Yöntem makalesi

Proteostaz Dengesizliklerini İzlemek için C. elegans'ı Kullanma

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64643

⸱

24 Ağustos 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

Bu makalede

Özet

Proteostaz ağı, proteom işlevselliğini sağlayan, hücresel ve organizma sağlığını destekleyen bir hücresel protein kalite kontrol sistemidir. Yaşla birlikte aslına uygunluğu azalır, bu da proteomun strese ve nihayetinde nörodejeneratif bozukluklar ve kanser gibi hastalıklara karşı savunmasızlığının artmasına neden olur. Bu evrimsel olarak korunmuş ağ üzerindeki araştırmaları vurgulamak için, Journal of Visualized Experiments (JoVE), proteostaz dengesizliklerini izlemek için C. elegans kullanan araştırmacıların bir dizi yöntemini sunar . Bu başyazı, hücresel, doku ve organizma seviyelerinde proteostaz ağını anlamak için bu farklı deneysel yaklaşımlara kısa bir genel bakış sağlar.

TARTIŞILAN MAKALELER:

Golden, N.L., Plagens, R.N., Kim Guisbert, K.S., Guisbert, E. Caenorhabditis elegans'ta ısı şoku tepkisinin indüksiyonunu ölçmek için standartlaştırılmış yöntemler. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. ve diğerleri. Nanoakışkan teknolojisi kullanılarak tek ve toplu C. elegans numunelerinde yüksek verimli kantitatif RT-PCR. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. ve diğerleri. C. Elegans'ta fizyolojik stres tepkilerinin ölçümleri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align ve Worm_CP, Caenorhabditis elegans'tan elde edilen floresan görüntü verilerinin düzleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için iki açık kaynaklı boru hattı. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M.I., Cornwell, A.B., Samuelson, A.V. Caenorhabditis elegans'ta dokuya özgü proteostatik düşüşün ölçülmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T.D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Dokuya özgü şaperon etkileşimlerini taramak için Caenorhabditis elegans'ın kullanılması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Sistemik stres sinyali için bileşenleri tanımlamak için dokuya özgü RNAi araçları. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M.L., Kirstein, J. Yaşlanan C. elegans'ta protein döngüsünün in vivo ölçümü fotokonvertibl dendra2 kullanılarak. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M.L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Floresan ömür boyu görüntüleme kullanılarak yaşlanan C. elegans'ta amiloid yapıların karakterizasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. C. elegans'ta RAN peptit toksisitesinin ölçülmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, M.L., Cooper, J., Grant, B.D., Driscoll, M. C. elegans'taki büyük ekzofer veziküllerinde in vivo nöronal agrega ve organel ekstrüzyonunun puanlanması için nicel yaklaşımlar. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

Editöryal

Protein homeostazı veya proteostaz, hücresel ve organizma sağlığı için temeldir 1,2. Korunmuş hücresel süreçler, protein sentezini, katlanmasını ve klirensini etkileyerek uygun şekilde katlanmış bir proteomu korumak için işbirliği yapar 3,4. Proteostazdaki bozulmalar yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar ve kanserlerle ilişkilendirilmiştir 5,6. Yüksek koruma düzeyine dayanarak, nematod Caenorhabditis elegans (C. elegans) gibi model organizmalar, proteostazın insan sağlığı ve hastalığındaki rolünün anlaşılmasında etkili olmuştur 7,8. C. elegans, kısa yaşam döngüsü, şeffaf kütikül ve kimyasal ve genetik manipülasyon kolaylığı dahil olmak üzere onu ideal bir deneysel model yapan birçok özelliğe sahiptir9. Bu yöntem koleksiyonu, C. elegans'ta moleküler, hücresel ve organizma düzeyinde proteostaz dengesizliklerini izlemek için ayrıntılı protokoller sağlar.

