Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64633

⸱

17 Şubat 2023

 ,  ,  , 
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.

Özet

Neredeyse tüm insan organları, üç boyutlu (3B) yapılar halinde organize edilmiş, sıkıca bağlanmış hücrelerin bir veya daha fazla katmanından oluşan epitel dokularıyla kaplıdır. Epitelin temel işlevlerinden biri, altı çizili dokuları fiziksel ve kimyasal hakaretlere ve enfeksiyöz ajanlara karşı koruyan bariyerlerin oluşmasıdır. Ek olarak, epitel, besinlerin, hormonların ve diğer sinyal moleküllerinin taşınmasına aracılık eder ve genellikle organ içindeki hücre konumlandırmasını ve bölümlenmesini yönlendiren biyokimyasal gradyanlar oluşturur. Organ yapısını ve fonksiyonunu belirlemedeki merkezi rolleri nedeniyle, epitel, her zaman hayvan modelleri tarafından yakalanmayan birçok insan hastalığı için önemli terapötik hedeflerdir. Türler arası bariz farklılıkların yanı sıra, hayvanlarda epitelin bariyer fonksiyonu ve taşıma özellikleri üzerine araştırma çalışmaları yapmak, canlı bir sistemde bu dokulara erişmenin zorluğu ile daha da artmaktadır. İki boyutlu (2B) insan hücre kültürleri temel bilimsel soruları cevaplamak için yararlı olsa da, genellikle zayıf in vivo tahminler verirler. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yılda, çip üzerinde organlar olarak bilinen çok sayıda mikro mühendislik biyomimetik platform, geleneksel in vitro ve hayvan testlerine umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Burada, deri, akciğerler ve bağırsaklar dahil olmak üzere organa özgü epitel dokularını modellemek için tasarlanmış bir platform olan Open-Top Organ Chip'i (veya Open-Top Chip) açıklıyoruz. Bu çip, dokuya özgü fibroblastları ve endotel hücrelerini mekanik olarak aktif bir sisteme dahil ederek bir 3D stromal bileşeni yeniden oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere, epitel dokularının çok hücreli mimarisini ve işlevini yeniden oluşturmak için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu Open-Top Chip, epitelyal/mezenkimal ve vasküler etkileşimleri tek hücrelerden çok katmanlı doku yapılarına kadar çoklu çözünürlük ölçeklerinde incelemek için benzeri görülmemiş bir araç sağlar, böylece epitelize organların hücreler arası çapraz konuşmasının sağlık ve hastalıkta moleküler diseksiyonuna izin verir.

Giriş

Tarihsel olarak, bilim adamları ilaç keşfi için klinik öncesi hayvan testlerine güvenmişlerdir, ancak insan sonuçlarıyla zayıf korelasyon nedeniyle bu yöntemlerin giderek artan bir kısmı sorgulanmıştır1. Hayvan deneylerini Değiştirmek, Azaltmak ve İyileştirmek için "3R" ilkelerinin uygulanması, bilim insanlarını klinik öncesi ilaç ve kimyasal toksikoloji risk değerlendirmesini desteklemek için yeni in vitro alternatif yöntemler bulmaya çağırmaktadır2. Bununla birlikte, bugüne kadar geliştirilen birçok in vitro model, insan canlı organlarının dinamik doğasını özetlemek için gerekli biyolojik mimariden, hücresel karmaşıklıktan ve mekanik ortamdan yoksundur 3,4.

Geleneksel in vitro preklinik sistemler tipik olarak sert bir plastik yüzey üzerinde yetiştirilen insan hücrelerinin 2D monokültürlerini kullanır. Bu yöntemler, basit mekanik çalışmaların yürütülmesi için bir araç sağlar ve ilaç adaylarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Nispeten düşük maliyetleri ve yüksek sağlamlıkları nedeniyle, 2D modeller genellikle otomatik yüksek verimli sistemlerle eşleştirilir ve ilaç geliştirme sürecinin erken aşamasında potansiyel ilaç adaylarının hızlı bir şekilde tanımlanması için kullanılır 5,6. Bununla birlikte, bu tür 2D modeller, gelişimlerinin klinik öncesi aşamasında ilaç güvenliği ve etkinliğinin doğru tahminleri için gerekli olan terapötik adaylara doku seviyesi, organ düzeyinde veya sistemik yanıtları modellemek için translasyonel bir yaklaşım sağlamaz. Düz hücre kültürleri, karmaşık çok hücreli etkileşim, biyomekanik özellikler ve insan dokularının üç boyutlu (3B) mimarisi dahil olmak üzere doğal doku mikro ortamını özetlemez7. Düz bir yüzeyde büyüyen hücreler genellikle olgun bir fenotip kazanmazlar ve bu nedenle doğal dokuda olduğu gibi farmakolojik uyaranlara cevap veremezler. Örneğin, in vitro olarak yetiştirilen birincil insan alveoler epitel hücreleri skuamöz bir fenotip sergiler ve sürfaktan proteinleri C ve B (SP-C ve SP-B)8 dahil olmak üzere anahtar fenotipik belirteçleri kaybeder. Yetersiz farklılaşmaya ek olarak, birincil hücreler sıklıkla in vitro biyolojik stresörlere karşı duyarsız hale gelir, çünkü doku iltihabı ile ilişkili bazı biyokimyasal yollar fonksiyonel olmayan hale gelir9. Bu tür hücre fonksiyon kaybı, öncelikle sert substratların yanı sıra akciğer fibroblastları ve düz kas hücreleri gibi dokuya özgü stromal hücreler tarafından doğal olarak salınan çözünür faktörlerin eksikliği ile ilişkili görünmektedir10,11.

