İnsan Epitel Dokularının Üstü Açık Bir Organ Çipi Üzerindeki Sitomimarisinin ve İşlevinin Yeniden Yapılandırılması

Summary

Bu protokol, Primer dokuların (deri, alveolus, hava yolu ve bağırsak) tam kalınlıkta çip üstü organ kültürlerinin başarılı bir şekilde kurulması ve olgunlaşması için Open-Top Organ-Chip'in yeteneklerini ve temel kültür modalitelerini açıklamakta ve insan epitelyal/mezenkimal ve vasküler niş arayüzünün farklı fonksiyonel yönlerini in vitro olarak araştırma fırsatı sunmaktadır.

Abstract

Neredeyse tüm insan organları, üç boyutlu (3B) yapılar halinde organize edilmiş, sıkıca bağlanmış hücrelerin bir veya daha fazla katmanından oluşan epitel dokularıyla kaplıdır. Epitelin temel işlevlerinden biri, altı çizili dokuları fiziksel ve kimyasal hakaretlere ve enfeksiyöz ajanlara karşı koruyan bariyerlerin oluşmasıdır. Ek olarak, epitel, besinlerin, hormonların ve diğer sinyal moleküllerinin taşınmasına aracılık eder ve genellikle organ içindeki hücre konumlandırmasını ve bölümlenmesini yönlendiren biyokimyasal gradyanlar oluşturur. Organ yapısını ve fonksiyonunu belirlemedeki merkezi rolleri nedeniyle, epitel, her zaman hayvan modelleri tarafından yakalanmayan birçok insan hastalığı için önemli terapötik hedeflerdir. Türler arası bariz farklılıkların yanı sıra, hayvanlarda epitelin bariyer fonksiyonu ve taşıma özellikleri üzerine araştırma çalışmaları yapmak, canlı bir sistemde bu dokulara erişmenin zorluğu ile daha da artmaktadır. İki boyutlu (2B) insan hücre kültürleri temel bilimsel soruları cevaplamak için yararlı olsa da, genellikle zayıf in vivo tahminler verirler. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, son on yılda, çip üzerinde organlar olarak bilinen çok sayıda mikro mühendislik biyomimetik platform, geleneksel in vitro ve hayvan testlerine umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Burada, deri, akciğerler ve bağırsaklar dahil olmak üzere organa özgü epitel dokularını modellemek için tasarlanmış bir platform olan Open-Top Organ Chip'i (veya Open-Top Chip) açıklıyoruz. Bu çip, dokuya özgü fibroblastları ve endotel hücrelerini mekanik olarak aktif bir sisteme dahil ederek bir 3D stromal bileşeni yeniden oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere, epitel dokularının çok hücreli mimarisini ve işlevini yeniden oluşturmak için yeni fırsatlar sunmaktadır. Bu Open-Top Chip, epitelyal/mezenkimal ve vasküler etkileşimleri tek hücrelerden çok katmanlı doku yapılarına kadar çoklu çözünürlük ölçeklerinde incelemek için benzeri görülmemiş bir araç sağlar, böylece epitelize organların hücreler arası çapraz konuşmasının sağlık ve hastalıkta moleküler diseksiyonuna izin verir.

Introduction

Tarihsel olarak, bilim adamları ilaç keşfi için klinik öncesi hayvan testlerine güvenmişlerdir, ancak insan sonuçlarıyla zayıf korelasyon nedeniyle bu yöntemlerin giderek artan bir kısmı sorgulanmıştır¹. Hayvan deneylerini Değiştirmek, Azaltmak ve İyileştirmek için "3R" ilkelerinin uygulanması, bilim insanlarını klinik öncesi ilaç ve kimyasal toksikoloji risk değerlendirmesini desteklemek için yeni in vitro alternatif yöntemler bulmaya çağırmaktadır². Bununla birlikte, bugüne kadar geliştirilen birçok in vitro model, insan canlı organlarının dinamik doğasını özetlemek için gerekli biyolojik mimariden, hücresel karmaşıklıktan ve mekanik ortamdan yoksundur ^3,4.

Geleneksel in vitro preklinik sistemler tipik olarak sert bir plastik yüzey üzerinde yetiştirilen insan hücrelerinin 2D monokültürlerini kullanır. Bu yöntemler, basit mekanik çalışmaların yürütülmesi için bir araç sağlar ve ilaç adaylarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlar. Nispeten düşük maliyetleri ve yüksek sağlamlıkları nedeniyle, 2D modeller genellikle otomatik yüksek verimli sistemlerle eşleştirilir ve ilaç geliştirme sürecinin erken aşamasında potansiyel ilaç adaylarının hızlı bir şekilde tanımlanması için kullanılır ^5,6. Bununla birlikte, bu tür 2D modeller, gelişimlerinin klinik öncesi aşamasında ilaç güvenliği ve etkinliğinin doğru tahminleri için gerekli olan terapötik adaylara doku seviyesi, organ düzeyinde veya sistemik yanıtları modellemek için translasyonel bir yaklaşım sağlamaz. Düz hücre kültürleri, karmaşık çok hücreli etkileşim, biyomekanik özellikler ve insan dokularının üç boyutlu (3B) mimarisi dahil olmak üzere doğal doku mikro ortamını özetlemez⁷. Düz bir yüzeyde büyüyen hücreler genellikle olgun bir fenotip kazanmazlar ve bu nedenle doğal dokuda olduğu gibi farmakolojik uyaranlara cevap veremezler. Örneğin, in vitro olarak yetiştirilen birincil insan alveoler epitel hücreleri skuamöz bir fenotip sergiler ve sürfaktan proteinleri C ve B (SP-C ve SP-B)⁸ dahil olmak üzere anahtar fenotipik belirteçleri kaybeder. Yetersiz farklılaşmaya ek olarak, birincil hücreler sıklıkla in vitro biyolojik stresörlere karşı duyarsız hale gelir, çünkü doku iltihabı ile ilişkili bazı biyokimyasal yollar fonksiyonel olmayan hale gelir⁹. Bu tür hücre fonksiyon kaybı, öncelikle sert substratların yanı sıra akciğer fibroblastları ve düz kas hücreleri gibi dokuya özgü stromal hücreler tarafından doğal olarak salınan çözünür faktörlerin eksikliği ile ilişkili görünmektedir^10,11.

