağı doğru iki küçük kelepçe (toplam ağırlık: 10 g) şeklinde çekmek için ağırlıkları ekleyin.
- Elyafı çekmek için, bütan meşale alevi ile başlayın. Alev açıkken, bütan meşalesini çıplak fiberden 1 cm uzakta tutun, böylece alev optik fibere dik ve pense kelepçesinin çıplak fiberi tuttuğu yerden dikey olarak 3 cm aşağı doğru olur. Elyafın gerilmesine, çekilmesine, ayrılmasına ve yere düşmesine izin verin.
- Elde edilen çekilen optik fiber ucunu inceleyin. Düzensizlikleri karborundum kağıtla nazikçe zımparalayın, izopropil alkol ve tüy bırakmayan bir mendille temizleyin ve basınçlı hava ile kurulayın.
NOT: Bu noktada, çekilen lifin boyutunu ve şeklini karakterize etmek ve belgelemek için bir mikroskop kullanılabilir. - Elyafın kenarlarını koyulaştırmak ve başıboş ışığın girmesini önlemek için film opaklayıcı bir kalem kullanın (Malzeme Tablosu). Elyafı kalemin ucundan yavaşça çekin ve ucunda sadece küçük bir alanı açıkta bırakın.
- Çekilen fiberin cam pipet manşonunun içine monte edilmesi (Şekil 1A)
- Bir stereomikroskop altında çalışırken, adım 1.2'deki konik optik fiberi, adım 1.1'den itibaren değiştirilmiş cam pipetin geniş ucuna dikkatlice yerleştirin ve fiberi, pipetin konik ucundan ~1 mm çıplak fiber yapışana kadar itin.
- Elektrik bandını kullanarak optik fiberin ceketli ucunu pipetin geniş ucuna sabitleyin.
- Küçük çaplı bir iğne üzerine bir damla siyanoakrilat yapıştırıcı koyun (Malzeme Tablosu). Yapıştırıcı damlasını, çekilen pipetin kesilmiş kenarına dikkatlice dokundurarak, çekilen elyafın çıplak ucundan kaçının.
- Kılcal hareketin yapıştırıcıyı pipete fitillemesine izin verin ve pipetin duvarı ile optik fiber arasındaki alanı ıslatın. Prob tertibatını hareket ettirmeden önce yapıştırıcının en az 15 dakika kürlenmesine izin verin.
- Fiber ucun bir saçılma küresi ile değiştirilmesi (Şekil 1C)
- Bir damla UV ile kürlenebilir yapıştırıcıyı ~ 1: 1 v / v'de titanyum dioksit tozu (Malzeme Tablosu) ile karıştırarak saçılma bilyası ucu için hammadde oluşturun.
- Probu, prob yatay yönde olacak şekilde bir montaj çubuğu tutucusu (Malzeme Tablosu) ile bir mikromanipülatöre takın. Bir telin veya iğnenin ucunu, yukarıda hazırlanan yapıştırıcı / TiO2 karışımına batırarak, bir yapışkan damlacık oluşturacak şekilde saçılma malzemesinin çalışma rezervuarını hazırlayın. Teli veya iğneyi yatay probun ucuna yakın damlacıkla monte edin. Bunu, tezgaha monte edilmiş bir timsah klipsi kullanarak yapmak uygundur.
- Probun ucuna bir saçılma küresi koyun. Probun optik fiberinin ucunu yapıştırıcı/TiO2 damlacığına yavaşça ve dikkatlice itmek için mikromanipülatörü kullanın. Ardından, ucu yapıştırıcıdan hızla çekin. Optik fiberin ucunda istenen boyutta küresel bir yapışkan damlacığı birikinceye kadar iki ila üç kez tekrarlayın.
NOT: Saçılma küresi, konik optik fiberin çapından iki ila sekiz kat daha büyük çaplarda kararlı olacaktır. Son optimum boyut, istenen son uygulamaya bağlıdır. - Optik fiberin SMA ile sonlandırılmış ucunu fiber bağlantılı bir UV ışık kaynağına bağlayarak küreyi iyileştirin (Malzeme Tablosu).