Kemo-fiziksel ve biyolojik karmaşıklık eksikliğinin in vitro hücrelerin fizyolojik davranışını sınırladığını anlamak, vücut dışındaki insan dokularının karmaşıklığını daha iyi yakaladığı kanıtlanmış daha sofistike çok hücreli modellerin geliştirilmesini teşvik etmiştir12,13. 1970'lerin başında ilk ko-kültür modellerinin oluşturulmasından buyana14, sentetik ve doğal hidrojellerin piyasaya sürülmesi, doğal doku mikro ortamlarını taklit etme yeteneğini önemli ölçüde geliştirmiş ve hücresel farklılaşmayı yönlendirmek, hücrelerin doku benzeri yapılara kendi kendini organize etmesine rehberlik etmek ve doğal doku fonksiyonlarının restorasyonu için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir15,16. Örneğin, uygun 3D iskelede yetiştirildiğinde, insan hücreleri sferoidler veya organoidler gibi fonksiyonel yapılara kendi kendine düzenleyebilir, kök hücre belirteçlerini eksprese edebilir ve kendini yenileyebilir17. Buna karşılık, insan hücreleri (kök hücreler dahil), geleneksel 2D substratlar üzerinde yetiştirildiğinde, birkaç pasajdan sonra hızla yaşlanır ve yaşlanmaya uğrar18. Ek olarak, hidrojeller gözeneklilik, gözenek boyutu, lif kalınlığı, viskoelastisite, topografya ve sertlik gibi spesifik doku özelliklerine uyacak şekilde "uyarlanabilir" veya fizyolojik veya patolojik koşulların öykünmesini sağlayan doku kaynaklı hücresel bileşenler ve / veya biyoaktif moleküller ile daha fazla mühendislik yapılabilir19,20. İlaç testi için muazzam potansiyellerine rağmen, farmasötik araştırmalarda kullanılan 3D hidrojel bazlı modeller, in vivo dokuların karmaşık sitomimarisini tam olarak özetlememektedir ve hidrostatik basınç, siklik gerilme ve sıvı makası21 dahil olmak üzere normalde insan vücudunda bulunan önemli hemodinamik ve mekanik uyaranlardan yoksundur.

Çip üzerinde organlar (OOC'ler) gibi mikrofizyolojik sistemler (MPS'ler) son zamanlarda in vitro22,23 karmaşık fizyolojik yanıtları yakalayabilen araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu modeller genellikle canlı organların dinamik mikro ortamının modellenmesini sağlayan mikroakışkan platformların kullanımını kullanır.

Karmaşık insan epitel dokusunun Open-Top Chip modelini oluşturmak için 3D doku biyomühendisliği ve mekanobiyoloji ilkelerini birleştirdik. Bu, epitel dokularının çok hücreli ve dinamik mikro ortamını yakından özetlememize izin verdi. Bu, canlı organlarda doğal olarak bulunan, ancak geleneksel in vitro modeller tarafından sıklıkla ihmal edilen dokuya özgü biyokimyasal ve biyomekanik ipuçlarını içerir24. Üstü Açık Çip iki bölmeden oluşur: bir vasküler bölme (Şekil 1A) ve gözenekli bir zarla ayrılmış bir stromal bölme (Şekil 1B), iki oda arasında besin maddelerinin difüzyonuna izin verir (Şekil 1C). Vasküler bölme, fizyolojik kayma stresini özetlemek için sürekli sıvı akışına maruz kalırken, stromal odanın gerilebilir tasarımı, solunum hareketleri veya bağırsak peristalsisi ile ilişkili mekanik gerilmenin modellenmesine izin verir. Stromal bölme, dokuya özgü fibroblastların fizyolojik büyümesini desteklemek için tasarlanmış ayarlanabilir 3D hidrojel iskelesini barındırır. Bir hava-sıvı arayüzünün kurulmasını kolaylaştıran çıkarılabilir bir kapağa sahiptir, bu durum mukozal dokuların insan fizyolojisinin daha fazla öykünmesine ve ayrıca ilaçların doğrudan epitel tabakasına uygulanması için dokuya doğrudan erişime izin veren bir durumdur. Ek Şekil 1, Boyutlar ve biyolojik bölmeler (Ek Şekil 1A-D) dahil olmak üzere Üstü Açık Çip tasarımının bazı önemli bileşenlerini ve bu protokolde açıklanan ana teknik adımları (Ek Şekil 1E) yakalar.

Üstü Açık Çipin perfüzyonu, programlanabilir bir peristaltik pompa ile sağlanır (Şekil 1D). Peristaltik pompa kurulumu, 12 Üstü Açık Talaş'ın aynı anda perfüze edilmesini sağlar. Çoğu inkübatör, inkübatör başına 24 talaşa kadar kültür sağlayan iki kuruluma ev sahipliği yapabilir. Mekanik germe, özel yapım programlanabilir bir vakum basınç regülatörü kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1E). Dijital-analog dönüştürücü tarafından elektronik olarak kontrol edilen bir elektro-pnömatik vakum regülatöründen oluşur. Başka bir deyişle, elektro-pnömatik vakum regülatörü, kullanıcı tarafından belirlenen bir genlik ve frekansa sahip bir sinüzoidal vakum profili oluşturur. %0 ila %15 arasında değişen döngüsel gerinim, Üstü Açık Çipin vakum kanalına 0 ila -90 kPa arasında değişen bir genlikte ve 0,2 Hz frekansında negatif basınç uygulanarak üretilir. Daha önce kabul edilen ve diğer makalelerde açıklanan ticari olarak temin edilebilen Flexcell Gerinim Ünitesine eşdeğer ısmarlama bir sistemdir25. Örneğin, akciğerin solunum hareketi veya bağırsağın peristalsisi ile ilişkili mekanik doku deformasyonunu taklit etmek için, pnömatik aktüatör, büyüklüğü ve genliği, insan hücrelerinin doğal dokularında yaşadıkları fizyolojik gerinim ve frekans seviyesine uyacak şekilde ayarlanabilen sinüzoidal vakum / gerinim dalgaları uygular.

Burada, prototip Open-Top Chip platformunda organotipik epitel eşdeğerlerinin mühendisliği ve kültürü için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz. Deri, alveolus, hava yolu ve kolon gibi karmaşık organ modellerinin oluşturulmasına izin verirken, vasküler sıvı akışını ve mekanik germeyi entegre eder. Karmaşık epitel modelleri oluşturmak için doku mühendisliği ilkelerini uygularken göz önünde bulundurulması gereken temel teknik hususları özetleyeceğiz. Mevcut tasarımın avantajlarını ve olası sınırlamalarını tartışacağız.