Kemo-fiziksel ve biyolojik karmaşıklık eksikliğinin in vitro hücrelerin fizyolojik davranışını sınırladığını anlamak, vücut dışındaki insan dokularının karmaşıklığını daha iyi yakaladığı kanıtlanmış daha sofistike çok hücreli modellerin geliştirilmesini teşvik etmiştir^12,13. 1970'lerin başında ilk ko-kültür modellerinin oluşturulmasından bu^yana14, sentetik ve doğal hidrojellerin piyasaya sürülmesi, doğal doku mikro ortamlarını taklit etme yeteneğini önemli ölçüde geliştirmiş ve hücresel farklılaşmayı yönlendirmek, hücrelerin doku benzeri yapılara kendi kendini organize etmesine rehberlik etmek ve doğal doku fonksiyonlarının restorasyonu için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir^15,16. Örneğin, uygun 3D iskelede yetiştirildiğinde, insan hücreleri sferoidler veya organoidler gibi fonksiyonel yapılara kendi kendine düzenleyebilir, kök hücre belirteçlerini eksprese edebilir ve kendini yenileyebilir¹⁷. Buna karşılık, insan hücreleri (kök hücreler dahil), geleneksel 2D substratlar üzerinde yetiştirildiğinde, birkaç pasajdan sonra hızla yaşlanır ve yaşlanmaya uğrar¹⁸. Ek olarak, hidrojeller gözeneklilik, gözenek boyutu, lif kalınlığı, viskoelastisite, topografya ve sertlik gibi spesifik doku özelliklerine uyacak şekilde "uyarlanabilir" veya fizyolojik veya patolojik koşulların öykünmesini sağlayan doku kaynaklı hücresel bileşenler ve / veya biyoaktif moleküller ile daha fazla mühendislik yapılabilir^19,20. İlaç testi için muazzam potansiyellerine rağmen, farmasötik araştırmalarda kullanılan 3D hidrojel bazlı modeller, in vivo dokuların karmaşık sitomimarisini tam olarak özetlememektedir ve hidrostatik basınç, siklik gerilme ve sıvı makası²¹ dahil olmak üzere normalde insan vücudunda bulunan önemli hemodinamik ve mekanik uyaranlardan yoksundur.

Çip üzerinde organlar (OOC'ler) gibi mikrofizyolojik sistemler (MPS'ler) son zamanlarda in vitro^22,23 karmaşık fizyolojik yanıtları yakalayabilen araçlar olarak ortaya çıkmıştır. Bu modeller genellikle canlı organların dinamik mikro ortamının modellenmesini sağlayan mikroakışkan platformların kullanımını kullanır.

Karmaşık insan epitel dokusunun Open-Top Chip modelini oluşturmak için 3D doku biyomühendisliği ve mekanobiyoloji ilkelerini birleştirdik. Bu, epitel dokularının çok hücreli ve dinamik mikro ortamını yakından özetlememize izin verdi. Bu, canlı organlarda doğal olarak bulunan, ancak geleneksel in vitro modeller tarafından sıklıkla ihmal edilen dokuya özgü biyokimyasal ve biyomekanik ipuçlarını içerir²⁴. Üstü Açık Çip iki bölmeden oluşur: bir vasküler bölme (Şekil 1A) ve gözenekli bir zarla ayrılmış bir stromal bölme (Şekil 1B), iki oda arasında besin maddelerinin difüzyonuna izin verir (Şekil 1C). Vasküler bölme, fizyolojik kayma stresini özetlemek için sürekli sıvı akışına maruz kalırken, stromal odanın gerilebilir tasarımı, solunum hareketleri veya bağırsak peristalsisi ile ilişkili mekanik gerilmenin modellenmesine izin verir. Stromal bölme, dokuya özgü fibroblastların fizyolojik büyümesini desteklemek için tasarlanmış ayarlanabilir 3D hidrojel iskelesini barındırır. Bir hava-sıvı arayüzünün kurulmasını kolaylaştıran çıkarılabilir bir kapağa sahiptir, bu durum mukozal dokuların insan fizyolojisinin daha fazla öykünmesine ve ayrıca ilaçların doğrudan epitel tabakasına uygulanması için dokuya doğrudan erişime izin veren bir durumdur. Ek Şekil 1, Boyutlar ve biyolojik bölmeler (Ek Şekil 1A-D) dahil olmak üzere Üstü Açık Çip tasarımının bazı önemli bileşenlerini ve bu protokolde açıklanan ana teknik adımları (Ek Şekil 1E) yakalar.

Üstü Açık Çipin perfüzyonu, programlanabilir bir peristaltik pompa ile sağlanır (Şekil 1D). Peristaltik pompa kurulumu, 12 Üstü Açık Talaş'ın aynı anda perfüze edilmesini sağlar. Çoğu inkübatör, inkübatör başına 24 talaşa kadar kültür sağlayan iki kuruluma ev sahipliği yapabilir. Mekanik germe, özel yapım programlanabilir bir vakum basınç regülatörü kullanılarak gerçekleştirilir (Şekil 1E). Dijital-analog dönüştürücü tarafından elektronik olarak kontrol edilen bir elektro-pnömatik vakum regülatöründen oluşur. Başka bir deyişle, elektro-pnömatik vakum regülatörü, kullanıcı tarafından belirlenen bir genlik ve frekansa sahip bir sinüzoidal vakum profili oluşturur. %0 ila %15 arasında değişen döngüsel gerinim, Üstü Açık Çipin vakum kanalına 0 ila -90 kPa arasında değişen bir genlikte ve 0,2 Hz frekansında negatif basınç uygulanarak üretilir. Daha önce kabul edilen ve diğer makalelerde açıklanan ticari olarak temin edilebilen Flexcell Gerinim Ünitesine eşdeğer ısmarlama bir sistemdir²⁵. Örneğin, akciğerin solunum hareketi veya bağırsağın peristalsisi ile ilişkili mekanik doku deformasyonunu taklit etmek için, pnömatik aktüatör, büyüklüğü ve genliği, insan hücrelerinin doğal dokularında yaşadıkları fizyolojik gerinim ve frekans seviyesine uyacak şekilde ayarlanabilen sinüzoidal vakum / gerinim dalgaları uygular.