NOT: Bu çalışmada kullanılan ışık kaynağı 5.3 mW gücündeydi. Bu güçte, önerilen kürlenme süresi en az 12 saat veya bir gecedir. Kürlemeden sonra, son optik prob ucunun boyutunu karakterize etmek ve ölçmek için iyi bir zamandır.
2. Dokunun optik ölçümler için hazırlanması ve montajı (Şekil 2 ve Şekil 3)
- Bir deney için örnekleri monte etmek üzere bulaşıkları hazırlayın. 35 mm x 10 mm plastik Petri kabının dibinde 0,5 cm çapında bir delik açmak üzere zımba yapmak için bütan meşale kullanarak bir Pasteur pipetinin büyük ucunu ısıtın. Çanağın alt tarafındaki deliği elektrik bandı veya laboratuvar bandı ile kapatın. Verimlilik için bir seferde birkaç tane yapın.
- Sıvı jelatini (Malzeme Tablosu) paket üzerindeki talimatlara göre hazırlayın.
NOT: Marketten gelen ticari gıda sınıfı tatsız jelatin, bu amaç için kimyasal tedarikçilerden kimyasal sınıf jelatinden daha iyidir, çünkü kimyasal sınıf jelatin, gıda ürününden optik olarak daha az berrak ve mekanik olarak daha az güvenilirdir. - Kullanılacak dokunun diseksiyonunu ve hazırlanmasını gerçekleştirin.
NOT: Deneyimlere göre, 1 cm kalınlığa kadar olan herhangi bir düz doku, bu deneyde, ilgili sisteme uygun herhangi bir diseksiyon tekniği kullanılarak başarıyla ölçülebilir. Dev istiridye dokusu için, deney12'de kullanılmak üzere düz, düzenli bir istiridye dokusu çemberi oluşturmak için 8 mm'lik bir biyopsi zımba kullanıldı. Bu sistem için, numunenin deneyin sonunda hala canlı durumda olduğundan emin olmak için bir ölçümü tamamlamak için gereken süre göz önüne alındığında, bir seferde yalnızca bir numune etkili bir şekilde hazırlanabilir. - Adım 2.1'den itibaren iki Petri kabını yolun dörtte birini sıvı jelatin ile doldurun ve jelasyondan kısa bir süre sonra oda sıcaklığına (RT) soğumaya bırakın. Bir tabakta, biyopsiyi, yemeğin altındaki delikte oluşan viskoz jelatin yastığına yerleştirin. Petri kabı dolana kadar biyopsi etrafına nazikçe RT jelatin eklemek için bir Pasteur pipeti kullanın (Şekil 3). Boş bir numune yapmak için ikinci kabı jelatinle doldurun.
- Örnek yemekleri, jelatin tamamen kürlenene ve dokunuşa hafifçe elastik olana kadar yaklaşık 10-30 dakika buzdolabına koyun.
NOT: Serin bir odada, bu gerekli olmayabilir; Tropiklerde çalışırken, jelatini tamamen iyileştirmek için bu adım gereklidir. - Petri kabı için mikromanipülatörde bir montaj yapmak (Şekil 2)
- 6 cm x 6 cm'lik bir kareyi 1/4 kalınlığında pleksiglas olarak kesin (Malzeme Tablosu).
- Plastik karede Petri kabı ile aynı çapa (~ 35 mm) sahip bir delik açın veya eritin. Petri kabının bu deliğe sıkıca oturduğundan ve sürtünme ile yerinde tutulduğundan emin olun. Boyutu ve sürtünme temasını hafifçe artırmak için çanağın kenarlarına bant ekleyin.
- Plastik karenin köşesinde 1/4 çapında bir delik açın veya eritin. Vida ve cıvatada 1/4 kullanarak kareyi mikromanipülatöre bağlamak için bu deliği kullanın.
