$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Gelişim, organeller, hücreler ve organlar seviyelerindeki yapıların dinamik değişimi ile karakterize edilir. Hızlandırılmış görüntülemenin fizyolojik durumunda aynı yapıdan dört boyutlu bilgi toplama yeteneği, onu dinamik gelişim sürecini incelemek için ideal bir teknik haline getirir 1,2,3,4,5,6. Canlı görüntüleme yoluyla toplanan büyük miktarda veri, gelişimin nicel analizini de sağlar. Hızlandırılmış görüntüleme, tek katmanlı hücre kültürü için daha yaygın olarak kullanılmasına rağmen, üç boyutlu canlı dokuların veya hayvanların görüntülenmesi, canlı dokuların ışık saçılması, uygun bir montaj stratejisi ve etiketleme yöntemi geliştirme, kapsamlı bir görüntüleme süresi boyunca normal fizyolojik durumu koruma, uygun bir mikroskoba erişilebilirlik, ve saire. Bu zorluklar birçok laboratuvarda canlı görüntülemenin kullanımını kısıtlamaktadır. Bu yöntem koleksiyonunda, yedi makale yeni canlı numune hazırlama, etiketleme ve lazer tabanlı manipülasyon yöntemlerini bildirdi. Bu yöntemlerin tümü, gelişimsel süreçlerin farklı açılardan canlı olarak görüntülenmesini kolaylaştırır.
Derin bölgelerin doğrudan görüntülenmesi, canlı dokuların güçlü bir şekilde dağılması nedeniyle teknik olarak zordur. Bu saçılma, diseksiyon yoluyla iç organların açığa çıkmasıyla en aza indirilebilir, böylece görüntülerin uzamsal çözünürlüğü iyileştirilebilir. Bu koleksiyonda, Januschke ve Loyer7 , Drosophila larva beyinlerini incelemek için bir protokol ve Fibrin pıhtıları kullanan bir montaj yöntemi tanımladılar. Bu montaj stratejisi, yalnızca fibrinojen ve trombin eklenmesini gerektirdiğinden, aynı kap üzerinde birden fazla numunenin ters çevrilmiş mikroskopları kullanılarak hızlandırılmış görüntülemeye izin verdi. Li ve Luo8 , sinek pupalarından bir anten-beyin eksplantının diseksiyonu için bir protokol ve koku alma devresinin normal gelişimini 24 saat boyunca sürdüren bir ex vivo kültür koşulu sundu. Sistemleri, fizyolojik durumundan bir sinek koku alma devresinin montajında aksonal ve dendritik hedeflemenin görselleştirilmesini sağladı. Bu eksplant sistemi, uyarlanabilir optik tabanlı görüntülemeye sahip iki fotonlu mikroskop ve kafes ışık tabakası mikroskobu için uygundur ve kısa sürede hem uzun süreli sürekli görüntülemeye hem de yüksek uzay-zamansal çözünürlükle hızlı görüntülemeye olanak tanır. Schramm ve ark.9 zebra balığının derisini ve yumuşak kafatası kıkırdağını mikro peeling yoluyla çıkarmak için minimal invaziv bir cerrahi prosedür geliştirmişlerdir. Bu, nöronal farklılaşma, olgunlaşma, plastisite ve döllenmeden 30 gün sonrasına kadar geçiciCa2+ dahil olmak üzere daha sonraki gelişim aşamalarında bazı önemli olayları gözlemlemelerine izin verdi. Ayrıca zebra balığı larva derilerinin pigmentasyonundan sonra canlı görüntüleme yapmalarına da olanak sağladı. Diseksiyona ek olarak, numunelerin uygun şekilde yerleştirilmesi de canlı görüntüleme için çok önemlidir. Ratke ve ark.10 ışık tabakası mikroskobu kullanarak birden fazla sinek embriyosunun aynı anda canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeve sunmuşlardır. Bu protokol genel verimi artırdı ve karşılaştırmalı çalışma için idealdir.
Numune hazırlamaya ek olarak, yeni etiketleme yöntemleri canlı dokulardaki belirli yapıların görselleştirilmesini kolaylaştırır. Terzi ve ark.11, gelişim sırasında kültürlenmişzebra balığınöronlarından ve bütün larvalardan hücre içi H 2 O2 seviyelerini görüntülemek için genetik olarak kodlanmış bir H2O2 spesifik biyosensör olan roGFP2-Orp1 bildirmiştir. Bu genetik olarak kodlanmış H2O2 biyosensörün önemli bir avantajı, H2O2 tespitinin zamansal ve uzamsal çözünürlüğünün iyileştirilmesiydi. Mutlu ve ark.'nın12 yaptığı bir başka çalışmada, canlı hücrelerdeki lipidlerin hücre altı çözünürlükle hızlı ve kantitatif tespiti için etiketsiz bir kimyasal görüntüleme yöntemi olan uyarılmış Raman saçılımı (SRS) mikroskobu tanımlanmıştır. Hem H2O2 hem de lipitler, numune fiksasyonu sırasında kolayca kaybolur. Canlı dokuda etiketleme veya görüntüleme yöntemlerinin geliştirilmesi, yalnızca bu zorluğun üstesinden gelmekle kalmadı, aynı zamanda biyolojik süreçlerde bu yapıların mekansal ve zamansal bilgilerini de korudu.
Son olarak, hücre ablasyonu için ışık da kullanılabilir. Boutillon ve ark.13 , iki fotonlu bir mikroskop kullanarak zebra balıklarında derin ve uzamsal olarak iyi tanımlanmış hacimleri kesmek için bir yöntem gösterdi. Ultraviyole lazer tabanlı hücre ablasyonları ile karşılaştırıldığında, iki fotonlu lazer eksenel çözünürlüğü ve doku penetrasyonunu iyileştirdi. Bu protokol, gelişim sırasında hücre-hücre etkileşimini incelemek için bir pertürbasyon stratejisi sağladı.
Mikroskobik teknolojilerin ilerlemesi, birçok gelişim sürecini dört boyutlu olarak anlamamızı sağladı. Bu koleksiyondaki protokoller, daha fazla bilim insanının farklı biyolojik sistemlerde canlı görüntülemenin teknik engelini aşmasına yardımcı olacaktır. Gelecekte canlı görüntülemeyi kolaylaştıran daha fazla yöntemin geliştirileceğini öngörüyoruz.