Organik Peroksiasitlerin Süt Biyofilmlerinin Eradikasyonunda Etkinliğinin Statik ve Dinamik Yöntemleri Birleştiren Bir Yaklaşım Kullanılarak Değerlendirilmesi

Süt ürünleri endüstrisi, her yıl yaklaşık 90 milyon hL süt üreten 10.500'den fazla süt çiftliğinin bulunduğu Kanada da dahil olmak üzere dünya çapında büyük bir sanayi sektörüdür¹. İşleme tesisleri de dahil olmak üzere süt endüstrisinde uygulanan katı hijyen gereksinimlerine rağmen, süt mikroorganizmalar için harika bir kültür ortamı oluşturur ve bu nedenle süt ürünlerinin bozulma veya patojenik mikroorganizmalar da dahil olmak üzere mikroorganizmalar içermesi muhtemeldir. Bu patojenler çeşitli hastalıklara neden olabilir; Örneğin, Salmonella sp. ve Listeria monocytogenes sırasıyla gastroenterit ve menenjite neden olabilir,². Bozulma mikroorganizmaları, gazlar, hücre dışı enzimler veya asitler üreterek süt ürünlerinin kalitesini ve organoleptik özelliklerini etkileyebilir³. Sütün görünümü ve rengi de değiştirilebilir, örneğin Pseudomonas ^spp.4.

Bu mikroorganizmaların bazıları, paslanmaz çelik de dahil olmak üzere farklı yüzeylerde biyofilmler oluşturabilir. Bu tür biyofilmler, ekipmanın yüzeyindeki mikroorganizmaların kalıcılığını ve çoğalmasını ve böylece süt ürünlerinin kontaminasyonunu sağlar⁵. Biyofilmler, ısı transferini engelleme ve ekipmanın korozyonunu hızlandırma, ekipmanın erken değiştirilmesine ve dolayısıyla ekonomik kayıplara yol açma yetenekleri nedeniyle de sorunludur⁶.

Yerinde temizlik (CIP) prosedürleri, gıda endüstrisinin mikroorganizmaların büyümesini kontrol etmesini sağlar. Bu prosedürler, sodyum hidroksit, nitrik asit ve bazen hipokloröz asit ve perasetik asit içeren dezenfektanların sıralı kullanımını içerir ^7,8. Hipokloröz asit mikroorganizmalara karşı oldukça etkili olmasına rağmen, doğal organik madde ile reaksiyona girerek toksik yan ürünlerin oluşumuna neden olur⁹. Perasetik asit zararlı yan ürünler üretmez¹⁰; Bununla birlikte, gıda endüstrisinde biyofilmlere karşı etkinliği oldukça değişkendir^10,11. Son zamanlarda, perpropiyonik ve perlaktik asitler de dahil olmak üzere diğer peroksiasitler, antimikrobiyal aktiviteleri için incelenmiştir ve biyofilmlerde mikrobiyal büyümenin kontrolü için iyi bir alternatif gibi görünmektedirler^12,13.

Bu nedenle, bu çalışmada, süt biyofilmlerinin eradikasyonu için organik peroksiasitlerin (perasetik, perpropiyonik ve perlaktik asitler ve perasetik asit bazlı bir dezenfektan) etkinliğini, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEC) testi, statik bir yüksek verimli tarama yöntemi ve in situ taklit eden dinamik bir yöntem olan Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) biyofilm reaktörünü birleştiren bir yaklaşım kullanarak değerlendirmeyi amaçlamıştır. Koşul -ları. MBEC testi bundan böyle protokolde "biyofilm mikrotitre plakaları" olarak anılacaktır. Burada sunulan protokol ve temsili sonuçlar, organik peroksiasitlerin etkinliğini ve süt endüstrisinde mikrobiyal biyofilmleri kontrol etmek için potansiyel uygulamalarını göstermektedir.

Bu makalede yer alan çalışmalar bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarı gerektirmektedir ve daha önce Université Laval kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmıştır (Proje numarası 119689).

NOT: Şekil 1'deki akış şeması, biyofilmleri yok etmek için organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için kullanılan statik ve dinamik yaklaşımları birleştiren metodolojinin bir özetini temsil etmektedir.