Akış ve gerilme parametreleri de dahil olmak üzere doku ve organ olgunlaşmasını sağlamak için kullanılan ana adımlara genel bir bakış aşağıda bildirilmiştir: Cilt için Şekil 2, alveolus için Şekil 3, hava yolu için Şekil 4 ve bağırsak için Şekil 5. Farklı organ modellerinin kültürlenmesinde kullanılan ortam bileşimi ve reaktifler ile ilgili ek bilgiler ek tablolarda yer almaktadır (Cilt için Ek Tablo 1; Alveolus için Ek Tablo 2; Hava yolu için Ek Tablo 3 ve bağırsak için Ek Tablo 4).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan kolonoidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC 2017-2011) yönergelerine uygun olarak bağırsak rezeksiyonlarından elde edildi.

1. Yüzey aktivasyonu

  1. Aktivasyon tamponunun hazırlanması
    1. Çapraz bağlayıcı ve çözücü tampon reaktiflerini biyogüvenlik kabininin (BSC) altına yerleştirin ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) dengelenmelerini sağlayın.
    2. Crosslinker çözeltisini doğrudan ışığa maruz kalmaktan korumak için steril ışık geçirimsiz bir kap veya alüminyum folyoya sarılmış şeffaf bir 15 mL konik tüp kullanarak çözücü tamponunun 5 mL'sinde 5 mg çapraz bağlayıcıyı yeniden oluşturun.
    3. Tüm kümeleri çıkarmak için çözeltiyi 1 dakika boyunca vorteksleyin ve ardından çapraz bağlayıcı çözeltisinin 50 μL'sini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'sini üstü açık odaya pipetin.
    4. Bir aspiratör kullanarak çipin yüzeyindeki fazla çapraz bağlama solüsyonunu temizleyin. Ardından, kalan hava kabarcığını çıkarmak için 50 μL çapraz bağlama çözeltisini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'lik çapraz bağlama çözeltisini açık bölmeye pipetin.
  2. UV çapraz bağlama makinesi ile aktivasyon
    1. Kapağı BSC'nin altındaki çipten yavaşça çıkarın ve steril bir kapta saklayın.
    2. Çapraz bağlayıcı çözeltisini içeren talaşları bir Petri kabına aktarın, kontaminasyonu önlemek için Petri kabını kapatın ve kabı talaşlarla birlikte UV çapraz bağlama makinesinin altına yerleştirin.
      NOT: UV ışınlarına maruz kalmayı en üst düzeye çıkarmak için Petri kabının kapağını çıkarın.
    3. UV çapraz bağlama makinesini 100 μJ/cm2 yoğunlukta 365 nm tepe dalga boyuna ayarlayın ve UV ışığını 20 dakika boyunca açın.
      NOT: 20 dakikalık UV işleminden sonra, çapraz bağlayıcı çözeltisi daha koyu (kahverengi) görünecektir.
    4. Talaşları BSC'nin altına geri getirin ve oksitlenmiş çapraz bağlayıcı çözeltisini aspire edin. Daha sonra, tüm talaşları çözücü tamponla üç kez durulayın ve polidimetilsiloksan (PDMS) yüzeyinin kimyasal işlevini tamamlamak için talaşların BSC altında 5-10 dakika kurumasını bekleyin.

2. Stroma eşdeğerinin hazırlanması

  1. 10x rekonstrüksiyon tamponunun hazırlanması (100 mL)
    1. 2.2 g sodyum bikarbonat, çift damıtılmış suda 75 mL 0.067 M NaOH içinde çözülür.
    2. 4.76 g HEPES ekleyin ve çift damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye getirin.
    3. BSC altındaki çözeltiyi 0,22 μm membranlı tek kullanımlık steril bir şişe üstü filtre kullanarak steril filtreleyin.
      NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında yaklaşık 6 ay boyunca stabildir.
  2. Ön jel çözelti hacminin tahmini
    1. Deney için gereken ön jel çözeltisinin miktarını tahmin etmek için deney için gereken talaş sayısını 150 μL (merkezi üstü açık odanın iç hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 150) μL
    2. Kollajen ön jel çözeltisini buz üzerinde karıştırarak hazırlayın: Tercih edilen hücreleri içeren 1 hacim 10x EMEM, 1 hacim 10x rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1), 8 hacim kollajen I çözeltisi (10 mg / mL) ve her bir mg kollajen I için 1 μL 1 N NaOH çözeltisi.
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan +%15 hacim hazırlanması önerilir; Bölüm 2.2'de açıklanan örnek, 12 talaş ve ekstra% 15'lik bir hacim için yeterli ön jel çözeltisi hazırlamak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar.
  3. Stroma eşdeğeri için ön jel çözeltisinin hazırlanması (12 cips için)
    1. Buz üzerinde BSC altında aşağıdaki çözümleri getirin: 10x EMEM; 10x Rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1); Kollajen I çözeltisi (10 mg / mL); ve Steril 1 N NaOH çözeltisi.
    2. Kültür dokusuna özgü mezenkimal hücreler, sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşir ve daha sonra hücre sağlayıcı tarafından önerilen tripsin veya diğer yöntemleri kullanarak hücreleri ayrıştırır. Hücreleri 24 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme yoluyla bir pelet içinde toplayın.
    3. Hücre peletini 225 μL buz gibi soğuk 10x EMEM'de yeniden askıya alın ve 225 μL buz gibi soğuk 10x rekonstrüksiyon tamponu ekleyin (bkz. adım 2.1). Çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından 1.800 μL buz gibi soğuk kollajen I çözeltisi ekleyin.
    4. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipet yapın, buzdayken ön jel çözeltisini karıştırmak için kabarcıklardan kaçının.
  4. Stroma eşdeğerinin çip üzerine dahil edilmesi (12 çip için)
    1. Ön jel çözeltisini 18 μL 1 N NaOH ile nötralize edin. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından 150 μL hücre yüklü hidrojeli Üstü Açık Çipin merkezi odasına pipetleyerek kabarcıkları önleyin.
      NOT: Mikro modelleme gerekiyorsa, lütfen bir sonraki adıma geçin (bölüm 3).
    2. Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj tüpü kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve inkübatördeki Petri kaplarını 37 ° C,% 5 CO2'deinkübe edin.
      NOT: 90 dakika sonra, hücre yüklü hidrojel tamamen polimerize olacaktır.