Hücreler, hücresel proteomu10 yeniden ayarlamak için ısı şoku tepkisi (HSR), katlanmamış protein tepkisi (UPR) ve oksidatif stres tepkisi (OxSR) dahil olmak üzere çeşitli stres tepkilerini aktive ederek proteostazdaki bozulmalara yanıt verir. Sahada tekrarlanabilirliği artırmak için, HSR'nin sağlam indüksiyonu için standartlaştırılmış uygulamalar Golden ve meslektaşları11 tarafından açıklanmaktadır. RT-qPCR, mRNA'yı ölçerek gen ekspresyonunu analiz etmek için yaygın olarak kullanılan, hassas bir yöntemdir ve bu tahlil, çeşitli ısı şoku ile indüklenebilir genlerin hücresel mRNA seviyelerini ölçmek için kullanılabilir11. Bu yaklaşımı büyük ölçekli, yüksek verimli analize genişletmek için Chauve ve ark.12, sağlam ve oldukça hassas bir nanoakışkan RT-qPCR platformuna bağlı cDNA hazırlığı için yeni bir adaptasyon tanımlamaktadır. Gen ekspresyonunun hassas ölçümleri, tek solucanlar veya toplu numuneler12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Stres tepkisi genlerinin transkripsiyonel yukarı regülasyonunu ölçmek için primer çiftleri ile birlikte önerilen stres tepkisi gen hedefleri, ilgili protokollerde12,13 listelenmiştir.

Stres tepkilerinin aktivasyonunu değerlendirmek için RT-qPCR kullanmanın bir sınırlaması, pahalı, teknik olarak zor olabilmesi ve özel ekipman kullanımını gerektirmesidir. Bu nedenle, stresle indüklenebilir bir promotör altında bir floresan proteini eksprese eden yola özgü transkripsiyonel raportör suşları (örneğin, HSR'yi izlemek için hsp-16.2p::gfp), hücresel stres tepkilerini değerlendirmek için sıklıkla kullanılır11. Okkenhaug ve meslektaşları, CellProfiler boru hattı Worm_CP ile birleştirilmiş Worm-align adlı basit bir açık kaynaklı Fiji tabanlı iş akışı kullanarak, tek tek solucanlardan floresansı hızlı bir şekilde ölçmek için14 adımı özetliyor. Ek olarak, Bar-Ziv ve ark.13, binlerce hayvan için floresan yoğunluğunun, boyutunun ve uzamsal (2D) dağılımının yakalanmasını sağlayan büyük parçacıklı bir akış sitometresi kullanan yüksek verimli bir yöntem tanımlamaktadır. Bir solucan biyosıralayıcı kullanılarak floresan mikroskobu ve niceleme için önerilen ayarların yanı sıra hücresel stres tepkilerinin aktivasyonunu değerlendirmek için transkripsiyonel raportörler hakkında bilgi verilmektedir13. Daha da önemlisi, bu muhabirler, belirli bir stres rejimini takiben bir hayvanın sağlığını izleyen spesifik fizyolojik stres hayatta kalma deneyleri ile eşleştirilebilir 11,13. Floresan muhabirler, dokuya özgü farklılıkları ortaya çıkarma avantajına sahip olsalar da, yalnızca belirli bir eşiğin üzerindeki indüksiyonu tespit edebilirler ve GFP gibi belirli floroforların stabilitesi, gen ekspresyonundaki dinamik varyasyonların saptanmasını engeller. Ayrıca, çoğu fizyolojik tahlil zaman alıcıdır ve bu nedenle sınırlı ölçeklenebilirliğe sahiptir. Bu sınırlamalara rağmen, bu yöntemler iç ve dış stres faktörlerinin hücresel ve fizyolojik etkilerinin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine olanak tanır.

Kronik proteotoksik bozulmalar, fonksiyonel bir proteom 5,6'nın korunmasından sorumlu kalite kontrol mekanizması olan proteostaz ağının (PN) çökmesi ile ilişkilidir. Proteostazda ilerleyici düşüş, yaşa bağlı birçok hastalıkta rol oynamaktadır. C. elegans, belirli dokuların proteostaz başarısızlıklarına karşı savunmasızlığını incelemek için harika bir model sistemdir. Lazaro-Pena ve ark.15 solucan yaşlandıkça vücut duvarı, kas veya nöronal işlevselliği izlemek için bir yaklaşım tanımlamaktadır. Bu yaklaşım, daha yüksek verimli genetik analiz veya ilaç taraması için uyarlanabilir15. En büyük zorluk, PN'nin çeşitli bileşenleri arasındaki etkileşimlerin in vivo olarak nasıl çalıştığını anlamaktır. Bu eksikliği gidermek için Dror ve meslektaşları16, PN'nin temel bileşenleri olan moleküler şaperonların gelişim ve yaşlanma sırasında belirli dokulardaki etkileşimleri hakkında spesifik bilgi toplamak için bir sistem geliştirdiler. Hedef genlerin RNAi tarafından dokuya özgü susturulmasını sağlayan mevcut mutantlar veya transgenik suşlarla dokuya özgü katlama dengesi bozulmalarını birleştirerek, belirli bir dokudaki şaperon ağı incelenebilir. Bu stratejiyi, belirli dokuların veya hücre tiplerinin işlevselliğini değerlendiren basit davranışsal tahlillerle tamamlamak, PN'nin in vivo 15,16'nın biyolojik olarak ilgili etkileşimlerini ortaya çıkarabilir. Bir doku veya hücre tipindeki proteostaz dengesizliklerinin, hücre özerk olmayan bir şekilde ek dokuların kalite kontrol sistemini etkileyebileceğini kabul etmek önemlidir. Miles ve van-Oosten-Hawle17, bir dizi stres raportörü ve proteostaz sensörü17 ile birleştirilmiş dokuya özgü RNAi yaklaşımlarını kullanarak hücre-otonom olmayan PN'nin mekanizmalarını ve bileşenlerini tanımlamak için bir yaklaşım tanımlamaktadır. Bu strateji, hücrenin otonom olmayan aktive stres yanıt mekanizmalarının bir sonucu olarak farklı dokulardaki PN kapasitesinin incelenmesine izin verir.