1. Malzemelerin hazırlanması

1. Mikrobiyal izolatlar
   1. Biyolojik güvenlik kabinini (BSC) kullanımdan 15 dakika önce açın ve p (v/v) alkol çözeltisiyle temizleyin.
   2. BSC sterilize edildikten sonra, test edilecek mikrobiyal izolattan bir şişe (bu çalışmada Pseudomonas azotoformans veya Brevundimonas vesicularis ), bir aşılama döngüsü, 10 mL steril triptik soya suyu (TSB) ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüp ve bir vorteks karıştırıcı yerleştirin. BSC'ye yerleştirmeden önce, tüm malzemeleri alkolle dezenfekte edin.
   3. Kültürü homojenize etmek için mikrobiyal izolat şişesini vorteksleyin.
   4. Aseptik olarak mikrobiyal izolatın 20 μL'sini 15 mL'lik bir tüpte bulunan 10 mL steril TSB'ye aktarın ve 160 rpm'de ajitasyon ile 16-24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
      DİKKAT: B. vezicularis, patojenik organizmaların taşınması için gerekli kılavuzlara uygun olarak muhafaza seviyesi 2 laboratuvarında kullanılmalıdır. İşleyici uygun şekilde eğitilmeli ve güvenlik gözlükleri, eldivenler ve bir ceket giymelidir.
2. Dezenfektanlar
   1. Organik peroksiasit çözeltisini (60 mL) hazırlamak için, 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine 24 mL hidrojen peroksit ve 36 mL asit (asetik, propiyonik veya laktik asit) ekleyin. Ardından, önceden tanımlanmış bir 10 M sülfürik asit hacmi ekleyin (perasetik asit için 655 μL, perpropiyonik asit için 635 μL veya perlaktik asit için 715 μL). Şişeyi karıştırmak için hafifçe sallayın ve şişeyi kimyasal davlumbazın içine yerleştirilmiş 30 ° C'lik bir su banyosuna koyun. Şişeyi 2 gün boyunca inkübe edin, her sabah hafifçe karıştırın.
      NOT: Ticari perasetik asit bazlı dezenfektan (bakınız Malzeme Tablosu) doğrudan üretici tarafından sağlanmıştır.
      DİKKAT: Dezenfektanlar kimyasal başlık altında kullanılmalıdır. Deney süresince koruyucu gözlük ve eldiven takılmalıdır. Dezenfektanlar hakkında daha fazla bilgi için lütfen ilgili Malzeme Güvenlik Bilgi Formuna bakın.
   2. Aşağıda açıklandığı gibi hidrojen peroksit titrasyonunu gerçekleştirin.
      1. Analitik teraziye 300 mL'lik boş bir beher yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve teraziyi daraltın. Beherin içine yaklaşık 0,23 g dezenfektan tartın ve eklenen tam ağırlığı not edin. Beherin içine 100 g soğuk 1 N sülfürik asit çözeltisi ekleyin, beherin içine manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin ve bir karıştırma plakasına yerleştirin.
      2. Çözeltinin homojenizasyon tamamlanana kadar karıştırılmasına izin verin. Daha sonra, beherin içine üç damla ferroin gösterge çözeltisi (H₂O'da ağırlıkça% 0.1) ekleyin ve çözelti somon pembesi renginden açık mavi bir renge dönüşene kadar 0.1 N seryum sülfat çözeltisi ile titre edin. Eklenen seryum sülfat çözeltisinin hacmine dikkat edin.
      3. Aşağıdaki formülü kullanarak hidrojen peroksit yüzdesini hesaplayın:
         Ek. (1)
         burada S, seryum sülfat çözeltisinin eklenen hacmidir, N, seryum sülfat çözeltisinin normalliğidir (0.1 N), W, numunenin ağırlığıdır (~ 0.2300 g) ve 0.017 = (1 mol H 2 O 2/2 mol Ce) × (34.0147 g H₂ O 2 / 1 mol H 2 O)₂ × (1 L / 1.000 mL)
   3. Organik peroksiasitlerin titrasyonunu aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
      1. Bir beherin içine 20 mL% 7.5 (w / v) potasyum iyodür çözeltisi ekleyin. Çözeltinin mavi rengi soluk kahverengi / turuncuya dönmeye başlayana kadar 0.1 N sodyum tiyosülfat çözeltisi ile yavaşça titre edin.
      2. Beherin içine 2 mL nişasta çözeltisi (_H2O'da ağırlıkça% 1) ekleyin ve çözelti siyahtan turuncuya değişene kadar 0.1 N sodyum tiyosülfat çözeltisi ile titre edin. Kullanılan sodyum tiyosülfat çözeltisinin hacmine dikkat edin.
      3. Aşağıdaki formülle organik peroksiasit yüzdesini hesaplayın:
         Ek. (2)
         burada T, kullanılan sodyum tiyosülfat çözeltisinin hacmidir, N, sodyum tiyosülfat çözeltisinin normalliğidir (0.1 N), W, numunenin ağırlığıdır (~ 0.2300g) ve 0.038 = (1 mol CH 3 COOOH / 1 mol I 2) × (1 mol I 2/2 mol S₂ O 3) × (76.06 g / 1 mol CH₃COOOH) × (1 L / 1.000 mL)
         NOT: Her testi üçlü olarak gerçekleştirmek için adım 1.2.2 ve adım 1.2.3'ü iki örnekle tekrarlayın.

