Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Prenatal etanol maruziyeti, fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD^{) olarak} adlandırılan yapısal eksikliklerin ve bilişsel bozuklukların sürekliliğine yol açar1,2,3,4. Birden fazla faktör arasındaki karmaşık ilişkiler, insanlarda FASD'nin etiyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırmaktadır. Bu zorluğu çözmek için çok çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu modellerde bulunan biyolojik ve deneysel araçlar, etanol teratojenitesinin mekanik temeli hakkındaki anlayışımızı geliştirmede çok önemli olduğunu kanıtlamıştır ve bu model sistemlerinden elde edilen sonuçlar, insan etanol çalışmalarında bulunanlarla oldukça tutarlıdır ^5,6. Bunlar arasında, zebra balığı, kısmen dış döllenmeleri, yüksek doğurganlıkları, genetik izlenebilirlikleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle etanol teratogenezi ^7,8'i incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu güçlü yönler, zebra balığını, transgenik zebra balığı hatlarını kullanarak FASD'nin gerçek zamanlı canlı görüntüleme çalışmaları için ideal hale getirmek için bir araya gelir.

Transgenik zebra balığı, embriyonik gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır⁹. Bununla birlikte, transgenik yapılar ve müteakip transgenik çizgiler oluşturmak son derece zor olabilir. Standart bir transgen, transgeni ve bir poli A sinyalini veya "kuyruğunu" sürmek için aktif bir promotör eleman gerektirir, bunların hepsi genel vektör bakımı için kararlı bir bakteriyel vektördedir. Çok bileşenli bir transgenik yapının geleneksel üretimi, çok zaman alıcı alt klonlama adımları gerektirir¹⁰. Gibson montajı gibi PCR tabanlı yaklaşımlar, alt klonlama ile ilgili bazı sorunları atlatabilir. Bununla birlikte, her benzersiz transgenik yapı^10'un üretimi için benzersiz astarlar tasarlanmalı ve test edilmelidir. Transgen yapımının ötesinde, genomik entegrasyon, germline iletimi ve uygun transgen entegrasyonu için tarama da zor olmuştur. Burada, transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini (Tol2Kit) kullanmak için bir protokol ^{açıklıyoruz10,11}. Bu modüler sistem, sürekli genişleyen "giriş" ve "hedef" vektörleri kütüphanesinden hızlı bir şekilde çoklu transgenik yapılar oluşturmak için çok bölgeli Ağ Geçidi klonlamasını kullanır. Entegre Tol2 transpoze edilebilir elementler, transgenez oranını büyük ölçüde artırarak, çoklu transgenlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasına ve genomik entegrasyonuna izin verir. Bu sistemi kullanarak, bir endoderm transgenik zebra balığı hattının oluşturulmasının, FASD'nin altında yatan dokuya özgü yapısal kusurları incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Nihayetinde, bu protokolde, modüler kurulumun ve transgenik yapıların inşasının zebra balığı tabanlı FASD araştırmalarına büyük ölçüde yardımcı olacağını gösteriyoruz.

Bu prosedürde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, belirlenmiş IACUC protokolleri^12'ye uygun olarak yetiştirildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu çalışmada vahşi tip zebra balığı suşu AB ve bmp4^st72;smad5^b1100 çift mutant hattı kullanılmıştır. Bu işlemde kullanılan suyun tamamı steril ters ozmoz suyuydu. Konfokal görüntüler lazer taramalı konfokal mikroskop altında alındı. Endoderm ölçümleri ImageJ'deki ölçüm aracı kullanılarak yapıldı. Tüm istatistiksel analizler istatistiksel yazılımlar kullanılarak yapıldı.

1. Çözümlerin ve medyanın oluşturulması

1. Bakteriyel ortam: LB suyunu veya agar'ı üreticinin talimatlarına göre çözün ve otoklavlayın. Ortamı 100 mm Petri kaplarına dökmeden önce, ampisilin (50 μg / mL), kanamisin (50 μg / mL) veya bir ampisilin / kloramfenikol kombinasyonu (sırasıyla 50 μg / mL ve 30 μg / mL) ekleyin.
2. 20x embriyo ortam stoğu yapmak için, aşağıdakileri 1 L suda çözün: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl, 2.9 g CaCl 2, 0.41 g K 2 HPO 4, 0.142 g Na 2 HPO 4 ve 4.9 g MgSO₄ · 7H ₂O. 0.22 μm vakum filtrasyon sistemi kullanarak stok çözeltisini filtreleyin-sterilize edin, ve 4 °C'de saklayın.
   NOT: Oluşan beyaz çökeltiyi yok sayın; bu medyayı etkilemeyecektir.
3. 19 L suda, 1.2 g NaHCO_3'ü çözün ve çalışan embriyo ortamı çözeltisini oluşturmak için 20x embriyo ortamı stoğunun 1 L'sini ekleyin ve bu çözeltiyi 28 ° C'de tutun.
4. % 2 fenol kırmızısı çözeltisi için, 20 mg fenol kırmızı sodyum tuzunu 1 mL RNaz içermeyen suda çözün ve oda sıcaklığında saklayın.

