Yöntem makalesi

Pre-RNA Ekleme Analizi: Temel Bilimden Uygulamalı Araştırmaya

1.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64630

⸱

12 Eylül 2022

1Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo

Bu makalede

Özet

TARTIŞILAN MAKALELER:

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Boncuklar üzerinde bir galektin-3-u1 snrnp kompleksi ile ekleme aktivitesinin tamamlanması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (166), E61990 (2020).

Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. Ekleme verimliliğini izlemek için raportör tabanlı bir hücresel tahlil. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (175), E63014 (2021).

van der Feltz, C. ACT1-CUP1 testleri, tomurcuklanan mayadaki spliceozomal mutantların substrata özgü duyarlılıklarını belirler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (184), E63232 (2022).

Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Saccharomyces cerevisiae spliceosome alt komplekslerinin geçici interaktörlerinin tespiti için grafix kullanımı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (165), E61994 (2020).

Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Mrna ekleme değişikliklerini incelemek için E1a minigen aracını kullanma. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (170), E62181 (2021).

Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. Memeli hücrelerinde intronik mikroRNA olgunlaşmasını analiz etmek için bir raportör testi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (184), E63498 (2022).

Editöryal

Ökaryotlarda hücre fenotiplerinin ana itici güçlerinden biri gen ekspresyonudur. Gen ekspresyonunun kontrolü esastır ve transkripsiyondan translasyon işlemlerine kadar çoklu proteinlere ve RNA'lara dayanır1. Bu adımlardaki değişiklikler birkaç farklı hastalığı tetikleyebilir. RNA işleme ve ekleme, olgun RNA molekülleri 2,3,4,5'in üretilmesinden sorumlu önemli bir reaksiyon grubunu oluşturur. Ekleme, fonksiyonel ve yapısal aktiviteleri gerçekleştirebilen olgun bir RNA molekülü oluşturmak için intronları çıkarır ve ekzonları birleştirir. Eklemenin verimlilikleri ve oranları, farklı koşullar altında gözlemlenen fenotipleri büyük ölçüde etkiler6.

Ekleme, beş snRNA ve 100'denfazla proteinden 5,7 oluşan spliceosome adı verilen karmaşık bir makromoleküler makine tarafından gerçekleştirilir. Çekirdek protein bileşenlerine ek olarak, spliceozomlar, bu sürecin düzenlenmesini doğrudan etkileyebilecek trans-etkili proteinlere sahiptir 8,9. Eklemenin önemi, nörodejeneratif bozukluklar, nöromüsküler hastalıklar ve çeşitli kanser türleri dahil olmak üzere bu süreçteki değişikliklerin neden olduğu geniş hastalık yelpazesine yansır 3,10,11. Ekleme dinamikleri ve spliceosome montajının incelenmesi, bu bozuklukların biyolojisinin anlaşılmasını büyük ölçüde etkileyebilir.

Spliceosome düzeneği, U1 snRNP'nin yakın zamanda kopyalanan pre-mRNA'nın belirli bir bölgesi, 5' ekleme bölgesi 5,8 ile ilişkisi ile başlar. 5' ekleme bölgelerinin U1 snRNA tarafından verimli bir şekilde eşleştirilmesi ve tanınması, yalnızca kullanılması gereken ekleme bölgelerini tanımlamakla kalmaz, aynı zamanda hangi ön RNA'ların önce veya daha verimlibir şekilde ekleneceğini de kontrol eder 6,12,13. Farklı ekleme bölgelerinin kullanılması, aynı genden olgun RNA'ların birden fazla alternatif izoformunu üretebilir. Alternatif ekleme, gelişim sırasında veya farklı hücre ve dokularda gerekli olan RNA'ların ve proteinlerin üretilmesine izin veren önemli bir proteomik çeşitlilik kaynağıdır14,15. Alternatif RNA transkriptleri, hastalıklara neden olabilecek kesik veya işlevsel olmayan protein izoformları üretebilir10,16. Bu nedenle, U1 snRNP kompleksinin protein bileşenleri,1'in eklenmesinde önemli bir düzenleyici role sahiptir. Galektin-1 ve Galektin-3 (Gal1 ve Gal3), U1 snRNP 17,18'in bileşenleridir. Voss ve ark.19, U1'den yoksun hücrelerde ekleme aktivitesini kurtarabilen Gal3-U1 snRNP ile zenginleştirilmiş kompleksler elde etmek için bir nükleer ekstrakt fraksiyonlama yöntemi önermektedir. Bu analiz, Gal3'ün spliceozomlarla birleşme mekanizmasının anlaşılmasına katkıda bulunur ve benzer yaklaşımlar, diğer potansiyel ekleme düzenleyici proteinleri keşfetmek için kullanılabilir.