2. Tek ve karışık biyofilmlerin oluşumu

1. Biyofilm mikrotitre plakaları
   1. Bakteri kültürünü içeren tüpü vorteks edin (20 μL suş + 10 mL TSB ortamı, adım 1.1.4'te hazırlanmıştır). Gece kültürünün bakteriyel hücre sayısını (cfu) belirlemek için triptik soya agar (TSA) üzerinde seri seyreltme ve kaplama yapın. Daha sonra, aseptik olarak kültürün 100 μL'sini 10 mL steril TSB ortamına aktarın (yaklaşık 2 x 10⁷ cfu / mL'lik bir son konsantrasyon için).
      NOT: Biyoreaktör ile yapılan tahlil için, mikrobiyal izolattan 100 μL'lik bir hacim, 100 mL steril TSB'ye aktarılır.
   2. Tüpü vorteks. Her bakteri için, seyreltilmiş bakteri kültürünü, çok kanallı bir pipet kullanarak üçlü olarak biyofilm mikrotiter plakasına (kuyucuk başına 150 μL) aktarın. 150 μL TSB ortamını kontrol görevi görecek şekilde üç yeni kuyuya yükleyin. Biyofilm mikrotitre plakasını (bakınız Malzeme Tablosu) 30 °C'de 24 saat boyunca ajitasyon olmadan inkübe edin.
      NOT: Karışık biyofilm analizleri için, toplam 150 μL hacim için her süspansiyondan 75 μL ekleyin. Biyofilm mikrotitre plakası, kapaklarında biyofilmlerin oluştuğu mandallar içerir.
2. Biyoreaktör
   1. Biyoreaktörün parçalarını temizleyin ve havayla kurutun (bkz. Malzeme Tablosu) ve reaktörü aşağıda açıklandığı gibi hazırlamaya devam edin.
      1. İlk olarak, düz bıçağı, tutucusuna manyetik bir çubukla tutturulmuş 1 L cam kabın (biyoreaktör) içine yerleştirin ve biyoreaktör kapağının iç tarafına tutturulmuş plastik çubuk vasıtasıyla kurulumu dik konumda tutun.
      2. Tornavidayı kullanarak paslanmaz çelik kuponları veya slaytları ( Malzeme Tablosuna bakınız) polipropilen çubuklarına yerleştirin ve sterilizasyon sırasında buharın kaçmasına izin vermek için hizalama pimlerini çentiklere yerleştirmeden kapaktaki deliklere yerleştirin.
      3. Tüm biyoreaktör havalandırma deliklerini alüminyum folyo ile örtün ve ekipmanın geri kalanını, yani boru L / S 18 (ID = 7.9 mm) ve L / S 16 (ID = 3.1 mm), cam akış kırılması, konteyner kapakları, tornavidalar, forsepsler ve 0.2 μm filtreleri, alüminyum folyo ile sarın.
         NOT: Silikon boruyu (bkz. Malzeme Tablosu) orta boy kap kapağının iç yüzeyinde bulunan dikenin içine yerleştirin.
      4. Biyoreaktörü 20 dakika boyunca 121 °C'de kuru bir döngüde otomatik olarak ayarlayın.
   2. Biyoreaktörde biyofilm oluşumunu parti modunda gerçekleştirin (ilk adım).
      1. Bir BSC'de, boru L / S 18'in bir ucunu biyoreaktörün çıkış ağzına bağlayın ve steriliteyi korumak için diğer ucunu alüminyum folyoya sarılı tutun.
      2. Biyoreaktör kapağından bir kupon veya sürgü tutucuyu çıkarın ve steril 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin. Daha sonra, biyoreaktörün kabını, 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak çubuğun kapladığı delikten 340 mL 300 mg / L TSB ortamı ile doldurun.
      3. Biyoreaktördeki kültür ortamını, daha önce kullanılan aynı delikten 5 mL'lik bir pipet kullanarak 1 mL bakteri çözeltisi (~ 10⁸ cfu / mL P. azotoformans) ile aşılayın ve ardından çubuğu orijinal konumuna geri yerleştirin. Kapak deliklerine zaten yerleştirilmiş olan çubukları, pimler kendi çentiklerine sığacak şekilde konumlandırın.
      4. Biyoreaktörün kapağında bulunan en küçük çaplı tüpün ucuna 0,2 μm'lik bir bakteriyel hava tahliye filtresi yerleştirin. Aynı çaptaki diğer boru, metal vidalı bir kapak veya sıkıca kapanan silikon bir fiş ile kalıcı olarak takılı kalır.