Burada, prototip Open-Top Chip platformunda organotipik epitel eşdeğerlerinin mühendisliği ve kültürü için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntem açıklıyoruz. Deri, alveolus, hava yolu ve kolon gibi karmaşık organ modellerinin oluşturulmasına izin verirken, vasküler sıvı akışını ve mekanik germeyi entegre eder. Karmaşık epitel modelleri oluşturmak için doku mühendisliği ilkelerini uygularken göz önünde bulundurulması gereken temel teknik hususları özetleyeceğiz. Mevcut tasarımın avantajlarını ve olası sınırlamalarını tartışacağız.

Akış ve gerilme parametreleri de dahil olmak üzere doku ve organ olgunlaşmasını sağlamak için kullanılan ana adımlara genel bir bakış aşağıda bildirilmiştir: Cilt için Şekil 2, alveolus için Şekil 3, hava yolu için Şekil 4 ve bağırsak için Şekil 5. Farklı organ modellerinin kültürlenmesinde kullanılan ortam bileşimi ve reaktifler ile ilgili ek bilgiler ek tablolarda yer almaktadır (Cilt için Ek Tablo 1; Alveolus için Ek Tablo 2; Hava yolu için Ek Tablo 3 ve bağırsak için Ek Tablo 4).

Protocol

İnsan kolonoidleri, Cincinnati Çocuk Hastanesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC 2017-2011) yönergelerine uygun olarak bağırsak rezeksiyonlarından elde edildi.

1. Yüzey aktivasyonu

1. Aktivasyon tamponunun hazırlanması
   1. Çapraz bağlayıcı ve çözücü tampon reaktiflerini biyogüvenlik kabininin (BSC) altına yerleştirin ve kullanmadan önce 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) dengelenmelerini sağlayın.
   2. Crosslinker çözeltisini doğrudan ışığa maruz kalmaktan korumak için steril ışık geçirimsiz bir kap veya alüminyum folyoya sarılmış şeffaf bir 15 mL konik tüp kullanarak çözücü tamponunun 5 mL'sinde 5 mg çapraz bağlayıcıyı yeniden oluşturun.
   3. Tüm kümeleri çıkarmak için çözeltiyi 1 dakika boyunca vorteksleyin ve ardından çapraz bağlayıcı çözeltisinin 50 μL'sini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'sini üstü açık odaya pipetin.
   4. Bir aspiratör kullanarak çipin yüzeyindeki fazla çapraz bağlama solüsyonunu temizleyin. Ardından, kalan hava kabarcığını çıkarmak için 50 μL çapraz bağlama çözeltisini doğrudan çipin alt kanalına ve 150 μL'lik çapraz bağlama çözeltisini açık bölmeye pipetin.
2. UV çapraz bağlama makinesi ile aktivasyon
   1. Kapağı BSC'nin altındaki çipten yavaşça çıkarın ve steril bir kapta saklayın.
   2. Çapraz bağlayıcı çözeltisini içeren talaşları bir Petri kabına aktarın, kontaminasyonu önlemek için Petri kabını kapatın ve kabı talaşlarla birlikte UV çapraz bağlama makinesinin altına yerleştirin.
      NOT: UV ışınlarına maruz kalmayı en üst düzeye çıkarmak için Petri kabının kapağını çıkarın.
   3. UV çapraz bağlama makinesini 100 μJ/^cm2 yoğunlukta 365 nm tepe dalga boyuna ayarlayın ve UV ışığını 20 dakika boyunca açın.
      NOT: 20 dakikalık UV işleminden sonra, çapraz bağlayıcı çözeltisi daha koyu (kahverengi) görünecektir.
   4. Talaşları BSC'nin altına geri getirin ve oksitlenmiş çapraz bağlayıcı çözeltisini aspire edin. Daha sonra, tüm talaşları çözücü tamponla üç kez durulayın ve polidimetilsiloksan (PDMS) yüzeyinin kimyasal işlevini tamamlamak için talaşların BSC altında 5-10 dakika kurumasını bekleyin.

2. Stroma eşdeğerinin hazırlanması

1. 10x rekonstrüksiyon tamponunun hazırlanması (100 mL)
   1. 2.2 g sodyum bikarbonat, çift damıtılmış suda 75 mL 0.067 M NaOH içinde çözülür.
   2. 4.76 g HEPES ekleyin ve çift damıtılmış su kullanarak hacmi 100 mL'ye getirin.
   3. BSC altındaki çözeltiyi 0,22 μm membranlı tek kullanımlık steril bir şişe üstü filtre kullanarak steril filtreleyin.
      NOT: Çözelti, 4 °C'de saklandığında yaklaşık 6 ay boyunca stabildir.
2. Ön jel çözelti hacminin tahmini
   1. Deney için gereken ön jel çözeltisinin miktarını tahmin etmek için deney için gereken talaş sayısını 150 μL (merkezi üstü açık odanın iç hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 150) μL
   2. Kollajen ön jel çözeltisini buz üzerinde karıştırarak hazırlayın: Tercih edilen hücreleri içeren 1 hacim 10x EMEM, 1 hacim 10x rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1), 8 hacim kollajen I çözeltisi (10 mg / mL) ve her bir mg kollajen I için 1 μL 1 N NaOH çözeltisi.
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan +%15 hacim hazırlanması önerilir; Bölüm 2.2'de açıklanan örnek, 12 talaş ve ekstra% 15'lik bir hacim için yeterli ön jel çözeltisi hazırlamak için ayrıntılı bir adım adım prosedür sağlar.
3. Stroma eşdeğeri için ön jel çözeltisinin hazırlanması (12 cips için)
   1. Buz üzerinde BSC altında aşağıdaki çözümleri getirin: 10x EMEM; 10x Rekonstrüksiyon tamponu (bkz. adım 2.1); Kollajen I çözeltisi (10 mg / mL); ve Steril 1 N NaOH çözeltisi.
   2. Kültür dokusuna özgü mezenkimal hücreler, sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşir ve daha sonra hücre sağlayıcı tarafından önerilen tripsin veya diğer yöntemleri kullanarak hücreleri ayrıştırır. Hücreleri 24 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleme yoluyla bir pelet içinde toplayın.
   3. Hücre peletini 225 μL buz gibi soğuk 10x EMEM'de yeniden askıya alın ve 225 μL buz gibi soğuk 10x rekonstrüksiyon tamponu ekleyin (bkz. adım 2.1). Çözeltiyi yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve ardından 1.800 μL buz gibi soğuk kollajen I çözeltisi ekleyin.
   4. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipet yapın, buzdayken ön jel çözeltisini karıştırmak için kabarcıklardan kaçının.
4. Stroma eşdeğerinin çip üzerine dahil edilmesi (12 çip için)
   1. Ön jel çözeltisini 18 μL 1 N NaOH ile nötralize edin. 5-6 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek nazikçe karıştırın ve ardından 150 μL hücre yüklü hidrojeli Üstü Açık Çipin merkezi odasına pipetleyerek kabarcıkları önleyin.
      NOT: Mikro modelleme gerekiyorsa, lütfen bir sonraki adıma geçin (bölüm 3).
   2. Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj tüpü kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve inkübatördeki Petri kaplarını 37 ° C,% 5 CO_2'deinkübe edin.
      NOT: 90 dakika sonra, hücre yüklü hidrojel tamamen polimerize olacaktır.