- Proba ulaşan başıboş ışığı azaltmak için plastik kareyi siyah elektrik bandı ile örtün. Benzer şekilde, başıboş ışığı azaltmak için yerleştirilen çanağın tabanının (>10 mm) altına uzanan karenin kenarları etrafında bir etek oluşturmak için bant kullanın (Şekil 2B).
- Petri çanak tutucusunu, numunelerin kalınlığından daha büyük bir ölçüde üç boyutlu ayarlamalara ve iyi çözümlenmiş dikey harekete izin veren bir mikromanipülatöre bağlamak için bir cıvata ve uygun donanım kullanın ( Malzeme Tablosunda belirtilen manipülatörün bölüm 1 ve bölüm 2'si iyi örneklerdir). Bu mikromanipülatörü optik bir breadboard'a yapıştırın.
3. Doku biyopsileri için ölçüm kurulumu
- Ölçümün yapıldığı alanın üzerine, numunenin yerleştirileceği düzleme ulaştığında ışığın kolimasyonu olacak şekilde bir ışık kaynağı monte edin (Şekil 2A). Örneğin, 5 mm'lik bir sıvı ışık kılavuzuna (Malzeme Tablosu) 5 cm'lik bir kolimasyon lensi (Malzeme Tablosu) takın ve optik breadboard'a (Malzeme Tablosu) bağlı bir mengene ve çerçeve kullanarak numunenin üzerine >0,6 m yükseltin. Ardından, ışık kılavuzunu Malzeme Tablosu'nda listelenen plazma ışık kaynağı gibi geniş bant bir ışık kaynağına bağlayın.
- Probu, ışık kaynağına işaret edecek şekilde dikey olarak yönlendirilmiş bir montaja takın. Probu kelepçelerle, hortum kelepçeleriyle veya bantla optik bir masa direğine sabitleyin.
NOT: Dev istiridye deneyinde, Malzeme Tablosunda listelenen mikromanipülatör gibi özel olarak tasarlanmış bir çubuk tutucu kullanılmıştır. Bu çalışmada, mıknatıslarla optik bir breadboard'a (Malzeme Tablosu) sabitlenmiştir. Hem probun hem de numunenin manipülatörler üzerinde bulundurulmasıyla elde edilen hizalama için ek serbestlik dereceleri uygundur, ancak gerekli değildir. Direğe aşırı kenetlenmemeye dikkat edin, çünkü bu pipet muhafazasını kırabilir. - Numune manipülatörünü, dikey olarak monte edilmiş probun yakınına yerleştirin. Numune aşamasının konumunu, prob Petri kabının altındaki 0,5 cm'lik açıklıkta ortalanacak şekilde ayarlamak için numune manipülatörünü kullanın. Monte edilmiş probun ucuna dokunmamak veya çarpmamak için çok dikkatli olun.
NOT: Numune alanının üzerine yerleştirilmiş boma monte edilmiş bir stereomikroskop yararlı olabilir. Bu şekilde, prob ucunun, aşamasının ve numunenin yukarıdan aşağıya hizalaması, bir deneye başlamadan önce görüntülenebilir (Şekil 2A). - Probun optik fiberinin SMA ile sonlandırılmış ucunu bir USB fiber optik spektrometreye (Malzeme Tablosu) bağlayın ve spektrometreyi bir USB kablosu kullanarak bilgisayara bağlayın.
4. Veri toplama
- Deneysel kurulum
- Probu ve manipülatörleri, adım 3.4'te olduğu gibi, verilerin toplanacağı tam olarak hizalanmış konumda bulundurun.
- Probun kenarları ile doku numunesi arasındaki sürtünmeyi azaltmak için probun dokuya yerleştirilecek kısmına az miktarda silikon yağlayıcı (Malzeme Tablosu) dikkatlice uygulamak için pamuklu çubuk veya ince ölçülü iğne kullanın. Her taban çizgisi veya doku ölçümünden önce silikon yağlayıcıyı tekrar uygulayın.