U1 snRNP'nin 5' ekleme bölgelerine bağlanması, ekleme aslına uygunluğunun20 önemli bir aracısıdır. 5' ekleme bölgelerindeki mutasyonlar kritiktir ve U1 snRNP eşleşmesinin kaybına neden olarak ekleme kusurları2 ile sonuçlanır. Örneğin kistik fibroz, CFTR geni21'deki mutasyona uğramış bir 5' ekleme bölgesinden kaynaklanır. Wong ve ark.22 , U1 snRNA'larında tamamlayıcı mutasyonlarla 5' ek yeri mutasyonlarını telafi etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Yaklaşım, ekson dahil edilmesini başarılı bir şekilde teşvik eder, olgun RNA'lar üretir ve ekleme kusurlarından kurtulma ile sonuçlanır. Bu hastalıklar için olası bir RNA bazlı tedavi sunmanın yanı sıra, bu yaklaşım, pre-mRNA'lardaki bireysel düzenleyici dizilerin analizi için yararlı olabilir23.

U1 snRNA ilişkisinin ekleme bölgelerine uygunluğu, van der Feltz24 tarafından maya model sisteminde de araştırılmıştır. Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae , ekleme kinetiğini ve spliceosome düzeneğini keşfetmek için yaygın olarak kullanılmıştır25. Ekleme kinetiği ve spliceosome bileşimi ökaryotlarda iyi korunur ve maya, montaj sırasında ara komplekslerin oluşumunu izlemek için yaygın olarak kullanılmıştır26. ACT1-CUP1 raportör testi, bir çift genin ekspresyonuna dayanır: Optimal ekleme yeri dizilerine sahip bir intron içeren ACT1 ve hücreyi bu metal iyonunun neden olduğu hasardan koruyan bir bakır şelatörü eksprese eden CUP1. CUP1, yalnızca ACT1 doğru bir şekilde eklenirse ifade edilir, bu nedenle raportör sistemi27 oluşturulur. Farklı bakır konsantrasyonlarına sahip koşullar altında hücre büyümesi, farklı intron dizilerinin ekleme verimliliğini ele almak veya farklı düzenleyici proteinler kullanmak için izlenebilir. van der Feltz24 , bu raportör sistemi ve bakır canlılık deneylerini kullanarak bir ekleme düzenleyici proteinin etkilerini analiz etmek için bir yöntem sunar. Benzer bir yaklaşım, mayalarda ekleme başarısını ele almak için farklı proteinlerle kombinasyon halinde intron dizilerindeki varyasyonları tasarlamak için kullanılabilir.

snRNP ilişkisine ek olarak, spliceosome montajı1 sırasında proteinlerin bağlanması esastır. Spliceosome aktivitesinin kontrolü, doğrudan protein bileşimine ve oluşumu sırasında meydana gelen etkileşimlere bağlıdır. Protein bileşenlerinin yapısal ve fonksiyonel özellikleri, kompleksi aktive etmek için önemlidir 5,7. Carvalho ve ark.28, gliserol gradyan analizinde geri dönüşümsüz protein çapraz bağlanmasına dayanan Grafix yöntemine dayalı bir yaklaşım kullanmaktadır. Bu analiz, proteinlerin bileşimini ve montaj sırasında meydana gelen, aktif kompleksin montajı ve birleştirme başarısı için kritik olabilecek geçici etkileşimleri ele alır. Bu yaklaşımla diğer dinamik makromoleküler komplekslerin analizi çok faydalı olabilir ve protein organizasyonu ve etkileşimleri hakkında fikir verebilir.