3. Yüzey mikro desenleme (isteğe bağlı)

1. 3D baskılı pullar kullanarak nötralize edilmiş kollajen hidrojelini (hala sıvı halinde) pipetledikten sonra stromal hidrojelin yüzey mikrodesenlemesini gerçekleştirin.
   NOT: 3D baskılı pullar, daha önce^24'te açıklandığı gibi çeşitli özelleştirilebilir tasarımlarda elde edilebilir.
2. Nötralize edilmiş kollajen I ön jel çözeltisinin 20 μL'lik pipeti, steril 3D baskılı bir damganın desenli yüzeyine yerleştirin ve stromal hidrojel hala sıvı formdayken damgayı üstü açık odanın içine (üste) yerleştirin.
3. Bir aspiratör (veya pipet) kullanarak üstü açık odanın üstünden dökülebilecek hidrojel kalıntılarını temizleyin. Tüm cipsleri ayrı Petri kaplarında gruplandırın ve her Petri kabına 2 mL steril ddH₂O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı ekleyin.
4. Tüm Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 90 dakika boyunca inkübe edin ve ardından talaşları BSC'nin altına geri getirin ve hidrojele zarar verme riskini azaltmak için hassas cımbız kullanarak damgaları yavaşça çıkarın.

4. Epitel ve vasküler yüzeyin dokuya özgü ECM proteinleri ile kaplanması

1. Vasküler mikroakışkan odanın hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
   1. Deney için gereken vasküler ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 20 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 20) μL
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir.
   2. Buz gibi soğuk PBS veya HBSS kullanarak tüm talaşlar için vasküler ECM kaplama solüsyonunu (örneğin, 12 talaş başına 300 μL) hazırlayın.
      NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için.
   3. Pipet, her bir çipin vasküler kanalına 20 μL vasküler ECM kaplama çözeltisi ekleyin.
2. Stromal eşdeğerin apikal yüzeyinin hücre dışı matriks proteinleri ile kaplanması
   1. Deney için gereken epitelyal ECM kaplama çözeltisinin hacmini tahmin etmek için deney için gereken çip sayısını 50 μL (vasküler kanalın hacmi) ile çarpın:
      Gerekli hacim = (Çip sayısı x 50) μL
      NOT: Deneysel hataları hesaba katmak için fazladan %15'lik bir hacim hazırlanması önerilir.
   2. Buz gibi soğuk PBS veya HBSS'de tüm talaşlar için yeterli ECM kaplama çözeltisi hazırlayın (örneğin, 12 talaş başına 750 μL) ve 50 μL epitelyal ECM kaplama çözeltisini doğrudan hidrojel yüzeyinin üzerine aktarın.
      NOT: Ek materyaller bölümündeki spesifik organ-protokol tablosuna bakın (Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ve bağırsak için Ek Tablo 4 ) spesifik reaktifleri ve önerilen ECM bileşimini tanımlamak için.
   3. Cipsleri, her Petri kabında 2 mL steril ddH 2 O ile doldurulmuş bir santrifüj 15 mL konik tüp kapağı da dahil olmak üzere ayrı Petri kapları halinde gruplandırın ve epitel hücre tohumlamasına devam etmeden önce inkübatörde Petri kaplarını 37 ° C'de,% 5 CO_2'de2 saat boyunca inkübe edin.

5. Epitel hücrelerinin stromal eşdeğeri üzerine tohumlanması

1. Epitel hücre kültürü
   1. Kültür dokusuna özgü epitel hücreleri %80-90 oranında birleşene kadar sağlayıcılar tarafından yönlendirilir.
   2. Hücre sağlayıcısı tarafından önerilen proteolitik enzim prosedürlerini kullanarak hücreleri ayırın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, epitel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P1-P2) hasat edin.
   3. Ayrıştıktan sonra, hücreleri santrifüj edin ve bir pelet olarak toplayın.
   4. Epitel hücrelerini, spesifik organ protokolü tablosunda belirtildiği gibi uygun hücre / fragman yoğunluğuna yeniden askıya alın.
      NOT: Bu çalışmada cilt için 3 x 10 6 hücre/mL, alveolus için 1 x 10 6 hücre/mL, hava yolu için 6 x 10 6 hücre/mL ve bağırsak için 8 x 10 ⁶ hücre/mL yoğunlukta hücre solüsyonu kullanılmıştır.
2. Epitel hücre tohumlaması
   1. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın. Kaplama çözeltisini vasküler kanaldan aspire edin ve vasküler mikroakışkan kanalı 50 μL taze endotel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
   2. Kaplama çözeltisini hidrojel yüzeyinden aspire edin ve fazla kaplama çözeltisini gidermek için stromal yüzeyi 100 μL taze epitel hücre kültürü ortamı ile üç kez durulayın.
   3. Yükselen ortamı aspire edin ve hidrojel yüzeyini, ek tablolarda belirtildiği gibi uygun hücre yoğunluğunu kullanarak 50 μL epitel hücre süspansiyonu ile tohumlayın ve daha sonra cipsleri 2 saat boyunca inkübatöre geri aktarın (veya kolonoidler için bir gecede).
   4. Hücresel kalıntıları gidermek için hidrojel yüzeyini hücre kültürü ortamıyla iki kez nazikçe durulayın. Son olarak, kapalı otoklavlanabilir kaplarda otoklavlama yaparak ortamı yenileyin ve talaşları peristaltik pompaya bağlayın.