- Boş numune Petri kabındaki deliği kaplayan bandı çıkarın ve sürtünme ile güvenli bir şekilde yerinde tutulduğundan emin olarak numune tutucuya yerleştirin (adım 2.7).
- Numuneyi probun üzerine indirmek için mikromanipülatörü kullanın. Probun jelatine petri kabının alt tarafındaki delikten girmesine izin verin. Prob, jelatin tabakasının tabanından yaklaşık 5 mm olana kadar devam edin.
- Işık kaynağını açın. Spektrometre yazılımını kullanarak, sinyal mümkün olduğunca yüksek ancak doygun olmayana kadar spektrometre entegrasyon süresini ayarlayın. Ortalama tarama sayısını iki ile beş arasında ve düzgünleştirici piksel değerini altı olarak ayarlayın. Bu aşamada kullanılabilir entegrasyon süreleri, bu taban çizgisi için 1-50 ms arasında değişebilir.
- Referans spektrumlarının toplanması
- Karanlık bir ölçüm toplayın.
- Spektrometre parametreleri boş numune ile ayarlandıktan sonra, prob fiberini spektrometreden ayırın ve portu spektrometre ile birlikte gelen opak metal kapakla örtün.
- Spektrometrenin gürültüsünü giriş ışığı olmadan karakterize etmek için spektrometreden karanlık bir ölçüm elde edin (genellikle GUI'deki karanlık ampul simgesini kullanarak). Bu ölçümü veri toplama stratejisine göre kaydedin.
- Bir lamba ölçümü toplayın. Prob fiberini spektrometreye yeniden bağlayın, sinyalin stabilize olmasını bekleyin ve başka bir spektrum elde edin. Bu ölçüm, doku yokluğunda jelatin yoluyla proba ulaşan ışığı karakterize eder.
- Karanlık bir ölçüm toplayın.
- Doku spektrumlarının toplanması
- Numune Petri kabının altındaki bandı çıkarın ve numune tutucuya yerleştirin.
- Üç boyutlu manipülasyon kullanarak numune kabını probla hizalayın, böylece doku biyopsisi probun ucunun üzerinde ortalanır.
- Proba silikon jel uygulayın (bkz. 4.1.2) ve prob ucu doku örneğini destekleyen jelatinden geçene ve doku örneğine yeni girene kadar numuneyi yavaşça probun üzerine indirin.
NOT: Bazı spektrometreler ve bilgisayar programları, algılanan ışığın gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Probun dokuya ne zaman girdiğini belirlemek için bunu kullanın. Spektrum yoğunluğu, prob ucu doku ile doğrudan temas eder etmez aniden azalacaktır. - Ölçülen spektrumun çok gürültülü veya doygun olmadığından emin olarak entegrasyon süresinin ölçüm için uygun olduğunu doğrulayın. Gerekirse entegrasyon süresini değiştirin.
- Entegrasyon süresi her ayarlandığında, yeni bir karanlık ölçüm gerçekleştirin ve saklayın (adım 4.2.1). Ortalama tarama sayısını veya düzgünleştirilmiş piksel sayısını değiştirmeyin.
- Uygun ölçüm parametrelerini bulduktan sonra, ölçümleri yapın ve spektrumu kaydedin.
- Mikromanipülatörü kullanarak numuneyi belirli bir mesafeden aşağı taşıyın. Bu çalışma için kullanılan manipülatör için, her küçük onay işareti 0.001 inç veya 25.4 μm idi. Numune, her ölçüm için beş onay işareti veya 127 μm boyunca aşağı taşındı. 4.3.4 adımını yineleyin.
- Spektrumları doku içindeki her dikey pozisyonda kaydetmeye devam edin.
NOT: Burada açıklanan sistem için, tek bir doku numunesi içindeki ölçümler için gerekli entegrasyon süreleri 1 ms ila 5 s arasında değişmiştir. Sonunda, prob ucu dokunun tepesinden çıkacak ve orada görünür olacaktır (Şekil 4A). Bu son ölçümdür ve dokunun üstündeki ışık olayını karakterize eder.