      5. Biyoreaktörü 30 °C'de ayarlanmış ısıtma plakasının üzerine 24 saat boyunca yerleştirin ve 130 rpm'de karıştırın.
         NOT: Çok türlü biyofilm oluşumu için, inokulum için toplam 1 mL hacim elde etmek üzere farklı bakteri kültürlerinin eşit hacmini kullanın.
   3. Biyoreaktörde biyofilm oluşumunu sürekli akış modunda gerçekleştirin (ikinci adım).
      1. BSC'ye 18 L steril damıtılmış su içeren bir damacana yerleştirin ve 100 mg / L'lik nihai bir konsantrasyon elde etmek için 2 L 1.000 mg / L TSB kültür ortamı ekleyin.
      2. Kabı, iki tüpün bağlı olduğu steril kapağıyla örtün. Birincisi, kapağın iç yüzüne sabitlenmiş silikon bir tüptür ve ortamı pompalamak için kullanılır. İkinci tüp (L/S 16), sıvının biyoreaktöre doğru akmasını sağlamak için harici porta bağlanır. Orta boy kabın kapağındaki ikinci tüpe 0,2 μm'lik bir filtre yerleştirin.
      3. Bu ikinci tüpü peristaltik pompaya bağlayın ve diğer ucunu cam akış kopuğuna birleştirin, daha sonra biyoreaktör kapağındaki daha büyük tüpe yerleştirilir.
      4. Atık suyu biyoreaktörden toplamak için başka bir 20 L damacana kullanın. Biyoreaktör çıkış ağzına bağlı tüpün ucunu atık kabının kapağına takın. Bu kabın kapağında bulunan tüpe 0,2 μm'lik bir filtre yerleştirin.
      5. Peristaltik pompayı 11,3 mL/dak akış hızında çalıştırın ve sistemi 24 saat çalışır durumda bırakın.
         NOT: Biyoreaktörde biyofilm oluşumu sırasında kullanılan kültür ortamının veya sütün akış hızı (11,3 mL/dak), 340 mL'nin (reaktör içindeki sıvının hacmine karşılık gelir) 30 dakikalık ikamet süresine bölünmesiyle belirlenmiştir.
   4. Bakteriyel biyofilmi geri kazanın.
      1. Peristaltik pompayı kapatın ve biyoreaktörü karıştırmayı ve ısıtmayı bırakın.
      2. Her çubuğu biyoreaktörden dikkatlice çıkarın ve planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için kuponları veya slaytları 40 mL PBS'de 3 kat durulayın. Daha sonra, kuponları veya slaytları uygun bir tornavida kullanarak 40 mL PBS içeren steril 50 mL konik tüplere bırakın. Tüpleri 30 s vorteksleyin, bir sonicator banyosuna yerleştirilmiş bir rafa aktarın ve tüpleri 40 s için 30 kHz'de (110 W güç gerektiren) sonikleştirin. Bu işlemi 3 kat tekrarlayın.
      3. 40 mL biyofilm süspansiyonlarını steril 50 mL konik tüplerde toplayın ve ardından kuponları veya slaytları 2 mL steril PBS çözeltisi ile durulayın. Bu durulama sıvısını geri kazanın ve önceden toplanan biyofilm süspansiyonuna ekleyin.
   5. Biyofilmdeki canlı bakterileri numaralandırın: Elde edilen biyofilm süspansiyonu ile 10 kat seri seyreltme yapın ve daha sonra TSA üzerindeki 10−⁵ ve 10⁻⁶ seyreltmelerin 100 μL'sini üçlü olarak plakalayın. Plakaları 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin. Agar plakalarında bulunan kolonilerin sayısını sayın ve aşağıdaki formülü kullanarak ASTM E2562-17^14'e göre kuponlar ve slaytlar (canlı sapsız bakteriler) üzerindeki bakteri yoğunluğunu hesaplayın:
      Ek. (3)
      burada X , koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayısıdır, B , kaplanan hacimdir (0.1 mL), V , biyofilmin askıya alındığı hacimdir (stok çözeltisi), A , biyofilm tarafından kaplanan kuponun veya slaytın yüzeyidir ve D , seyreltme faktörüdür.

3. Biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğinin nicel olarak değerlendirilmesi

1. Biyofilm mikrotitre plakaları
   1. 96 delikli bir mikroplakanın üç kuyucuğuna 200 μL fosfat tamponlu salin (1x PBS) ekleyin.
   2. Biyofilmleri yıkamak ve planktonik bakterileri ortadan kaldırmak için biyofilm mikroplakasının kapağını, mandallar üzerinde oluşan biyofilmlerle, PBS'yi 10 s boyunca içeren 96 delikli mikro plakaya aktarın.
   3. Dezenfektanları gerekli konsantrasyonlarda hazırlayın (örneğin, 25 ppm, 50 ppm, 500 ppm, 1.000 ppm, 5.000 ppm, 10.000 ppm ve 25.000 ppm aktif madde).
      NOT: Tüm seyreltmeler steril damıtılmış su kullanılarak aseptik olarak yapılır.
   4. Her bir dezenfektan konsantrasyonundan 200 μL'yi, üçlü olarak yeni bir 96 delikli mikrotitre plakasının kuyucuklarına ekleyin. Biyofilm mikrotitre plakasının kapağını, dezenfektanları içeren bu 96 delikli mikrotitre plakasına aktarın ve plakayı istenen maruz kalma süresi için oda sıcaklığında inkübe edin.
   5. Yeni bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasının kuyularına 200 μL Dey-Engley nötrleştirici et suyu ekleyin. Biyofilm mikrotitre plakasının kapağını, nötralize edici suyu içeren 96 delikli mikrotitre plakasına aktarın. Mikrotitre plakasını parafilm ile kapatın ve 30 dakika boyunca 40 kHz'de banyo sonikatörüne yerleştirin.
   6. 30 dakika sonra, mikrotitre plakasını sonikatörden çıkarın ve parafilmi çıkarın. Sonikasyondan sonra ayrılan biyofilmleri içeren 96 kuyucuklu plakanın ilk sütunundan 100 μL'yi yeni bir 96 kuyucuklu mikrotitre plakasının ilk sırasına aktarın.
   7. İlk sıra hariç, yeni 96 delikli mikro plakanın (adım 3.1.6'da hazırlanan) kuyularına 180 μL steril 1x PBS ekleyin. Biyofilm çözeltisinin 20 μL'sini ilk sıradan 180 μL 1x PBS içeren ikinci sıradaki kuyucuklara aktarın (Satır 2, seyreltme: 10⁻¹). Daha sonra, ikinci sırada bulunan sıvının 20 μL'sini, 180 μL 1x PBS içeren bir sonraki sıradaki kuyucuklara aktarın (Satır 3, seyreltme: 10⁻²). ^10-5 ile 10⁻⁷ arasında seyreltmeler elde etmek için aynı prosedürü tekrarlayın.
   8. TSA üzerindeki seyreltmelerin 100 μL'sini aşılayın ve plakaları her bakterinin büyümesi için gerekli parametrelere göre inkübe edin.
   9. Kuluçkadan sonra, cfu'yu sayın ve aşağıdaki denklemlerle her mandal için log 10 yoğunluğunu ve her dezenfektan konsantrasyonunda log₁₀ indirgemesini hesaplayın:
      Ek. (4)
      burada X , noktada sayılan koloni oluşturan birimlerdir, B , kaplanmış hacimdir (0.01 mL), V , kuyu hacmidir (0.20 mL), A , mandal yüzey alanıdır (46.63^mm2) ve D , seyreltmedir.
      Ek. (5)
   10. Her deneyi bağımsız günlerde 3 kez tekrarlayın.
       NOT: "Biyofilmi yok eden minimum dezenfektan konsantrasyonu" veya MBEC, bakteriyel büyüme göstermeyen en düşük dezenfektan konsantrasyonuna karşılık gelir.
2. Biyoreaktör
   NOT: Bu testi P. azotoformans PFlA1 ile gerçekleştirmek için ASTM standardı^{E2871-19 15'in} prosedürü izlenir.
   1. Adım 2.2'de açıklandığı gibi, biyoreaktördeki kuponlar üzerindeki biyofilmleri oluşturarak başlayın. Ardından, kuponları tutan çubuğu çıkarın ve 30 mL PBS içeren konik bir tüp içinde durulayın.
   2. Her kuponu bir tornavida kullanarak steril bir 50 mL konik tüpe bırakın ve ardından kontrol için 4 mL uygun organik peroksiasit çözeltisi veya PBS ekleyin. 5 dakika boyunca inkübe edin ve ardından 36 mL Dey-Engley nötrleştirici et suyu ekleyin. 30 s için vorteks ve daha sonra bir sonicator banyo kullanarak 40 s için 30 kHz'de sonikasyon. Biyofilm süspansiyonunu elde etmek için işlemi 3 kat tekrarlayın.
   3. Benzer şekilde, diğer tüm çubukları durulayın ve biyofilmleri kuponlardan kurtarın. TSA ortamında biyofilm süspansiyonunun ve plaka 0,1 mL'nin seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Plakaları 24 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edin.
   4. Kuluçkadan sonra, cfus'u sayın ve ardından aşağıdaki denklemleri kullanarak her kupon için biyofilm yoğunluğunu (Eq. 6), muamele ve kontrol dahil olmak üzere aynı çubuktan her üç kupon seti için ortalama log yoğunluğunu (LD) (Eq. 7) ve dezenfektan için log indirgemesini (Eq. 8) hesaplayın:
      Ek. (6)
      burada X , sayılan / kupon oluşturan birimlerin ortalamasıdır, B , kaplanan hacimdir (0.1 mL), V , dezenfektan veya PBS artı nötrleştiricinin (40 mL) hacmidir ve D , seyreltmedir.
      Ek. (7)
      Ek. (8)