6. Çipleri akışa bağlama

1. Akışkan parçaların hazırlanması
   1. Çipleri ortam rezervuarlarına bağlamak için gereken kısa mikroakışkan boruyu hazırlamak için 2 inç biyouyumlu polipropilen bazlı termoplastik elastomer (TPE) transfer borusunu (Malzeme Tablosu) kesin.
   2. Uzun mikroakışkan boruyu üretmek için 7,5 inç biyouyumlu TPE transfer borusunu kesin.
   3. Yeterince 18 G ve 19 G metal konektör hazırlayın (Malzeme Tablosu).
      NOT: Üstü Açık Talaşları peristaltik pompalara bağlamadan en az 1 gün önce 6.1.1 ve 6.1.2 adımlarında açıklanan boru ve konektörlerin hazırlanması ve sterilize edilmesi önerilir.
   4. Her orta rezervuarın kapağını 4 inçlik bir hipodermik iğne ile delin (Malzeme Tablosu).
2. Orta gaz giderme
   1. Hücre kültürü ortamının oda sıcaklığına (RT) dengelenmesine izin verin.
   2. İhtiyaç duyulan ortamın hacmini konik bir filtreleme tüpüne aktarın.
   3. Ortamın gazını gidermek için -20 PSI negatif vakum basıncı uygulayın (vakum tahrikli filtrasyon).
      NOT: Bir vakum mevcut değilse, benzer sonuçlar elde etmek için hücre kültürü ortamı gece boyunca inkübatörde dengelenmeye bırakılabilir.
3. Üstü Açık Çipi sıvı akışı için hazırlama
   1. Talaşları ve steril akışkan parçaları BSC'nin altına getirin ve sıvı akışını başlatmadan önce Open-Top Chip prototipini sızdırmaz hale getirmek için Open-Top Chip'in kapağını (üst kısmı) hizalayın.
   2. Gazdan arındırılmış hücre kültürü ortamının 200 μL'lik pipetini (organa özgü tablolara bakın) çipin hem üst hem de alt kanallarının giriş portuna yerleştirin ve kabarcıkları önlemeye dikkat edin.
   3. Tüplerin iç yüzeyini astarlamak ve kısa boruyu çipin üst ve alt kanallarının girişlerine bağlamak için kısa mikroakışkan boruya 300 μL kültür ortamının pipetini ekleyin.
4. Mikroakışkan yüzeyleri bağlayın ve astarlayın
   1. Orta rezervuarları çiftlik rafına yerleştirin, hipodermik iğneyi talaşların alt girişine bağlayın ve son olarak, inkübatörün içindeki muhafaza taşıyıcılarındaki tüm talaşları yerleştirin.
   2. Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve ardından tüm yongaların düzgün bir şekilde bağlandığından ve hücre kültürü ortamının gözle görülür bir sızıntısı olmadığından emin olmak için tüm konektörleri inceleyin.
   3. Pompa üzerindeki Temizleme düğmesini kullanın ve yaklaşık 15 saniye boyunca veya hücre kültürü ortamının damlacıkları çıkış borusunun sonunda görünene kadar basılı tutun.
   4. Uygun organ-çip akış hızını ayarlamak için pompa üzerindeki kontrol sistemini kullanın (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5).

7. Talaşların bakımı

1. Organ-çip bakımı
   1. Epitel ve / veya endotel için taze hücre kültürü ortamı hazırlayın ve gaz giderme adımlarını uygulayın (daha önce adım 6.2'de açıklandığı gibi).
   2. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın ve rezervuarlara bırakılan ortam hacmini çıkarın.
   3. Hücre kültürü ortamını üst ve alt giriş haznelerine 5 mL taze hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve talaş muhafazası taşıyıcılarını inkübatöre geri yerleştirin. Talaşları peristaltik pompaya bağlayın ve akışı yeniden başlatın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
   4. 7.1.1-7.1.3 adımlarını Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4 ve Şekil 5'e göre iki günde bir yineleyin.
2. Hava-sıvı arayüzünün (ALI) kurulması
   1. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Çipleri inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın ve kalan ortamın hacmini üst hazneye çıkarın.
   2. Üst mikroakışkan kanaldan tüm ortamı nazikçe aspire edin ve ortam buharlaşmasını ve ALI'nin bakımını azaltmak için bağlayıcı klipsler kullanarak üst girişlere bağlı kısa mikroakışkan boruyu sıkıştırın.
   3. Üstü Açık Çipi gövde taşıyıcı(lar)ına tekrar inkübatöre yerleştirin ve talaşları peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
   4. Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.
3. Germe (İsteğe bağlı)
   1. Peristaltik pompayı duraklatın ve çip başına iki uzun mikroakışkan tüp kullanarak çiplerin vakum portlarını vakum modülüne bağlayın.
   2. Esneme ayarını, organ protokolü tablolarında belirtildiği gibi her organ için önerilen duruma ayarlamak için vakum modülünü kullanın: Cilt için Ek Tablo 1 ; Alveolus için Ek Tablo 2 ; Hava yolu için Ek Tablo 2 ; ve bağırsak için Ek Tablo 4 .
   3. Tüm talaşların düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için boru bağlantılarını görsel olarak inceleyin.
   4. Peristaltik pompayı başlatarak akışa devam edin.