- Verilerin yüklenmesi ve işlenmesi
- Toplanan tüm spektrumları (karanlık spektrumlar, lamba spektrumları ve doku ölçümleri) sınırlandırılmış metin dosyalarına dönüştürmek için spektrometrenin yazılımını kullanın.
- Matlab veya tercih ettiğiniz bir kodlama dilini kullanarak bir numune için tüm ölçüm dosyalarını yükleyin. Her doku ölçüm spektrumu için, karanlık spektrumu eşleşen entegrasyon süresiyle çıkarın ve ardından entegrasyon süresine bölün.
NOT: Bu çalışmada, verilerin yüklenmesi ve işlenmesi için Matlab betiği kullanılmıştır (Ek Dosya 1). - Doku içindeki prob ile elde edilen spektrumu, boş jelatinde elde edilen taban çizgisi spektrumuna bölerek dokudaki her pozisyona ulaşan gelen ışık yüzdesini hesaplayın.
NOT: Dokunun üstündeki ölçüm (adım 4.3.6), jelatindeki temel ölçüme (adım 4.1) çok benzer olmalı ve bölündüğünde% 100'e yakın olmalıdır. Deneysel bağlama bağlı olarak, lamba spektrumu (boş jelatinden veya dokunun en üstünden gelen spektrum) referans olarak kullanılabilir. Bununla birlikte, deneye başlamadan önce bir lamba spektrumu toplamak hala önemlidir. Bunun nedeni, prob kırılırsa veya deney dokunun tepesine ulaşmadan önce başarısız olursa, arızadan önce elde edilen veriler hala kullanılabilir durumdadır, bu da karşılık gelen ilk lamba referans spektrumu yoksa durum böyle değildir. - Verileri görselleştirin; kontur grafikleri yardımcı olabilir (Şekil 4B).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, aşağı doğru inen ışımayı (bir yönden bir noktaya ulaşan ışık) ölçmek veya ışık saçan küresel bir ucun eklenmesiyle skaler ışımayı (her yönden bir noktaya ulaşan ışık) ölçmek için kullanılabilecek bir mikro-optik prob oluşturma prosedürünü açıklar. Bu problar, canlı doku içindeki tek hücrelerin uzunluk ölçeklerine yaklaşan uzamsal çözünürlüklerde ışımayı ölçebilir. Bu protokol ayrıca, açıklanan probu kullanarak ışıma ölçümleri için bir doku örneği hazırlamak için temsili bir yöntem ve veri görüntüleme ve anal...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, optik ortamı, yaklaşık olarak tek hücreler ölçeğinde uzamsal bir çözünürlüğe sahip büyük hacimli bir canlı doku aracılığıyla sistematik olarak karakterize etmek için bir tekniği tanımlar. Bu ucuz, esnek ve sahada izlenebilir yöntem, ışığın canlı sistemler içinde yayılmasını inceleyen herhangi bir araştırmacı için yararlı olabilir. Deneyimlere göre, mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında7, bu problar inşa etmek için biraz daha fazla pratik ve beceri gerektirir, ancak daha az doku hasa...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Yazarlar, bizi Dr. Jorgensen'in meslektaşlarına ve çalışmalarına tanıttığı için Sanaz Vahidinia'ya teşekkür ediyor. Bu araştırma, Ordu Araştırma Ofisi (no. W911NF-10-0139), Deniz Araştırmaları Ofisi (MURI ödül no. N00014-09-1-1053 aracılığıyla) ve NSF-INSPIRE ödülü NSF-1343158 tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 "seyahat bilyalı rulman merkezi + D11 + A2: D31 + A2: A2: D31 | Edmond Optics | 37-935 | Numuneyi indirmek için manipülatörün 2. bölümü |
| 1/4" kalınlığında akrilik levha | McMaster-Carr | 8505K754 | Petri kabı tutucu yapmak için |