3. Yüzey mikro desenleme (isteğe bağlı)

  1. 3D baskılı pullar kullanarak nötralize edilmiş kollajen hidrojelini (hala sıvı halinde) pipetledikten sonra stromal hidrojelin yüzey mikrodesenlemesini gerçekleştirin.
    NOT: 3D baskılı pullar, daha önce24'te açıklandığı gibi çeşitli özelleştirilebilir tasarımlarda elde edilebilir.
  2. Nötralize edilmiş kollajen I ön jel çözeltisinin 20 μL'lik pipeti, steril 3D baskılı bir damganın desenli yüzeyine yerleştirin ve stromal hidrojel hala sıvı formdayken damgayı üstü açık odanın içine (üste) yerleştirin.
  3. Bir aspiratör (veya pipet) kullanarak üstü açık odanın üstünden dökülebilecek hidrojel kalıntılarını temizleyin. Tüm cipsleri ayrı Petri kaplarında gruplandırın ve her Petri kabına 2 mL steril ddH2O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı ekleyin.
  4. Tüm Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO2'de 90 dakika boyunca inkübe edin ve ardından talaşları BSC'nin altına geri getirin ve hidrojele zarar verme riskini azaltmak için hassas cımbız kullanarak damgaları yavaşça çıkarın.

4. Epitel ve vasküler yüzeyin dokuya özgü ECM proteinleri ile kaplanması

  1. Vasküler mikroakışkan odanın hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
    1. Deney için gereken vasküler ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 20 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 20) μL
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir.
    2. Buz gibi soğuk PBS veya HBSS kullanarak tüm talaşlar için vasküler ECM kaplama solüsyonunu (örneğin, 12 talaş başına 300 μL) hazırlayın.
      NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için.
    3. Pipet, her bir çipin vasküler kanalına 20 μL vasküler ECM kaplama çözeltisi ekleyin.
  2. Stromal eşdeğerin apikal yüzeyinin hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
    1. Deney için gereken epitelyal ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 50 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 50) μL
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir.
    2. Buz gibi soğuk PBS veya HBSS'de tüm talaşlar için yeterli ECM kaplama çözeltisi hazırlayın (örneğin, 12 talaş başına 750 μL) ve 50 μL epitelyal ECM kaplama çözeltisini doğrudan hidrojel yüzeyinin üzerine aktarın.
      NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için.
    3. Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve epitel hücre tohumlamasına devam etmeden önce inkübatörde Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO2'de2 saat boyunca inkübe edin.

5. Epitel hücrelerinin stromal eşdeğeri üzerine tohumlanması

  1. Epitel hücre kültürü
    1. Kültür dokusuna özgü epitel hücreleri %80-90 oranında birleşene kadar sağlayıcılar tarafından yönlendirilir.
    2. Hücre sağlayıcısı tarafından önerilen proteolitik enzim prosedürlerini kullanarak hücreleri ayırın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, epitel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P1-P2) hasat edin.
    3. Ayrıştıktan sonra, hücreleri santrifüj edin ve bir pelet olarak toplayın.
    4. Epitel hücrelerini, spesifik organ protokolü tablosunda belirtildiği gibi uygun hücre / fragman yoğunluğuna yeniden askıya alın.
      NOT: Bu çalışmada cilt için 3 x 10 6 hücre/mL, alveolus için 1 x 10 6 hücre/mL, hava yolu için 6 x 10 6 hücre/mL ve bağırsak için 8 x 10 6 hücre/mL yoğunlukta hücre solüsyonu kullanılmıştır.
  2. Epitel hücre tohumlaması
    1. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın. Kaplama çözeltisini vasküler kanaldan aspire edin ve vasküler mikroakışkan kanalı 50 μL taze endotel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
    2. Kaplama çözeltisini hidrojel yüzeyinden aspire edin ve fazla kaplama çözeltisini gidermek için stromal yüzeyi 100 μL taze epitel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
    3. Yükselen ortamı aspire edin ve hidrojel yüzeyini, ek tablolarda belirtildiği gibi uygun hücre yoğunluğunu kullanarak 50 μL epitel hücre süspansiyonu ile tohumlayın ve daha sonra cipsleri 2 saat boyunca inkübatöre geri aktarın (veya kolonoidler için bir gecede).
    4. Hücresel kalıntıları gidermek için hidrojel yüzeyini hücre kültürü ortamıyla iki kez nazikçe durulayın. Son olarak, kapalı otoklavlanabilir kaplarda otoklavlama yaparak ortamı yenileyin ve talaşları peristaltik pompaya bağlayın.

6. Çipleri akışa bağlama

  1. Akışkan parçaların hazırlanması
    1. Çipleri ortam rezervuarlarına bağlamak için gereken kısa mikroakışkan boruyu hazırlamak için 2 inç biyouyumlu polipropilen bazlı termoplastik elastomer (TPE) transfer borusunu (Malzeme Tablosu) kesin.
    2. Uzun mikroakışkan boruyu üretmek için 7,5 inç biyouyumlu TPE transfer borusunu kesin.
    3. Yeterince 18 G ve 19 G metal konektör hazırlayın (Malzeme Tablosu).
      NOT: Üstü Açık Talaşları peristaltik pompalara bağlamadan en az 1 gün önce 6.1.1 ve 6.1.2 adımlarında açıklanan boru ve konektörlerin hazırlanması ve sterilize edilmesi önerilir.
    4. Her orta rezervuarın kapağını 4 inçlik bir hipodermik iğne ile delin (Malzeme Tablosu).
  2. Orta gaz giderme
    1. Hücre kültürü ortamının oda sıcaklığına (RT) dengelenmesine izin verin.
    2. İhtiyaç duyulan ortamın hacmini konik bir filtreleme tüpüne aktarın.
    3. Ortamın gazını gidermek için -20 PSI negatif vakum basıncı uygulayın (vakum tahrikli filtrasyon).
      NOT: Bir vakum mevcut değilse, benzer sonuçlar elde etmek için hücre kültürü ortamı gece boyunca inkübatörde dengelenmeye bırakılabilir.
  3. Üstü Açık Çipi sıvı akışı için hazırlama
    1. Talaşları ve steril akışkan parçaları BSC'nin altına getirin ve sıvı akışını başlatmadan önce Open-Top Chip prototipini sızdırmaz hale getirmek için Open-Top Chip'in kapağını (üst kısmı) hizalayın.
    2. Gazdan arındırılmış hücre kültürü ortamının 200 μL'lik pipetini (organa özgü tablolara bakın) çipin hem üst hem de alt kanallarının giriş portuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin.
    3. Tüplerin iç yüzeyini astarlamak ve kısa boruyu çipin üst ve alt kanallarının girişlerine bağlamak için kısa mikroakışkan boruya 300 μL kültür ortamının pipetini ekleyin.
  4. Mikroakışkan yüzeyleri bağlayın ve astarlayın
    1. Orta rezervuarları çiftlik rafına yerleştirin, hipodermik iğneyi talaşların alt girişine bağlayın ve son olarak, inkübatörün içindeki muhafaza taşıyıcılarındaki tüm talaşları yerleştirin.
    2. Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve ardından tüm yongaların düzgün bir şekilde bağlandığından ve hücre kültürü ortamının gözle görülür bir sızıntısı olmadığından emin olmak için tüm konektörleri inceleyin.
    3. Pompa üzerindeki Temizleme düğmesini kullanın ve yaklaşık 15 saniye boyunca veya hücre kültürü ortamının damlacıkları çıkış borusunun sonunda görünene kadar basılı tutun.
    4. Uygun organ-çip akış hızını ayarlamak için pompa üzerindeki kontrol sistemini kullanın (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).