Eklemenin kimyası ve hızı, farklı spliceosome bileşenlerinin8 dinamik ilişkisinden de etkilenir. Son zamanlarda, küçük moleküllü ekleme inhibitörlerinin kullanımı, ekleme reaksiyonlarının hızının azalması nedeniyle belirli adımların in vitro olarak durdurulabileceğini ortaya koymuştur29,30. Basei ve ark.31, ekleme düzenleyici faktörü Nek4'ün etkisi üzerinde alternatif eklemeyi analiz etmek için bir yöntem sunmaktadır. Bir minijen kullanılarak HEK293 hücrelerinde pro- veya anti-tümöral fenotiplere yol açan transkript izoformlarının prevalansı ele alınmaktadır. Eklemenin yanlış düzenlenmesi veya ekleme yerlerinin farklı kullanımları, alternatif transkript üretimine yol açarak farklı kanser türlerine neden olabilir16. Tedavi sırasında ekleme modülatörlerinin veya inhibitörlerinin kullanılması, ekleme yeri seçimlerini belirleyebilir, bu nedenle pro- veya anti-tümöral olsun, üretilen alternatif izoformları tanımlayabilir. Paklitaksel ve sisplatin günümüzde kemoterapötik ajanlar olarak kullanılmaktadır. E1A minigeninin kullanımı ile bu ilaçların alternatif eklemedeki etkileri ele alınmaktadır. Minigenleri kullanan alternatif ekleme analizi, trans-etkili proteinlerin ve ekleme değişikliklerinin tedavi ve spesifik ilaçların kullanımı üzerindeki etkilerini izlemek için önemli bir stratejidir.

Bu doğrultuda, birçok intronik mikroRNA'nın (miRNA) tümöral fenotiplerle ilişkili olduğu bildirilmiştir 32,33. İntronik miRNA sentezi ve biyogenezinin kontrolü ve düzenlenmesi, ekleme reaksiyonlarının kontrolü ile ilişkilendirilebilir. miRNA'lar, hücrelerdeki mRNA'ların stabilitesini ve prevalansını modüle edebilir, RNA stabilitesini ve translasyon hızınıetkileyebilir 34. Gatti da Silva ve Coltri35, hücresel fenotiplerdeki değişikliklerle ve pro- veya anti-tümöral özelliklerin belirlenmesiyle doğrudan bağlantılı olabilen intronik miRNA biyogenezini ve olgunlaşmasını değerlendirmek için bir raportör sistemi tanımlar. Ekleme düzenleyici protein HuR'nin modülasyonu ile sistem, intronik onkojenik bir miRNA'nın biyogenezinin ve fonksiyonel aktivitesinin analizine izin verir.

Ön RNA eklemenin analizi ve belirli hücrelerde farklı RNA'ların olgunlaşması, genomik bilgiyi anlamak ve yorumlamak için gerekli olacaktır. Maya ve memeli spliceozomları korunur ve temel araştırmalar, terapötiklere ve biyotıbba uygulanan farklı yöntemlerin kullanımını geliştirebilir. Şu anda mevcut olan büyük miktarda genomik veriye rağmen, bu bilginin fenotiplerde ifadesi hücreye özgü olabilir ve RNA işleme ve eklemeye bağlı olabilir. Bu sürecin karmaşık düzenlemesini anlamak gelecekteki araştırmalar için önemli olacaktır.

Açıklamalar

Yazarın açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazar, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) hibe numarası 2019/21874-5 ve Universidade de São Paulo'ya sürekli araştırma desteği için teşekkür eder.