| 3/4" mini yaylı kelepçe | Örs | 99693 | çekmek için ağırlık olarak kullanın |
| Fisher Scientific | NC9324386 | Doku örneği için | |
| Bütan Meşalesi | McMaster-Carr | MT-51 | Elyaf ve pipet çekmek için ısı kaynağı |
| Kolimasyon lensi | Thorlabs | LLG5A1-A | Işık kaynağını sıvı ışık kılavuzu aracılığıyla toplamak için |
| Basınçlı hava | McMaster-Carr | 7437K35 | Çekilmiş elyaf ve pipeti kurutmak için |
| Siyanoakrilat tutkal - sıvı | McMaster-Carr | 66635A31 | Çekilen pipetin üstündeki konik fiber ucunu sabitlemek için |
| Elektrik bandı | McMaster-Carr | 76455A21 | Fiberi pipete sabitlemek ve kelepçelere kavrama eklemek için |
| İnce dereceli carborundum kağıdı | McMaster-Carr | 4649A24 | Exacto bıçak tutucusundaki küçük üçgen iyi çalışıyor |
| Jelatin | Knox | 10043000048679 | Petri kabındaki |
| doku biyopsisini sabitlemek içinCam Pastör Pipeti | Fisher Scientific | 13-678-20B | Tek kullanımlık cam pipet 5.75" uzunluğunda |
| İnsülin şırıngaları, 31G iğne | BD | 320440 | Tutkal uygulamak için |
| İzopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | Çekilmiş elyaf ve pipeti temizlemek için |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | Optik fiber ve cam pipeti silmek için temiz |
| LED sürücü | Thorlabs | LEDD1B | UV LED'lere güç sağlamak |
| için Ölçümler için ışık kaynağı | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Ölçümler için düşük ısılı beyaz ışık kaynağı |
| Doğrusal metrik XYZ ekseni kremayer ve pinyon kademesi | Edmond Optics | 55-023 | Numuneyi indirmek için manipülatörün 1. bölümü |
| Sıvı ışık kılavuzu | Thorlabs | LLG5-4T | Ölçümlerde ışık kaynağı için |
| Manyetik ayaklar | Siskiyou | MGB 8-32 | Manyetik şeritlerle kullanım için |
| Manyetik şeritler | Siskiyou | MS-6.0 | Devre tahtasına manyetik olarak monte etmek için |
| Manipülatör #1 | Siskiyou | MX10R | Pipet tutuculu 4 eksenli manipülatör |
| Opak kalem, küçük | WindowTint | TOP01 | Dağınık ışığın proba girmesini önlemek için optik fiberin opak tarafı için |
| Optik devre tahtası | Edmond Optics | 03-640 | Prob tutucunun, numunenin, mikroskobun ve ışık kaynağının sabit bir şekilde sabitlenmesi için |
| Optik fiberler | Okyanus Optiği | P-100-2-UV-VIS | Yaklaşık 4 lifin olması iyidir |
| Plazma ışık kaynağı | Thorlabs | HPLS345 | Doku radyometrisi ölçümleri için |
| Plastik pense kelepçesi | McMaster-Carr | 5070A11 | Pipet çekmede ağırlık için kullanılan pense kelepçesi |
| Polistiren Petri kapları | Thomas scientific | 3488N10 | Numune tutucular, numune kalınlığını ve üstte ~10 mm jelatini tutmak için yeterli hacim |
| Tıraş bıçakları | McMaster-Carr | 3962A3 | Optik fiberden kılıfı sıyırmak için |
| Silikon yağı yağlayıcı | Thomas scientific | 1232E30 | Prob ve doku arasındaki sürtünmeyi azaltmak için |
| Verileri analiz etmek için yazılım | Matlab | Veri analizi için seçilen yazılım | |
| Spektrometre + spektrometre yazılımı | Avantes | AvaSpec-2048L | Spektrometre herhangi bir marka olabilir, bu sma sonlu optik fiberlerle uyumludur ve spektrometreyi çalıştırmak için kendi yazılımıyla birlikte gelir |
| Titanyum dioksit tozu | Sigma Aldrich | 718467-100G | Saçılma küresi |