7. Talaşların bakımı

  1. Organ-çip bakımı
    1. Epitel ve / veya endotel için taze hücre kültürü ortamı hazırlayın ve gaz giderme adımlarını uygulayın (daha önce adım 6.2'de açıklandığı gibi).
    2. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın ve rezervuarlara bırakılan ortam hacmini çıkarın.
    3. Hücre kültürü ortamını üst ve alt giriş haznelerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve talaş muhafazası taşıyıcılarını inkübatöre geri yerleştirin. Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve akışı yeniden başlatın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
    4. 7.1.1-7.1.3 adımlarını Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5'e göre iki günde bir yineleyin.
  2. Hava-sıvı arayüzünün (ALI) kurulması
    1. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Çipleri inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın ve kalan ortamın hacmini üst hazneye çıkarın.
    2. Üst mikroakışkan kanaldan tüm ortamı nazikçe aspire edin ve ortam buharlaşmasını ve ALI'nin bakımını azaltmak için bağlayıcı klipsler kullanarak üst girişlere bağlı kısa mikroakışkan boruyu sıkıştırın.
    3. Üstü Açık Çipi gövde taşıyıcı(lar)ına tekrar inkübatöre yerleştirin ve talaşları peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
    4. Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.
  3. Germe (İsteğe bağlı)
    1. Peristaltik pompayı duraklatın ve çip başına iki uzun mikroakışkan tüp kullanarak çiplerin vakum portlarını vakum modülüne bağlayın.
    2. Esneme ayarını, organ protokolü tablolarında belirtildiği gibi her organ için önerilen duruma ayarlamak için vakum modülünü kullanın: Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ; ve bağırsak için Ek Tablo 4 .
    3. Tüm talaşların düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için boru bağlantılarını görsel olarak inceleyin.
    4. Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.

8. Vasküler kompartmanda endotel hücrelerinin tohumlanması

  1. Hücreleri ve cipsleri vasküler hücre tohumlaması için hazırlayın
    1. Kültür, dokuya özgü endotel hücrelerini sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşene kadar birleştirir. Proteolitik bir enzim prosedürü kullanarak hücreleri ayırın (sağlayıcı tarafından önerildiği gibi) ve son olarak, endotel hücrelerini 3 x 106 hücre / mL'lik bir çözelti içinde yeniden askıya alın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, endotel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P2-P4) toplayın.
    2. Peristaltik pompayı duraklatın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın, talaşları ortam rezervuarlarından ve bağlı borulardan ayırın ve ardından talaşları ayrı Petri kaplarında gruplandırın.
    3. Epitel bölmesinin hücre kültürü ortamını taze epitel hücre kültürü ortamı ile yenileyin. Vasküler kanalı taze endotel hücre kültürü ortamı ile iki kez durulayın ve ardından ortamı vasküler bölmeden aspire edin.
  2. Endotel hücre tohumlaması
    1. Alt (vasküler) kanalı 25 μL endotel hücre süspansiyonu (3 x 106 hücre / mL) ile tohumlayın, endotel hücrelerinin mikroakışkan odanın üst yüzeyine yapışmasını sağlamak için çipleri baş aşağı çevirin.
      NOT: Çip başına 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin (12 yonga başına 600 μL).
    2. Cipsleri Petri kapları halinde gruplandırın. Onları 37 ° C,% 5 CO2'de inkübatöre geri yerleştirin ve endotel hücrelerinin 1 saat boyunca bağlanmasına izin verin.
    3. 1 saat sonra, cipsleri inkübatörden BSC'ye aktarın. Hücresel kalıntıları gidermek için vasküler kanalı endotel hücre kültürü ortamıyla iki kez durulayın.
    4. Vasküler kanalı endotel hücreleriyle bir kez daha tohumlamak için 8.2.1-8.2.2 adımlarını tekrarlayın ve endotel hücrelerinin vasküler kanalın alt yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için çipleri düz bir şekilde yerleştirin.
  3. Çipi akışa yeniden bağlayın
    1. Vasküler ortam rezervuarını, BSC altında gazdan arındırılmış vasküler hücre kültürü ortamı ile doldurun.
    2. Talaşları tekrar talaş gövdesi taşıyıcılarının içine yerleştirin ve talaşları bir ucundaki orta haznelere, diğer ucundaki peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
    3. Tüm çiplerin düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için mikroakışkan bağlantıları görsel olarak inceleyin. Ardından, peristaltik pompayı başlatarak sıvı akışını sürdürün.