4. Biyofilmlerin eradikasyonunda organik peroksiasitlerin etkinliğinin nitel olarak değerlendirilmesi

NOT: Dezenfektanlarla (adım 3.1.1 ila adım 3.1.5) muamele edildikten sonra, statik yöntemde biyofilm mikrotiter plakasının mandalları üzerinde oluşan P. azotoformans biyofilmleri, taramalı elektron ve konfokal mikroskoplar üzerinde gözlemlenerek hazırlanmış ve analiz edilmiştir.

1. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)
   1. 96 delikli bir mikro plakanın üç kuyucuğuna 200 μL 1x PBS ekleyin. Kapağı biyofilm mikrotitre plakasından (adım 3.1.5) PBS içeren 96 delikli mikro plakaya aktarın ve Dey-Engley nötrleştirici suyu ortadan kaldırmak için oda sıcaklığında 10 s bekletin.
   2. Sterilize edilmiş iğne burun penseleri kullanarak mandalları biyofilm mikrotiter plakasından çıkarın. Her mandalı bir kaputun altındaki boş bir şişeye yerleştirin ve her şişeye birincil fiksatif (0.1 M Na kakodilat tampon pH 7.5'te% 5 glutaraldehit) ekleyin. Her şişeyi kapatın ve 24 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   3. Kuluçkadan sonra, fiksatifi bir pipetle boşaltın ve tüm sıvı atıkları uygun bir kaba atın. Her şişenin kapaklarını çıkarın ve 72 saat boyunca hava ile kuruması için bir davlumbaza yerleştirin.
   4. Her saplamanın düz üst yüzeyine epoksi reçine uygulayarak numuneleri alüminyum saplamalara (bkz. Malzeme Tablosu) monte edin. Ardından, mandalları forseps ile saplamalara dikkatlice yapıştırın.
   5. Numuneleri EMS950x + 350s altın püskürtme ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 2 x 10⁻¹ bar argon basıncında ve 20 mA akımda 4 dakika boyunca metalize edin. Mandalın altına maruz kalmayan tarafını gümüş boya ile boyayarak uygun topraklamayı gerçekleştirin (bkz.
   6. SEM kontrolü kullanıcı arabirimi sürüm 6.28'i kullanarak taramalı elektron mikroskobunda görüntüler elde edin (bkz. Bu çalışmada kullanılan ivme gerilimi 15 kV, büyütmeler ise 300x ve 2.000x idi.
2. Konfokal mikroskopi
   1. 96 delikli bir mikrotitre plakasının üç kuyucuğuna 200 μL 1x PBS ekleyin. Kapağı biyofilm mikroplakasından PBS'yi içeren 96 delikli plakaya aktarın ve Dey-Engley nötrleştirici suyu ortadan kaldırmak için 10 sn bekletin.
   2. 1 mL steril suya 3 μL yeşil floresan boyası ve 3 μL kırmızı floresan lekesi ekleyerek floresan lekelerinin çözeltilerini hazırlayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. 96 delikli bir mikrotitre plakasının bir kuyucuğuna 200 μL boyama çözeltisi ekleyin. Kapağı biyofilm mikrotitre plakasından boyama çözeltisini içeren 96 delikli plakaya aktarın. Biyofilm mikrotitre plakasını alüminyum folyo ile örtün ve numuneyi oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
   4. 96 delikli bir mikro plakanın kuyularına 200 μL sterilize su ekleyin. Ardından, kapağı biyofilm mikroplakasından suyu içeren 96 delikli mikro plakaya aktarın ve gözleme kadar bırakın.
   5. Mandallarda oluşan biyofilmleri, 63x/1.40 yağ DIC hedefi ile konfokal lazer tarama mikroskobu kullanarak görselleştirin ( bakınız Malzeme Tablosu). İlişkili yazılımı kullanarak görüntüleri edinin (bkz. Yeşil ve kırmızı floresan lekeleri için kullanılan floresan uyarma dalga boyları sırasıyla 482 nm ve 490 nm idi.
      NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, mandalı kesin ve 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin ve kabı steril suyla doldurun.