C. elegans, Huntington hastalığı18 gibi poliglutamin tekrar genişleme mutasyonlarının neden olduğu yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıkları modellemek için yaygın olarak kullanılır. Yoğun olarak kullanılan bir proteostaz sensörü, poliQ uzunluğuna ve19 yaşına bağlı olarak in vivo odaklar oluşturan bir floresan proteine kaynaşmış bir poliglutamin (polyQ) fragmanıdır. Biyolojik deneylerde, bireyler arasında ve laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliğin iyileştirilmesi, neyin odak olarak puanlandığının tanımlanmasını gerektirir. Lazaro-Pena ve ark.15 yaşlanma sırasında nöronlarda veya vücut duvarı kaslarında poliQ::YFP odaklarının oluşumunu doğru bir şekilde ölçmek için bir strateji tanımlamışlardır. Bir poliglutamin genişlemesi taşıyan agregasyona eğilimli mutant huntingtin proteininin devir hızlarını izlemek için Pigazzini ve Kirstein20, fotokonvertibl florofor Dendra2'nin kullanımını gerektiren noninvaziv bir teknik tanımlamaktadır. Konfokal mikroskopi ve Dendra2'ye kaynaşmış mutant huntingtin'i eksprese eden bir C. elegans suşu kullanarak, yaşlanan bir organizmada20 bu agregasyona eğilimli proteinin bozunmasını izlemek ve ölçmek mümkündür. Mutant huntingtin gibi agregasyona eğilimli proteinlerin amiloid fibrilizasyonunu ölçmek için floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) kullanılabilir21. FLIM, floroforların amiloid yapılarına yakın bir yerde söndürülmesini izleyerek agregasyon sürecinin noninvaziv analizini sağlar, böylece floresan ömrünüazaltır 21. Floresan ömrü, kaynaşmış amiloid proteininin agregasyonu ile negatif korelasyon gösterir ve florofor ekspresyon seviyelerinden bağımsızdır. Bu teknik, bir araştırmacının yaşlanmanın ve PN bozukluğunun herhangi bir proteinin agregasyon eğilimi üzerindeki etkilerini izlemesine olanak tanır. Bununla birlikte, floroforun yoğunluğu düşükse, FLIM nispeten çok sayıda fotonun elde edilmesini gerektirdiğinden bu sorunlu hale gelebilir. Bu nedenle, daha hızlı ışıkla ağartmaya ve güvenilmez bir bozunma eğrisine yol açan daha yüksek bir uyarma lazer gücüne ihtiyaç vardır. Ayrıca teknik, önceden var olan mikroskopi sistemlerine ek olarak karmaşık ve maliyetli ekipman gerektirir. Tekrar açılımları içeren RNA ile ilişkili tekrarla ilişkili AUG'ye bağımlı olmayan (RAN) translasyonu araştıran farklı bir protokol için önemli bir standartlaştırılmış yaklaşım dahil edilmiştir. RAN çevirisi, okuma çerçevesini belirlemek için bir başlangıç kodonu gerektirmediğinden, hastalıkla ilişkili olası toksik peptitlerin sayısı artar. Rudich ve meslektaşları22, C. elegans hareketi ve üremesi kullanılarak RAN peptit toksisitesinin nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılar sağlar.