| yapmak içinAletmasa üstü klipsimiz | Toolour0004 | Çekerken pipeti tutmak ve bitmiş probları tutmak için | |
| Tetik etkili çubuk kelepçeleri | mcMaster-Carr | 51755A2 | Çekerken veya kürlerken optik fiberleri tutmak için iyi |
| UV ile kürlenebilen yapıştırıcı | Delo Photobond | GB368 | Saçılma küresi yapmak için |
| UV ışık kaynağı | Thorlabs | M365FP1 | Saçılma topunda yapıştırıcıyı sertleştirmek için ışık kaynağı, bu sma-fiber uyumludur, daha yüksek yoğunluk = daha az kürlenme süresi |
| Beyaz LED ışık kaynağı | Thorlabs | MCWHF2 | Çekilmiş elyaf ve saçılma küresini karakterize etmek için |
Kaynaklar
- Williams, J. Optical properties of the ocean. Reports on Progress in Physics. 36 (12), 1567-1608 (2001).
- Solonenko, M., et al. In vivo reflectance measurement of optical properties, blood oxygenation and motexafin lutetium uptake in canine large bowels, kidneys and prostates. Physics in Medicine & Biology. 47 (6), 857-873 (2002).
- Vásquez-Elizondo, R. M., Enríquez, S. Light absorption in coralline algae (Rhodophyta): A morphological and functional approach to understanding species distribution in a coral reef lagoon. Frontiers in Marine Science. 4, 393(2017).
- Samatham, R. Optical properties of mutant versus wild-type mouse skin measured by reflectance-mode confocal scanning laser microscopy (rCSLM). Journal of Biomedical Optics. 13 (4), 041309(2008).
- Dimofte, A., Finlay, J. C., Zhu, T. C. A method for determination of the absorption and scattering properties interstitially in turbid media. Physics in Medicine & Biology. 50 (10), 2291-2311 (2005).
- Wang, L., Jacques, S. L., Zheng, L. MCML-Monte Carlo modeling of light transport in multi-layered tissues. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 47 (2), 131-146 (1995).
- Wangpraseurt, D., Larkum, A. W. D., Ralph, P. J., Kühl, M. Light gradients and optical microniches in coral tissues. Frontiers in Microbiology. 3, 316(2012).
- Garcia-Pichel, F. A SCALAR IRRADIANCE FIBER-OPTIC MICROPROBE FOR THE MEASUREMENT OF ULTRAVIOLET RADIATION AT HIGH SPATIAL RESOLUTION. Photochemistry and Photobiology. 61 (3), 248-254 (1995).
- Rickelt, L. F. Fiber-Optic Probes for Small-Scale Measurements of Scalar Irradiance. Photochemistry and Photobiology. 92 (2), 331-342 (2016).
- Jorgensen, B. B. A simple fiber-optic microprobe for high resolution light measurements: Application in marine sediment. Limnology and Oceanography. 31 (6), 1376-1383 (1986).
- Kühl, M., Lassen, C., Jørgensen, B. B. Optical properties of microbial mats: Light measurements with fiber-optic microprobes. Microbial Mats. NATO ASI Series. 35, Springer. Berlin, Heidelberg. (1994).
- Holt, A. L., Vahidinia, S., Gagnon, Y. L., Morse, D. E., Sweeney, A. M. Photosymbiotic giant clams are transformers of solar flux. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140678(2014).
- Nayak, G., et al. Adaptive thermogenesis in mice is enhanced by opsin 3-dependent adipocyte light sensing. Cell Reports. 30 (3), 672-686 (2020).
- Zhang, K. X., et al. Violet-light suppression of thermogenesis by opsin 5 hypothalamic neurons. Nature. 585 (7825), 420-425 (2020).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