SEM analizi, biyofilm mikroplaka mandalları üzerinde P. azotoformans PFl1A tarafından üretilen biyofilmlerin varlığını göstermektedir (Şekil 2A). Üç boyutlu bir biyofilm yapısı gözlemlenebilir. P. azotoformans PFl1A daha önce 96 kuyucuklu mikrotitre plakaları12 kullanılarak güçlü bir biyofilm üreticisi (A570 > 1.5) olarak tanımlanmıştı.

Ek olarak, biyoreaktör kullanılarak paslanmaz çelik bir slayt üzerinde oluşan P. azotoformans PFl1A biyofilminin çok yoğun olduğu ve üç boyutlu bir yapıya sahip olgun bir biyofilmin morfolojik özelliklerini gösterdiği görülmüştür (Şekil 2B). Ayrıca, dinamik sistemde bu izolat tarafından geliştirilen biyofilmlerin bakteri sayımlarının sonuçları, TSB kültür ortamında ve steril yağsız sütte sırasıyla 8.74 log CFU / cm2 ve 7.86 log CFU /cm2'ye karşılık gelen önemli hücre yoğunluklarını göstermiştir (Şekil 2C).

Ayrıca, B. vesicularis izolatı ile elde edilen Şekil 3'te gösterilen sonuçlar, bazı faktörlerin biyoreaktörde biyofilm oluşumu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabileceğini göstermiştir. Biyoreaktör içindeki karıştırma hızı, orta akış hızı, orta besin konsantrasyonu ve sürekli mod adımının süresi gibi bazı parametreler değiştirilerek, hücre bağlantısı arttırılabilir ve daha yoğun biyofilmler gözlemlenebilir. Örneğin, besin konsantrasyonunun 100 mg / L'den 900 mg / L'ye (F koşuluna kıyasla A koşulu) arttırılması, biyofilmlerin bakteriyel sayısının 6.11 log CFU / cm2'den 8.71 log CFU /cm2'ye yükselmesine neden olmuştur. Ayrıca, akış hızı 6.0 mL / dak'ya (C durumunda) düşürüldüğünde biyofilmlerin önemli ölçüde büyümesi gözlenmiştir, bu da bu izolatın büyüme hızıyla tutarlı olarak daha uzun bir ikamet süresine neden olmuştur.

Biyofilm mikrotiter plakaları veya biyoreaktör öncesi ve sonrası dezenfektan tedavisi üzerinde oluşan biyofilmlerin mikroskobik gözlemleri, uygulanabilir hücre sayımlarını tamamlayıcı nitelikteydi. Şekil 4 , biyofilmlerin hiçbirinin, genellikle süt tesislerinde uygulanan dezenfektanların temas zamanında (5 dakika) ve konsantrasyonlarında (organik peroksiasitlerle 500 ppm ve hidrojen peroksitle 100.000 ppm) tespit edilebilir canlı hücreler içermediğini göstermektedir. Bu sonuçlar mikroskopi ile doğrulandı (Şekil 5). Şekil 5A, işlenmemiş bir MBEC biyofilminin (kontrol) üç boyutlu yapısını gösterirken, işlenmiş MBEC biyofilmleri (hidrojen peroksit, perasetik asit, perlaktik asit, perpropiyonik asit ve ticari bir dezenfektan preparatı ile) SEM tarafından belirlenen üç boyutlu konformasyonlarını kaybeder. Bununla birlikte, biyofilmler dezenfektan ile muamele edilmesine rağmen, özellikle hidrojen peroksit ile belirgin bir biyofilm yapısı kalmıştır. Bununla birlikte, canlı / ölü tekniğinin kullanılması, bu durumda, floresan canlılık boyama ile konfokal mikroskopi (CM), kalan biyofilm yapısının bir dezenfektan işleminden sonra esas olarak cansız olduğunu doğrulamıştır (Şekil 5B).