Proteostazdaki dengesizlikler, proteinin yanlış katlanmasına ve yaşa bağlı çoklu nörodejeneratif hastalıklarla bağlantılı protein agregatlarının birikmesine yol açar 5,6. C. elegans suşları, floresan raportörlere kaynaşmış çeşitli agregasyona eğilimli proteinleri eksprese ederek, farklı hücre ve doku tiplerinde proteostaz dengesizliklerini izlemek için kullanılmıştır. Bu modellerin analizi bir dizi yeni gözleme yol açmıştır; Monica Driscoll ve meslektaşları, nöronların PolyQ agregatlarını ve hasarlı organeller gibi diğer hücresel kalıntıları "ekzoferlerde" serbest bıraktığını ve nöronal proteostazın23'ün daha önce tanınmayan bir dalını ortaya çıkardığını fark ettiler. Bu yeni bir olgu olduğundan, sahada tekrarlanabilirliği sağlamak amacıyla eksopher üretiminin izlenmesine yönelik net talimatların sağlanması çok önemlidir. Arnold ve ark.24, C. elegans ekzoferlerinin fiziksel özelliklerini, tespit stratejilerini, tanımlama kriterlerini ve miktar tayini için en uygun zamanlamayı özetlemektedir. Ayrıca, bu protokol, ekzofer üretiminin tekrarlanabilir bir değerlendirmesini elde etmek için eksoper seviyelerini modüle edebilen istenmeyen stresleri ortadan kaldırmak için büyüme koşullarını sıkı bir şekilde kontrol etmek için gereken kritik dikkati vurgulamaktadır.

Bu koleksiyon, C. elegans'ta moleküler, hücresel ve organizma düzeyinde proteostaz dengesizliklerini izlemek için birden fazla metodolojik strateji sağlar. Yanlış katlanmış hastalık proteinleri gibi stres etkenleri, belirli doku tiplerine deneysel olarak dahil edilebilirken, proteotoksisiteye hücresel ve organizma tepkisi zaman içinde izlenir. Bu koleksiyon, proteostazın araştırılması ve izlenmesi, katlanmış bir proteomu koruyan kalite kontrol sistemlerinin değerlendirilmesi ve hastalığa yol açan bu sistemlerin düzensizliğinin araştırılması için bir araç seti sağlar.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Bu metot koleksiyonuna çok değerli katkıları olan meslektaşlarımıza teşekkür ederiz.

Kaynaklar

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  2. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475 (7356), 324-332 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (11), 777-788 (2010).
  4. Vilchez, D., Saez, I., Dillin, A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases. Nature Communications. 5, 5659(2014).
  5. Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
  6. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (5), 004440(2011).
  7. Caldwell, K. A., Willicott, C. W., Caldwell, G. A. Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Disease Model Mechanism. 13 (10), (2020).
  8. Brehme, M., et al. A chaperome subnetwork safeguards proteostasis in aging and neurodegenerative disease. Cell Reports. 9 (3), 1135-1150 (2014).
  9. Girard, L. R., et al. WormBook: the online review of Caenorhabditis elegans biology. Nucleic Acids Research. 35, 472-475 (2007).
  10. Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cellular stress response pathways and ageing: intricate molecular relationships. The EMBO Journal. 30 (13), 2520-2531 (2011).
  11. Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (161), e61030(2020).
  12. Chauve, L. High-throughput quantitative RT-PCR in single and bulk C. elegans samples using nanofluidic technology. Journal of Visualized Experiments. (159), e61132(2020).
  13. Bar-Ziv, R., et al. Measurements of physiological stress responses in C. Elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61001(2020).
  14. Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align and Worm_CP, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (159), e61136(2020).
  15. Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantifying tissue-specific proteostatic decline in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (175), e61100(2021).
  16. Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Using Caenorhabditis elegans to screen for tissue-specific chaperone interactions. Journal of Visualized Experiments. (160), e61140(2020).
  17. Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Tissue-specific RNAi tools to identify components for systemic stress signaling. Journal of Visualized Experiments. (159), e61357(2020).
  18. Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods Enzymology. 412, 256-282 (2006).
  19. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10417-10422 (2002).
  20. Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In vivo quantification of protein turnover in aging C. elegans using photoconvertible dendra2. Journal of Visualized Experiments. (160), e61196(2020).
  21. Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Characterization of amyloid structures in aging C. elegans using fluorescence lifetime imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), e61004(2020).
  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Proteostasis NetworkProtein Quality ControlNeurodegenerative DisordersCellular HealthHeat Shock ResponsePhysiological Stress ResponsesTissue-specific ProteostasisRNAi ToolsProtein TurnoverPhotoconvertible Dendra2Experimental Approaches
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.