8. Vasküler kompartmanda endotel hücrelerinin tohumlanması

1. Hücreleri ve cipsleri vasküler hücre tohumlaması için hazırlayın
   1. Kültür, dokuya özgü endotel hücrelerini sağlayıcılar tarafından yönlendirildiği şekilde% 80-90 oranında birleşene kadar birleştirir. Proteolitik bir enzim prosedürü kullanarak hücreleri ayırın (sağlayıcı tarafından önerildiği gibi) ve son olarak, endotel hücrelerini 3 x 10⁶ hücre / mL'lik bir çözelti içinde yeniden askıya alın.
      NOT: En iyi sonuçlar için, endotel hücrelerini% 70 -% 90 arasında akıcılığa ulaştıklarında aktif büyüme fazı sırasında düşük pasajda (P2-P4) toplayın.
   2. Peristaltik pompayı duraklatın. Talaşları inkübatörden BSC'ye aktarın, talaşları ortam rezervuarlarından ve bağlı borulardan ayırın ve ardından talaşları ayrı Petri kaplarında gruplandırın.
   3. Epitel bölmesinin hücre kültürü ortamını taze epitel hücre kültürü ortamı ile yenileyin. Vasküler kanalı taze endotel hücre kültürü ortamı ile iki kez durulayın ve ardından ortamı vasküler bölmeden aspire edin.
2. Endotel hücre tohumlaması
   1. Alt (vasküler) kanalı 25 μL endotel hücre süspansiyonu (3 x 10⁶ hücre / mL) ile tohumlayın, endotel hücrelerinin mikroakışkan odanın üst yüzeyine yapışmasını sağlamak için çipleri baş aşağı çevirin.
      NOT: Çip başına 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin (12 yonga başına 600 μL).
   2. Cipsleri Petri kapları halinde gruplandırın. Onları 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübatöre geri yerleştirin ve endotel hücrelerinin 1 saat boyunca bağlanmasına izin verin.
   3. 1 saat sonra, cipsleri inkübatörden BSC'ye aktarın. Hücresel kalıntıları gidermek için vasküler kanalı endotel hücre kültürü ortamıyla iki kez durulayın.
   4. Vasküler kanalı endotel hücreleriyle bir kez daha tohumlamak için 8.2.1-8.2.2 adımlarını tekrarlayın ve endotel hücrelerinin vasküler kanalın alt yüzeyine yapışmasını kolaylaştırmak için çipleri düz bir şekilde yerleştirin.
3. Çipi akışa yeniden bağlayın
   1. Vasküler ortam rezervuarını, BSC altında gazdan arındırılmış vasküler hücre kültürü ortamı ile doldurun.
   2. Talaşları tekrar talaş gövdesi taşıyıcılarının içine yerleştirin ve talaşları bir ucundaki orta haznelere, diğer ucundaki peristaltik pompaya yeniden bağlayın.
      NOT: Ortamı damar bölmesine hızlı bir şekilde yenilemek ve hava kabarcığı riskini azaltmak için Temizleme işlevinin kullanılması önerilir.
   3. Tüm çiplerin düzgün bir şekilde bağlandığından ve görünür bir orta damlama damlacığı olmadığından emin olmak için mikroakışkan bağlantıları görsel olarak inceleyin. Ardından, peristaltik pompayı başlatarak sıvı akışını sürdürün.

9. Ortak bitiş noktası testleri

1. Uç nokta testleri için yongaların bağlantısını kesin
   1. Peristaltik pompayı duraklatın, talaşları pompadan dikkatlice ayırın ve talaş gövdesi taşıyıcılarını çıkarın. Talaş gövdesi taşıyıcılarını inkübatörden BSC'ye aktarın ve talaşları serbest bırakın.
   2. Herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için Open-Top Chip'in merkezi odasını epitel hücre kültürü ortamı ve vasküler kanalı endotel kültürü ortamı ile iki kez nazikçe yıkayın.
   3. Cımbız kullanarak çipin apikal bölmesine erişmek için Üstü Açık Çipin kapağını çıkarın.
2. Floresan mikroskopi için immün boyama
   1. Geleneksel numune fiksasyonu, geçirgenleştirme ve bloke etme ile devam edin.
      NOT: Bu çalışmada, örnekler 1 saat boyunca 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) içinde sabitlendi, ardından PBS ile durulandı, 40 dakika boyunca% 0.1 Triton X-100'de geçirgenlik ve 1 saat boyunca% 1 sığır serum albümininde bloke edildi.
   2. Cipsleri bir gecede 4 ° C'de birincil antikorlarla (Malzeme Tablosu) inkübe edin. ve daha sonra cipslerin hem epitel hem de endotel bölmelerini iki kez 200 μL PBS ile yıkayın. Ardından, 2 saat boyunca uygun ikincil antikorlarla devam edin.
      NOT: PBS +% 1 BSA'daki birincil antikorları ve ikincil antikorları 1:100 (birincil antikor) ve 1:200 (ikincil antikor) seyreltmede seyreltin.
3. İmmünohistokimya
   1. Stromal eşdeğerlerini cımbız kullanarak Open-Top Chip'in ana odasından çıkarın,% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş 1,5 mL'lik bir tüpe toplayın ve en az 24 saat boyunca inkübe edin.
   2. Sabit stromal eşdeğerini doku işlemcisine aktarın ve optimum numune dehidrasyonu elde etmek için aşağıdaki adımları izleyin.
      1. Hidrojeli 90 dakika boyunca% 70 etanol içine batırın.
      2. % 70 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 80 etanol içine batırın.
      3. % 80 etanol çıkarın ve hidrojeli 90 dakika boyunca% 95 etanol içine batırın.
      4. % 95 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 90 dakika boyunca% 100 etanol içine batırın.
      5. % 100 etanol çıkarın ve hidrojeli iki kez 120 dakika boyunca bir ksilen çözeltisine batırın.
      6. Ksilen çözeltisini çıkarın ve işlenmiş stromal eşdeğerlerini parafin mumunda iki kez 120 dakika (~ 2 saat) boyunca infiltre edin.
   3. Sızmış stromal eşdeğerleri parafin bloklarına yerleştirin.
   4. Bu noktada, stromal eşdeğerleri bir mikrotom kullanılarak parafin blokları olarak bölümlenebilir ve geleneksel histolojik tekniklere göre işlenebilir²⁶.

Results

Yüzey mikro desenleme
Hücre dışı matrisin (ECM) mikro modellemesi, bağırsak kript arayüzünün uzamsal konfigürasyonunu çoğaltmak için kullanılabilir. Open-Top Chip konfigürasyonu, kolonik epitel-stroma arayüzünün doğal topografyasını (Şekil 6A, B) ve bağırsak kriptolarını mikrometre ölçeğinde (Şekil 6C-E) taklit etmek için özel olarak tasarlanmış mikro desenli pulları entegre edecek şekilde de...