Kaynaklar

  1. Wahl, M. C., Will, C. L., Lührmann, R. The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell. 136 (4), 701-718 (2009).
  2. Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Reviews Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
  3. Singh, R. K., Cooper, T. A. Pre-mRNA splicing in disease and therapeutics. Trends in Molecular Medicine. 18 (8), 472-482 (2012).
  4. Staley, J. P., Guthrie, C. Mechanical devices of the spliceosome: Motors, clocks, springs, and things. Cell. 92 (3), 315-326 (1998).
  5. Wilkinson, M. E., Charenton, C., Nagai, K. RNA splicing by the spliceosome. Annual Review of Biochemistry. 89, 291(2020).
  6. Fu, X. D., Ares, M. Context-dependent control of alternative splicing by RNA-binding proteins. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 689-701 (2014).
  7. Zhang, X., et al. An atomic structure of the human spliceosome. Cell. 169 (5), 918-929 (2017).
  8. Will, C. L., Lührmann, R. Spliceosome structure and function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003703(2011).
  9. Jurica, M. S., Moore, M. J. Pre-mRNA splicing: Awash in a sea of proteins. Molecular Cell. 12 (1), 5-14 (2003).
  10. Coltri, P. P., dos Santos, M. G. P., da Silva, G. H. G. Splicing and cancer: Challenges and opportunities. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 10 (3), 1527(2019).
  11. Havens, M. A., Duelli, D. M., Hastings, M. L. Targeting RNA splicing for disease therapy. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 4 (3), 247-266 (2013).
  12. Pandit, S., et al. Genome-wide analysis reveals SR protein cooperation and competition in regulated splicing. Molecular Cell. 50 (2), 223-235 (2013).
  13. Wang, Y., et al. A complex network of factors with overlapping affinities represses splicing through intronic elements. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 36-45 (2013).
  14. Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: A pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
  15. Lee, Y., Rio, D. C. Mechanisms and regulation of alternative pre-mRNA splicing. Annual Review of Biochemistry. 84, 291(2015).
  16. Dvinge, H., Kim, E., Abdel-Wahab, O., Bradley, R. K. RNA splicing factors as oncoproteins and tumour suppressors. Nature Reviews Cancer. 16 (7), 413-430 (2016).
  17. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17 (8), 4730-4737 (1997).
  18. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (4), 1213-1217 (1995).
  19. Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of splicing activity by a galectin-3-u1 snrnp complex on beads. Journal of Visualized Experiments. (166), e61990(2020).
  20. Shao, W., Kim, H. -S., Cao, Y., Xu, Y. -Z., Query, C. C. A U1-U2 snRNP interaction network during intron definition. Molecular and Cellular Biology. 32 (2), 470-478 (2012).
  21. Michaels, W. E., Pena-Rasgado, C., Kotaria, R., Bridges, R. J., Hastings, M. L. Open reading frame correction using splice-switching antisense oligonucleotides for the treatment of cystic fibrosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (3), 2114886119(2022).
  22. Wong, J., Martelly, W., Sharma, S. A reporter based cellular assay for monitoring splicing efficiency. Journal of Visualized Experiments. (175), e63014(2021).
  23. Hamid, F. M., Makeyev, E. v A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
  24. vander Feltz, C. ACT1-CUP1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (184), e63232(2022).
  25. Plaschka, C., Newman, A. J., Nagai, K. Structural basis of nuclear pre-mRNA splicing: Lessons from Yeast. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 11 (5), 032391(2019).
  26. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: methods, mechanisms, and machinery. Methods in Enzymology. 351, 200-220 (2002).
  27. Lesser, C. F., Guthrie, C. Mutational analysis of pre-mRNA splicing in Saccharomyces cerevisiae using a sensitive new reporter gene, CUP1. Genetics. 133 (4), 851-863 (1993).
  28. Carvalho, F. A., Barros, M. R. A., Girotto, T. P. F., Perona, M. G., Oliveira, C. C. Utilization of grafix for the detection of transient interactors of saccharomyces cerevisiae spliceosome subcomplexes. Journal of Visualized Experiments. (165), e61994(2020).
  29. Effenberger, K. A., Urabe, V. K., Jurica, M. S. Modulating splicing with small molecular inhibitors of the spliceosome. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 8 (2), 1381(2017).
  30. Corrionero, A., Miñana, B., Valcárcel, J. Reduced fidelity of branch point recognition and alternative splicing induced by the anti-tumor drug spliceostatin A. Genes and Development. 25 (5), 445-459 (2011).
  31. Basei, F. L., Moura, L. A. R., Kobarg, J. Using the e1a minigene tool to study mrna splicing changes. Journal of Visualized Experiments. (170), e62181(2021).
  32. Volinia, S., et al. A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (7), 2257-2261 (2006).
  33. Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
  34. Bartel, D. P. Metazoan microRNAs. Cell. 173 (1), 20-51 (2018).
  35. Gatti da Silva, G. H., Coltri, P. P. A reporter assay to analyze intronic microRNA maturation in mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (184), e63498(2022).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Splicing ActivityGalectin-3U1 SnRNP ComplexSplicing EfficiencySpliceosomal MutantsBudding YeastTransient InteractorsSaccharomyces CerevisiaeE1a Minigene ToolIntronic MicroRNA Maturation
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.