Şekil 1: Biyofilmleri yok etmek için organik peroksiasitlerin etkinliğini değerlendirmek için birleşik statik ve dinamik bir yaklaşımı temsil eden akış şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Pseudomonas azotoformans PFl1A ile biyofilm oluşumunun analizi. (A) Biyofilm mikrotitre plakasının mandalları üzerinde oluşan P. azotoformans PFl1A biyofilminin elektron mikrograflarının (300x ve 2.000x) taranması. Bu rakam Goetz ve ark.12'den izin alınarak değiştirilmiştir (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tüm Hakları Saklıdır.) Ölçek çubukları = 50 μm (300x), 100 μm (2.000x). (B) (1) biyoreaktörde yetiştirilen P. azotoformans PFl1A biyofilm içeren paslanmaz çelik bir slaytın ve (2) biyofilm içermeyen bir slaytın (negatif kontrol) elektron mikrograflarının (2.000x) taranması. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam Niboucha ve ark.16'dan izin alınarak değiştirilmiştir. (C) P. azotoformans PFl1A biyofilmlerinin bakteri yoğunluğu TSB kültüründe biyoreaktörde oluşan orta ve steril yağsız süt ve paslanmaz çelik slaytlardan ultrasonikasyon ile çıkarıldıktan sonra belirlenir. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmaktadır. Anlamlı fark (p < 0.05) Öğrencinin t-testine dayanmaktadır. Bu rakam Niboucha ve ark.16'dan izin alınarak değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Değişen karıştırma koşulları, akış hızları, sürekli modda geçen süre ve kültür ortamı (TSB) altında biyoreaktör kullanılarak geliştirilen Brevundimonas vesicularis biyofilmlerinin bakteriyel yoğunluğu. Durum A: 130 rpm karıştırma hızı, 11,8 mL/dak akış hızı, 100 mg/L TSB ortamında 24 saat sürekli mod (Pseudomonas aeruginosa tarafından biyofilm oluşumu için ASTM Uluslararası protokolü E2562-1714'e uygun olarak); Durum B: 60 rpm karıştırma hızı, 11,8 mL/dak akış hızı, 100 mg/L TSB ortamında 24 saat sürekli mod; Durum C: 60 rpm karıştırma hızı, 6,0 mL/dak akış hızı, 100 mg/L TSB ortamında 24 saat sürekli mod; Durum D: 60 rpm karıştırma hızı, 6,0 mL/dak akış hızı, 100 mg/L TSB ortamında 48 saat sürekli mod; Durum E: 60 rpm karıştırma hızı, 6,0 mL/dak akış hızı, 300 mg/L TSB ortamında 48 saat sürekli mod; Durum F: 900 mg/L TSB ortamında 60 rpm karıştırma hızı, 6,0 mL/dak akış hızı, 48 saat sürekli mod; Durum G: 60 rpm karıştırma hızı, 6,0 mL / dak akış hızı, 2,7 g / L TSB'de 24 saat parti modu ve 900 mg / L TSB ortamında 48 saat sürekli mod. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmaktadır. Anlamlı farklılıklar (farklı harfler, p < 0.05) tek yönlü ANOVA ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testine dayanmaktadır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Pseudomonas azotoformans PFl1A biyofilmlerinde hidrojen peroksit, perlaktik asit, perpropiyonik asit, perasetik asit veya ticari dezenfektan ile işlemden önce ve sonra canlı hücre sayısı. Her nokta, her bir izolat için üç bağımsız günde elde edilen üçlü sayımların ortalamasını temsil eder. Veriler ortalama ± SD (n = 3) olarak sunulmaktadır. Bu rakam Goetz ve ark.12'den izin alınarak değiştirilmiştir (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tüm Hakları Saklıdır.) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Biyofilm yapısının ve canlılığının mikroskobik gözlemi. (A) Hidrojen peroksit, perasetik asit, perlaktik asit, perpropiyonik asit ve ticari dezenfektan ile minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonlarında (MBEC) işlemden önce (kontrol) ve sonra biyofilm mikrotiter plakasının mandalları üzerinde oluşan bir Pseudomonas azotoformans PFl1A biyofilminin elektron mikrograflarının (300x ve 2.000x) taranması. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakam Goetz ve ark.12'den izin alınarak değiştirilmiştir (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tüm Hakları Saklıdır.) (B) P. azotoformans PFl1A tarafından oluşturulan bir biyofilmin, perasetik asit (500 ppm) ile (solda) ve sonra (sağda) biyofilm mikroplaka mandalı üzerinde floresan hücre canlılığı boyama kullanılarak oluşturulan, konfokal lazer tarama mikroskobu (63x/1.40 yağ diferansiyel girişim kontrast hedefi) ile görselleştirilen canlılığı. Canlı hücreler yeşile boyanır ve ölü hücreler kırmızıya boyanır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakam Goetz ve ark.12'nin izniyle değiştirilmiştir (Copyright 2022 American Society for Microbiology. Tüm Hakları Saklıdır.) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.