9. Ortak bitiş noktası testleri

  1. Uç nokta testleri için yongaların bağlantısını kesin
    1. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaş gövdesi taşıyıcılarını inkübatörden BSC'ye aktarın ve talaşları serbest bırakın.
    2. Herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için Open-Top Chip'in merkezi odasını epitel hücre kültürü ortamı ve vasküler kanalı endotel kültürü ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın.
    3. Cımbız kullanarak çipin apikal bölmesine erişmek için Üstü Açık Çipin kapağını çıkarın.
  2. Floresan mikroskopi için immün boyama
    1. Geleneksel numune fiksasyonu, geçirgenleştirme ve bloke etme ile devam edin.
      NOT: Bu çalışmada, örnekler 1 saat boyunca 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi, ardından PBS ile durulandı, 40 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100'de geçirgenlik ve 1 saat boyunca% 1 sığır serum albümininde bloke edildi.
    2. Cipsleri bir gecede 4 ° C'de birincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin. ve daha sonra cipslerin hem epitel hem de endotel bölmelerini iki kez 200 μL PBS ile yıkayın. Ardından, 2 saat boyunca uygun ikincil antikorlarla devam edin.
      NOT: PBS +% 1 BSA'daki birincil antikorları ve ikincil antikorları 1:100 (birincil antikor) ve 1:200 (ikincil antikor) seyreltmede seyreltin.
  3. İmmünohistokimya
    1. Stromal eşdeğerlerini cımbız kullanarak Open-Top Chip'in ana odasından çıkarın,% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın ve en az 24 saat boyunca inkübe edin.
    2. Sabit stromal eşdeğerini doku işlemcisine aktarın ve optimum numune dehidrasyonu elde etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
      1. Hidrojeli 90 dakika boyunca% 70 etanol içine batırın.
      2. % 70 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 80 etanol içine batırın.
      3. % 80 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 95 etanol içine batırın.
      4. % 95 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 90 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın.
      5. % 100 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 120 dakika boyunca bir ksilen çözeltisine batırın.
      6. Ksilen çözeltisini çıkarın ve işlenmiş stromal eşdeğerlerini parafin mumunda iki kez 120 dakika (~ 2 saat) boyunca infiltre edin.
    3. Sızmış stromal eşdeğerleri parafin bloklarına yerleştirin.
    4. Bu noktada, stromal eşdeğerleri bir mikrotom kullanılarak parafin blokları olarak bölümlenebilir ve geleneksel histolojik tekniklere göre işlenebilir26.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yüzey mikro desenleme
Hücre dışı matrisin (ECM) mikro modellemesi, bağırsak kript arayüzünün uzamsal konfigürasyonunu çoğaltmak için kullanılabilir. Open-Top Chip konfigürasyonu, kolonik epitel-stroma arayüzünün doğal topografyasını (Şekil 6A, B) ve bağırsak kriptolarını mikrometre ölçeğinde (Şekil 6C-E) taklit etmek için özel olarak tasarlanmış mikro desenli pulları entegre edecek şekilde de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Open-Top Chip, kontrollü bir mikro ortamda endotel, stroma ve epitel arasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimi gerçek zamanlı olarak araştırmak için uygun bir platformu temsil eder. Bu teknoloji, akışkan kayma (akış), siklik germe ve mikrodesenleme yoluyla elde edilen epitel yüzey topografyasının yeniden yapılandırılması dahil olmak üzere insan dokusu mikroçevresini yeniden oluşturmakla ilgili fiziksel ve biyokimyasal ipuçlarının entegrasyonu gibi geleneksel organotipik ve organoid kültürlere göre krit...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, potansiyel rakip çıkarlar olarak kabul edilebilecek aşağıdaki finansal çıkarları / kişisel ilişkileri beyan ederler: Varone Antonio, Emulate Inc.'in eski bir çalışanıdır ve Emulate'de hisse senedi payına sahip olabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x EMEM Lonza12-684FOrta; Stroma
18 Ayar iğnesiMicroGroup316H18RWBoru paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 18RW Tam Sert 
19 Ölçer iğneMicroGroup316H19RWTüp paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 19RW Tam Sert
2 Duraklı PharMed BPT Cole-Palmer EW-95723-12Tüp, 0,25 mm, 12/paket
%70 etanol ve mendil  -  - Yüzey sterilizasyonu için 
8-Bromoadenosin 3&asal;,5′-siklik monofosfat sodyum tuzu (8-Br-cAMP)SigmaB7880Orta takviye 
A-83-01 Tokris 2939
AdeninSigmaA9795
İleri DMEM/F12 Termo12634010
Havayolu Epitel HücreleriYaşam Hattı Hücre TeknolojisiFC-0016
Alüminyum folyo  -  -  -
Alveolar hücrelerHücre BiyolojikleriH6621
Anti-ABCA3   ABCAM AB24751 Fare monoklonal antikoru [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225   Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747]   
Anti-Aquaporin5 ABCAM ab92320 Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747] 
Anti-beta IV Tübülin   ABCAM AB11315 Fare monoklonal antikoru [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Fare monoklonal [JC / 70A] antikoru    
Anti-CK5   ABCAM ab75869 Tavşan rekombinant monoklonal [AY1E6] 
Anti-Sitokeratin 10   ThermoFisher MA5-13705 Fare monoklonal antikoru (DE-K10) 
Anti-Sitokeratin 14   ABCAM ab7800 Fare monoklonal antikoru 
Anti-E-Cadherin   ABCAM AB1416   Fare monoklonal antikoru 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher PA5-79267 Tavşan poliklonal antikoru   
Anti-HTI-56 Teras Biyoteknoloji TB-29AHT1-56   Fare monoklonal antikoru (IgG1) 
Anti-HTII-280 Teras Biyoteknoloji TB-27AHT2-280 Fare monoklonal antikoru (IgM) 
Anti-involucrin   ThermoFisher MA5-11803 Fare monoklonal antikoru (SY5) 
Anti-İzoformlar TA p63-&alfa;, -β, -&gama;    Biolengend 618902 Tavşan poliklonal antikoru   
Anti-Ki67   ABCAM AB8191 Fare monoklonal antikoru [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM ab111090 Tavşan poliklonal antikoru 
Anti-Olgun SP-B Yedi Tepe WRAB-48604 Tavşan poliklonal antikoru 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher PA5-34612 Tavşan poliklonal antikoru   
Anti-Müsin-2 SantaCruz Biyoteknolojisc-7314Fare monoklonal antikoru (IgG1) 
Anti-p63   Dako GA662 Fare monoklonal antikoru p63 Proteini (Dako Omnis)  Klon DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher PA5-32541 Tavşan poliklonal antikoru   
Anti-Podoplanin (AT-1&alfa;)   ABCAM ab128994 Tavşan poliklonal antikoru 
Anti-Pro + Olgun Yüzey Aktif Madde Proteini B ABCAM ab40876 Tavşan poliklonal antikoru 
Anti-Yüzey Aktif Madde C     Yedi Tepe   WRAB-9337   Tavşan poliklonal antikoru 
Anti-Uteroglobin / SCGB1A1 Hycult Biyoteknoloji HM2178 Fare monoklonal antikoru [AY1E6] 
Anti-VE-cadherin   ABCAM AB33168 Tavşan poliklonal antikoru   
Anti-ZO-1   ThermoFisher 33-9100 Fare monoklonal antikoru [1A12] 
Askorbik asitSigmaA4544
Aspirasyon pipetleri Corning / Şahin 357558 2 mL, polistiren, ayrı ayrı sarılmış 
Aspirasyon ipuçları  -  - Steril (otoklavlanmış) 