Discussion

Open-Top Chip, kontrollü bir mikro ortamda endotel, stroma ve epitel arasında meydana gelen karmaşık hücresel etkileşimi gerçek zamanlı olarak araştırmak için uygun bir platformu temsil eder. Bu teknoloji, akışkan kayma (akış), siklik germe ve mikrodesenleme yoluyla elde edilen epitel yüzey topografyasının yeniden yapılandırılması dahil olmak üzere insan dokusu mikroçevresini yeniden oluşturmakla ilgili fiziksel ve biyokimyasal ipuçlarının entegrasyonu gibi geleneksel organotipik ve organoid kültürlere göre krit...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x EMEM	Lonza	12-684F	Orta; Stroma
18 Ayar iğnesi	MicroGroup	316H18RW	Boru paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 18RW Tam Sert
19 Ölçer iğne	MicroGroup	316H19RW	Tüp paslanmaz çelik 316 kaynaklı, 19RW Tam Sert
2 Duraklı PharMed BPT	Cole-Palmer	EW-95723-12	Tüp, 0,25 mm, 12/paket
%70 etanol ve mendil	-	-	Yüzey sterilizasyonu için
8-Bromoadenosin 3&asal;,5′-siklik monofosfat sodyum tuzu (8-Br-cAMP)	Sigma	B7880	Orta takviye
A-83-01	Tokris	2939
Adenin	Sigma	A9795
İleri DMEM/F12	Termo	12634010
Havayolu Epitel Hücreleri	Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi	FC-0016
Alüminyum folyo	-	-	-
Alveolar hücreler	Hücre Biyolojikleri	H6621
Anti-ABCA3	ABCAM	AB24751	Fare monoklonal antikoru [3C9]
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647	ABCAM	ab215225	Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747]
Anti-Aquaporin5	ABCAM	ab92320	Tavşan monoklonal antikoru [EPR3747]
Anti-beta IV Tübülin	ABCAM	AB11315	Fare monoklonal antikoru [ONS.1A6]
Anti-CD31 (PECAM-1)	ABCAM	ab9498	Fare monoklonal [JC / 70A] antikoru
Anti-CK5	ABCAM	ab75869	Tavşan rekombinant monoklonal [AY1E6]
Anti-Sitokeratin 10	ThermoFisher	MA5-13705	Fare monoklonal antikoru (DE-K10)
Anti-Sitokeratin 14	ABCAM	ab7800	Fare monoklonal antikoru
Anti-E-Cadherin	ABCAM	AB1416	Fare monoklonal antikoru
Anti-Filaggrin	ThermoFisher	PA5-79267	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-HTI-56	Teras Biyoteknoloji	TB-29AHT1-56	Fare monoklonal antikoru (IgG1)
Anti-HTII-280	Teras Biyoteknoloji	TB-27AHT2-280	Fare monoklonal antikoru (IgM)
Anti-involucrin	ThermoFisher	MA5-11803	Fare monoklonal antikoru (SY5)
Anti-İzoformlar TA p63-&alfa;, -β, -&gama;	Biolengend	618902	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Ki67	ABCAM	AB8191	Fare monoklonal antikoru [B126.1]
Anti-LAMP3	ABCAM	ab111090	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Olgun SP-B	Yedi Tepe	WRAB-48604	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-MUC5AC	ThermoFisher	PA5-34612	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Müsin-2	SantaCruz Biyoteknoloji	sc-7314	Fare monoklonal antikoru (IgG1)
Anti-p63	Dako	GA662	Fare monoklonal antikoru p63 Proteini (Dako Omnis)  Klon DAK-p63
Anti-PCNA	ThermoFisher	PA5-32541	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Podoplanin (AT-1&alfa;)	ABCAM	ab128994	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Pro + Olgun Yüzey Aktif Madde Proteini B	ABCAM	ab40876	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Yüzey Aktif Madde C	Yedi Tepe	WRAB-9337	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-Uteroglobin / SCGB1A1	Hycult Biyoteknoloji	HM2178	Fare monoklonal antikoru [AY1E6]
Anti-VE-cadherin	ABCAM	AB33168	Tavşan poliklonal antikoru
Anti-ZO-1	ThermoFisher	33-9100	Fare monoklonal antikoru [1A12]
Askorbik asit	Sigma	A4544
Aspirasyon pipetleri	Corning / Şahin	357558	2 mL, polistiren, ayrı ayrı sarılmış
Aspirasyon ipuçları	-	-	Steril (otoklavlanmış)
PBS solüsyonunda B27	Termo	17504044
Engelleyici BSA (10X)	ThermoFisher	37525	Engelleyici ajan
Kalsiyum Klorür	Sigma	C7902
CHIR 99021	Tocris	4423
Kollajen I	İleri Biomatrix	5133	10 mg/mL (Stroma)
Kollajen I	Gelişmiş BioMatrix	5005	3 mg / mL (Vasküler ECM)
Kollajen IV	Sigma	C5533
Kollajen-IV	Sigma	C5533-5MG & nbsp;	İnsan plasentasından elde edilen kollajen, 5 mg toz, 1 mg / mL 'ye sulandırılır;
Kolon Fibroblastları	Hücre Biyolojikleri	H6231
Kolonik mikrovasküler endotel hücreleri	Hücre Biyolojikleri	H6203
Konik borular	-	-	15 mL ve 50 mL  polipropilen, steril ve nbsp;
Çapraz bağlayıcı (ER-1)	Öykünmek	10461	5 mg toz
DAPI (4',6-Diamidino-2-fenilindol, Dilaktat)	ThermoFisher	D3571	DNA probu
Dermal fibroblastlar	ATCC	PCS-201-010
Dermal mikrovasküler endotel hücreleri	ATCC	CRL-3243
Deksametazon	Sigma	D4902
DMEM	ThermoFisher	11054020
DMEM / F-12	GIBCO
DMEM / F-12, GlutaMAX ve nbsp;	GIBCO	10565-018	ALI ortamı için bazal ortam
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150105	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	AB175472	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Eşek Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150107	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 488)	ABCAM	ab150073	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 568)	ABCAM	AB175470	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Eşek Anti-Tavşan IgG H & L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	ab150075	Eşek Anti-Fare ikincil antikoru
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (Ca2+, Mg2+ olmadan)	Corning	21-031-CV	1x
Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) insan, E. coli'de rekombinant	PromoCell	C-60170	Orta takviyesi
F-12 Jambonu' s	Invitrogen	21700-108	Vasküler ECM
FibriCol	Gelişmiş BioMatrix	5133-20ML	Kollajen-I çözeltisi (10 mg / mL)
Fibronektin	Corning	356008
Fibronektin, İnsan, Doğal,	Corning	47743-654	insan plazma fibronektin
İnce uçlu hassas cımbız	Aven	18056ABD	Technik Style 5B-SA Hassas Paslanmaz Çelik Cımbız
Glutamax	Canlandırıcı	21700-108
Glutamax	Canlandırıcı
Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 594)	ABCAM	ab150080	Keçi Anti-Fare ikincil antikoru
Keçi Anti-Fare IgG H & L (Alexa Fluor 647)	ABCAM	AB150115	Keçi Anti-Fare ikincil antikoru
Keçi Anti-Fare IgG H & L (FITC)	ABCAM	ab6785 ve nbsp;	Keçi Anti-Fare ikincil antikoru
Keçi Anti-Fare IgG1 Alexa Fluor 568	ThermoFisher	A-21124	Keçi Anti-Fare IgG1 ikincil antikoru
Keçi Anti-Fare IgM Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21042	Keçi Anti-Fare IgM ikincil antikoru
El tipi vakum aspiratörü	Corning	4930	-
Isı ile İnaktive Edilmiş HyClone FetalClone II Serum (FCS)	GE Healthcare Yaşam Bilimleri	SH30066.03
Hemositometre	-	-	-
Domuz bağırsak mukozasından heparin sodyum tuzu	Sigma	H3149
HEPES	Thermo	15630080
İnsan [Leu15] - Gastrin	Sigma	G9145
Klinik rezeksiyonlardan		insan kolonoidleri	Klinik rezeksiyonlardan elde edilen
İnsan EGF Rekombinant Proteini	Termo	PHG0311L
insan epitelyal büyüme faktörü	Termo
HyClone FetalClone II Serum (ABD)	GE Sağlık	SH30066.02HI	Steril FBS  ısı inaktive edilmiş
Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzu	Sigma	H4881
Hidrokortizon	PromoCell	C-64420	Orta takviye
Buz kovası	-	-	-
Ismatec IPC-N	Cole-Palmer	EW-78000-41	Düşük Hızlı Dijital Peristaltik Pompa; q24-Kanal (12 Cips başına 1)
ITES	BioWhittaker	17-839Z
Keratinosit Büyüme Faktörü (KGF), Temel Fibroblast Büyüme Faktörü 7 (FGF-7) olarak da bilinir, insan, HEK	PromoCell	C-63821
Keratinositlerde	ATCC	PCS-200-010
Laminin	Biolamina	CT521-0501 ve nbsp;
Laminin, 521 CTG (CT521)	Biyolamina	CT521-0501 ve nbsp;	İnsan Rekombinant Laminin 521 &
Akciğer Fibroblast	Hücre Biyolojikleri	H6013
Akciğer Fibroblast	Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi	FC-0049
Akciğer mikrovasküler endotel hücreleri	Lonza	CC-2527
Akciğer düz kas hücreleri	Yaşam Hattı Hücre Teknolojisi	FC-0046
Manuel sayaç	-	-	-
Masterflex (TPE) Transfer Boruları	Cole-Palmer	FV-96880-02	PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32" OD
Orta 199, fenol kırmızısı	Thermo
Mikrosantrifüj tüpü	-	-	1.5 mL, steril
Mikroskop (kameralı)	-	-	Parlak alan görüntülemesi için
N2	Sigma	17502001
N-asetil sistein	Sigma	A5099
Noggin (HEK293T şartlandırılmış ortam)	Sigma	N17001
Normal Keçi Serumu	ThermoFisher	50062Z	Engelleme çözümü
O-fosgripanolamin	Sigma	P0503
Paraformaldehit (%4 ağırlıkça/hacim)	EMS	15710	Sabitleme maddesi
Penisilin Streptomisin	GIBCO	15140122
Penisilin-streptomisin	Sigma	P4333	10.000 U/mL; 10 mg/mL
Pipet uçları	-	-	P20, P200 ve P1000  steril, düşük yapışma
özelliğine sahip Pipet	Gilson	F167380	P20, P200 ve P1000
PluriQ Serum Replasmanı (veya alternatif olarak KO Serum replasmanı)	AMSBIO (veya Thermo)	N / A (veya C1910828010)
Poli-L-Lizin kaplı mikroskop cam slaytları ve nbsp;	Sigma	P0425	Cam kaydıraklar
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Progesteron	Sigma	P8783
ProLong Altın	ThermoFisher	P36931	DAPI ile Antifade Mountant
Retinoik Asit	Sigma	R2625
ROCK inhibitörü (Y27632)	Tocris	TB1254-GMP/10
R-spondin (HEK293T şartlandırılmış ortam)	Sigma	SCC111
SAGM SingleQuots takviyeleri	Lonza	CC-4124
SAGMTM Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı BulletKitTM	Lonza	CC-4124 ve nbsp;	Orta takviyeler
SB2001190	Tokris	1264/10
Serolojik pipetler	-	-	2 mL, 5 mL, 10 mL ve 25 mL düşük endotoksin, steril
Küçük Hava Yolu Epitel Hücre Büyüme ortamı (SAGM)	Lonza	CC-4124 ve nbsp;
Solvent Tamponu (ER-2)	Öykünmek	10462	25 mL şişe
Steriflip-HV	Kırlangıç SE1M003M00		Steril filtreleme konik tüp
Sterilin 100 mm Kare Petri Kapları	Thermo	103	Steril, 6 cips başına 1 adet
T25 şişeleri	-	-	-
T75 şişeleri	-	-	-
Tri-iyodotironin	Sigma	T5516
Triton X-100 (% 0.3 (hacim / hacim)	Sigma	T8787	Geçirgenleştirme ajanı
Tripan mavisi	Sigma	93595	% 0.4 çözelti
TrypEE çözümü	Sigma	12604013	Hücre ayırma solüsyonu
TWEEN-20	Sigma	P2287	Geçirgenleştirme ajanı
UV Işıklı Fırın (tepe frekansı 365nm, 100 ve mikro; J/cm2)	VWR	21474-598	UVP, Uzun Menzilli UV, 365 nm 60Hz Model CL-1000L
Vakum kurulumu	-	-	Minimum basınç: -70 kPa
Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü 165 (VEGF-165) insan, E. coli'de rekombinant	PromoCell	C-64420
VEGF-165	PromoCell	C-64420	Orta takviye
Von Willebrand Faktörü konjuge FITC	ABCAM	AB8822	Koyun poliklonal antikoru
Su banyosu (veya boncuklar)	-	-	37 & dereceye ayarlayın; C
Wnt3A (L-Wnt3A şartlandırılmış ortam)	ATCC	CRL-2647