PBS solüsyonunda B27Termo17504044
Engelleyici BSA (10X)   ThermoFisher 37525 Engelleyici ajan 
Kalsiyum KlorürSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Kollajen Iİleri Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Kollajen I Gelişmiş BioMatrix50053 mg / mL (Vasküler ECM)
Kollajen IVSigma  C5533
Kollajen-IVSigma C5533-5MG & nbsp;İnsan plasentasından elde edilen kollajen, 5 mg toz, 1 mg / mL 'ye sulandırılır;
Kolon Fibroblastları Hücre Biyolojikleri  H6231
Kolonik mikrovasküler endotel hücreleri  Hücre BiyolojikleriH6203 
Konik borular    -  - 15 mL ve 50 mL  polipropilen, steril ve nbsp;
Çapraz bağlayıcı (ER-1) Öykünmek 104615 mg toz 
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, Dilaktat)   ThermoFisher D3571 DNA probu 
Dermal fibroblastlarATCCPCS-201-010
Dermal mikrovasküler endotel hücreleriATCCCRL-3243
DeksametazonSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM / F-12  GIBCO 
DMEM / F-12, GlutaMAX ve nbsp;  GIBCO 10565-018 ALI ortamı için bazal ortam 
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488)   ABCAM ab150105 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru   
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 568)   ABCAM AB175472 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru 
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647)   ABCAM ab150107 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru 
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru 
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 568)   ABCAM AB175470 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru 
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 647)   ABCAM ab150075 Eşek Anti-Fare ikincil antikoru 
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ olmadan) Corning 21-031-CV 1x 
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) insan, E. coli'de rekombinantPromoCellC-60170Orta takviyesi 
F-12 Jambonu' sInvitrogen 21700-108Vasküler ECM
FibriCol Gelişmiş BioMatrix 5133-20ML Kollajen-I çözeltisi (10 mg / mL)
FibronektinCorning356008
Fibronektin, İnsan, Doğal,   Corning 47743-654 insan plazma fibronektin 
İnce uçlu hassas cımbız Aven18056ABD Technik Style 5B-SA Hassas Paslanmaz Çelik Cımbız
GlutamaxCanlandırıcı 21700-108
Glutamax Canlandırıcı 
Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 594)   ABCAM ab150080 Keçi Anti-Fare ikincil antikoru   
Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647)   ABCAM AB150115 Keçi Anti-Fare ikincil antikoru   
Keçi Anti-Fare IgG H & L (FITC)   ABCAM ab6785 ve nbsp;Keçi Anti-Fare ikincil antikoru   
Keçi Anti-Fare IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher A-21124 Keçi Anti-Fare IgG1 ikincil antikoru 
Keçi Anti-Fare IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher A-21042 Keçi Anti-Fare IgM ikincil antikoru 
El tipi vakum aspiratörü Corning 4930  - 
Isı ile İnaktive Edilmiş HyClone FetalClone II Serum (FCS) GE Healthcare Yaşam BilimleriSH30066.03
Hemositometre  -  - - 
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzuSigmaH3149
HEPESThermo15630080
İnsan [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Klinik rezeksiyonlardaninsan kolonoidleriKlinik rezeksiyonlardan elde edilen
İnsan EGF Rekombinant Proteini TermoPHG0311L
insan epitelyal büyüme faktörü Termo 
HyClone FetalClone II Serum (ABD)  GE Sağlık SH30066.02HI   Steril FBS  ısı inaktive edilmiş 
Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzuSigmaH4881
Hidrokortizon PromoCell   C-64420 Orta takviye   
Buz kovası  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Düşük Hızlı Dijital Peristaltik Pompa; q24-Kanal (12 Cips başına 1)
ITESBioWhittaker17-839Z
Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF), Temel Fibroblast Büyüme Faktörü 7 (FGF-7) olarak da bilinir, insan, HEKPromoCellC-63821
KeratinositlerdeATCCPCS-200-010
Laminin BiolaminaCT521-0501 ve nbsp;
Laminin, 521 CTG (CT521) Biyolamina   CT521-0501 ve nbsp;İnsan Rekombinant Laminin 521 &      
Akciğer FibroblastHücre BiyolojikleriH6013
Akciğer FibroblastYaşam Hattı Hücre TeknolojisiFC-0049
Akciğer mikrovasküler endotel hücreleriLonzaCC-2527
Akciğer düz kas hücreleriYaşam Hattı Hücre TeknolojisiFC-0046
Manuel sayaç  -  -  -
Masterflex (TPE) Transfer Boruları Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Orta 199, fenol kırmızısıThermo 
Mikrosantrifüj tüpü  -    -   1.5 mL, steril 
Mikroskop (kameralı)  -  - Parlak alan görüntülemesi için 
N2Sigma17502001
N-asetil sisteinSigmaA5099
Noggin (HEK293T şartlandırılmış ortam)SigmaN17001
Normal Keçi Serumu   ThermoFisher 50062Z Engelleme çözümü   
O-fosgripanolamin SigmaP0503
Paraformaldehit (%4 ağırlıkça/hacim)   EMS 15710 Sabitleme maddesi 
Penisilin StreptomisinGIBCO15140122
Penisilin-streptomisin Sigma P4333 10.000 U/mL; 10 mg/mL 
Pipet uçları    -  - P20, P200 ve P1000  steril, düşük yapışma
özelliğine sahip Pipet Gilson   F167380 P20, P200 ve P1000 
PluriQ Serum Replasmanı (veya alternatif olarak KO Serum replasmanı)AMSBIO (veya Thermo)N / A (veya C1910828010)
Poli-L-Lizin kaplı mikroskop cam slaytları ve nbsp;  Sigma P0425 Cam kaydıraklar 
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteronSigmaP8783
ProLong Altın   ThermoFisher P36931 DAPI ile Antifade Mountant 
Retinoik Asit SigmaR2625
ROCK inhibitörü (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T şartlandırılmış ortam)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots takviyeleri LonzaCC-4124
SAGMTM Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı BulletKitTM Lonza CC-4124 ve nbsp;Orta takviyeler 
SB2001190 Tokris 1264/10
Serolojik pipetler  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL ve 25 mL düşük endotoksin, steril 
Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı (SAGM)Lonza CC-4124 ve nbsp;
Solvent Tamponu (ER-2) Öykünmek 1046225 mL şişe 
Steriflip-HV Kırlangıç SE1M003M00Steril filtreleme konik tüp
Sterilin 100 mm Kare Petri KaplarıThermo103Steril, 6 cips başına 1 adet 
T25 şişeleri  -  -  -
T75 şişeleri  -  -  - 
Tri-iyodotironinSigmaT5516
Triton X-100 (% 0.3 (hacim / hacim)   Sigma T8787 Geçirgenleştirme ajanı 
Tripan mavisi Sigma 93595 % 0.4 çözelti 
TrypEE çözümü Sigma 12604013 Hücre ayırma solüsyonu 
TWEEN-20 Sigma P2287 Geçirgenleştirme ajanı 
UV Işıklı Fırın (tepe frekansı 365nm, 100 ve mikro; J/cm2)VWR21474-598UVP, Uzun Menzilli UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vakum kurulumu  -  - Minimum basınç: -70 kPa 
Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü 165 (VEGF-165) insan, E. coli'de rekombinantPromoCellC-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420 Orta takviye 
Von Willebrand Faktörü konjuge FITC   ABCAM AB8822 Koyun poliklonal antikoru 
Su banyosu (veya boncuklar)  -  - 37 & dereceye ayarlayın; C 
Wnt3A (L-Wnt3A şartlandırılmış ortam)ATCCCRL-2647
1132008235050061 elde edilenPHG0311 rekombinant 11043023

Kaynaklar

  1. Van Norman, G. A. Limitations of animal studies for predicting toxicity in clinical trials: Is it time to rethink our current approach. JACC: Basic to Translational Science. 4 (7), 845-854 (2019).
  2. Wange, R. L., Brown, P. C., Davis-Bruno, K. L. Implementation of the principles of the 3Rs of animal testing at CDER: Past, present and future. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 123, 104953(2021).
  3. Mosig, A. S. Organ-on-chip models: New opportunities for biomedical research. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  4. Alépée, N., et al. State-of-the-art of 3D cultures (organs-on-a-chip) in safety testing and pathophysiology. Altex. 31 (4), 441-477 (2014).
  5. MacArron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
  6. Hughes, J. P., Rees, S. S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  7. Kitaeva, K. V., Rutland, C. S., Rizvanov, A. A., Solovyeva, V. V. Cell culture based in vitro test systems for anticancer drug screening. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 322(2020).
  8. Mao, P., et al. Human alveolar epithelial type II cells in primary culture. Physiological Reports. 3 (2), 12288(2015).
  9. Zaitseva, M., Vollenhoven, B. J., Rogers, P. A. W. In vitro culture significantly alters gene expression profiles and reduces differences between myometrial and fibroid smooth muscle cells. Molecular Human Reproduction. 12 (3), 187-207 (2006).
  10. Singh, A., Brito, I., Lammerding, J. Beyond tissue stiffness and bioadhesivity: Advanced biomaterials to model tumor microenvironments and drug resistance. Trends in Cancer. 4 (4), 281-291 (2018).
  11. Nawroth, J. C., et al. Stem cell-based Lung-on-Chips: The best of both worlds. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 12-32 (2019).
  12. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33(2020).
  13. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  14. Sutherland, R. M., Inch, W. R., McCredie, J. A., Kruuv, J. A multi-component radiation survival curve using an in vitro tumour model. International Journal of Radiation Biology. 18 (5), 491-495 (1970).
  15. Chandra, P., Lee, S. J. Synthetic extracellular microenvironment for modulating stem cell behaviors. Biomarker Insights. 10, 105-116 (2015).
  16. Nicolas, J., et al. 3D extracellular matrix mimics: Fundamental concepts and role of materials chemistry to influence stem cell fate. Biomacromolecules. 21 (6), 1968-1994 (2020).
  17. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  18. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).
  19. Mantha, S., et al. Smart hydrogels in tissue engineering and regenerative medicine. Materials. 12 (20), 3323(2019).
  20. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  21. Li, H., et al. Biomechanical cues as master regulators of hematopoietic stem cell fate. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 5881-5902 (2021).
  22. Donoghue, L., Nguyen, K. T., Graham, C., Sethu, P. Tissue chips and microphysiological systems for disease modeling and drug testing. Micromachines. 12 (2), 139(2021).
  23. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  24. Varone, A., et al. A novel organ-chip system emulates three-dimensional architecture of the human epithelia and the mechanical forces acting on it. Biomaterials. 275, 120957(2021).
  25. Hassell, B. A., et al. Human organ chip models recapitulate orthotopic lung cancer growth, therapeutic responses, and tumor dormancy in vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  26. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Biobanking. 1897, 253-268 (2019).
  27. Grant, J., et al. Simulating drug concentrations in PDMS microfluidic organ chips. Lab on a Chip. 21 (18), 3509-3519 (2021).
  28. Barrile, R., et al. Organ-on-chip recapitulates thrombosis Induced by an anti-CD154 monoclonal antibody: Translational potential of advanced microengineered systems. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 104 (6), 1240-1248 (2018).
  29. Jain, A., et al. Primary human lung alveolus-on-a-chip model of intravascular thrombosis for assessment of therapeutics. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (2), 332-340 (2018).
  30. Campbell, S. B., Wu, Q., Yazbeck, J., Liu, C., Okhovatian, S., Radisic, M. Beyond polydimethylsiloxane: Alternative materials for fabrication of organ-on-a-chip devices and microphysiological systems. ACS Biomaterials Science and Engineering. 7 (7), 2880-2899 (2021).
  31. Pun, S., Haney, L. C., Barrile, R. Modelling human physiology on-chip: Historical perspectives and future directions. Micromachines. 12 (10), 1250(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Epitel Doku ModelleriMikroakışkan PlatformBariyer FonksiyonuStromal HidrojelEndotelyal HücrelerYüzey MikrodesenlemeHava-Sıvı ArayüzüÇok Katmanlı EpitelVasküler Kanal
İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.