2. Embriyo enjeksiyon kalıpları

1. Agaroz enjeksiyon plakasını yapmak için, agarozu embriyo ortamında kaynatarak son konsantrasyona% 3'lük bir konsantrasyona kadar çözün.
2. 100 mm Petri kaplarına 50 mL agaroz dökün ve agaroz hala sıvı iken, kalıbın altında kabarcık oluşumunu önlemek için enjeksiyon kalıbını agarozun içine yavaşça yerleştirin.
3. Agaroz plakalarını soğumaya bırakın. Agaroz katı hale geldiğinde, enjeksiyon kalıbını çıkarın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

3. Enjeksiyon pipetleri

1. Filament içeren 1,0 mm (OD) kılcal damarları, solenoid değeri 2,5 ve ısıtma elemanı 14,6 olarak ayarlanmış dikey bir pipet çektirici kullanarak iğnelere çekin.
   NOT: Isıtılmış herhangi bir çektirme, kılcal damarları temiz ve eşit bir şekilde iki iğneye çekerse işe yarayacaktır, ancak tutarlı enjeksiyon sonuçları için enjeksiyon iğnelerinin, zebra balığı embriyolarına enjekte edildikten sonraki 1 hafta içinde çekilmesi gerekir.
   1. Kılcal damarı çektiriciye yerleştirin, kelepçeyi her iki ucundan sıkın ve ardından ısıtma elemanını etkinleştirin.
   2. İki enjeksiyon iğnesi oluşturmak için kılcal damarları çekin.
   3. Kılcal damarları çektirmeden çıkarın ve iğne tutucu olarak işlev gören bir modelleme kili şeridi ile boş bir Petri kabında saklayın.

4. Transpozaz mRNA preparatı

1. Aşağıdakileri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek Transpozaz içeren Tol2Kit plazmidini NotI kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın: 10 μL transpozaz plazmidi (150 ng / μL), 1,5 μL kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu, 0,3 μL NotI endonükleaz.
2. 20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından gece boyunca 37 ° C'de karıştırın ve sindirin.
3. Sindirim reaksiyonuna 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH₄OAc ve 80 μL 0 EtOH ekleyerek transpozaz sindirimini durdurun ve ardından gece boyunca -20 °C'de karıştırın ve soğutun.
4. Çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve DNA peletini RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
5. Bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin (ng / μL), önce RNaz içermeyen bir su boşluğunun 2 μL'sini çalıştırarak ve ardından doğrusallaştırılmış plazmidin 2 μL'sini çalıştırarak.
   NOT: Plazmid konsantrasyonları tipik olarak 100-200 ng/μL arasında değişmektedir
6. Aşağıdaki bileşenleri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sırayla birleştirerek SP6 mRNA üretimini ayarlayın: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,1-1 μg doğrusal DNA şablonu ve 2 μL SP6 enzim karışımı.
7. 20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından 2 saat boyunca 37 ° C'de karıştırın ve inkübe edin.
8. 2 saat boyunca inkübe ettikten sonra, 1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika daha inkübe edin.
9. SP6 reaksiyonunu durdurmak için, reaksiyon tüpüne 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin ve ardından gece boyunca -20 ° C'de karıştırın ve soğutun.
10. mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve mRNA peletini 1 mL% 80 EtOH (RNaz içermeyen su ile seyreltilmiş) ile yıkayın.
11. mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 14.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatanı aspire edin. Peletin hava ile kurumasını bekleyin.
12. mRNA peletini 20 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın, adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram (ng / μL) cinsinden mRNA konsantrasyonunu belirleyin (en az 100 ng / μL olmalıdır), tek kullanım için tüp başına 100 ng mRNA aliquot ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: mRNA'nın bozulmadığından emin olmak için, 1.950 bps'de tek bir bandı doğrulamak için bir DNA elektroforez jeli üzerinde 2 μL mRNA hızlı bir şekilde çalıştırılabilir.

5. Transgenez için giriş vektörleri oluşturmak için Multisite Gateway klonlama

NOT: Bu protokol Kwan ve ^ark.10'dan modifiye edilmiştir, LR reaksiyonu yarı-LR reaksiyonu olarak yazılmıştır ve toplam hacim 5 μL'dir. Yeni giriş elemanları üretmek için, 5', orta ve 3' donör vektörleri kullanan BP reaksiyonlarının^10,13 kullanılması gerekir.

1. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, p5E, pME ve p3E'nin her biri 10 fmol ve hedef vektörün (pDest) 20 fmol'ünü toplayın.
   NOT: Çok bölgeli LR rekombinasyonu dört farklı plazmid vektörü kullanır: zebra balığı embriyolarına enjekte edilmeye hazır Tol2 tekrarları ile çevrili benzersiz bir transgenik yapı oluşturmak için bir 5' giriş vektörü (p5E), bir orta giriş vektörü (pME), bir 3' giriş vektörü (p3E) ve bir hedef vektör (pDest).
   1. Plazmid kaynağından baz çiftlerindeki dört vektörün tümünün boyutunu tanımlayın (Tablo 1, Tol2Kit Wiki sayfa¹⁴ veya Addgene¹¹; Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Yeni vektörler için, ticari dizileme şirketleri aracılığıyla tam plazmid dizileme, bps cinsinden tam plazmid boyutunu sağlayabilir.
   2. Adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre (ng / μL) başına nanogram cinsinden dört vektörün konsantrasyonunu belirleyin.
   3. DNA'nın ağırlığını 660 g / mol ve plazmid boyutunu (bps cinsinden) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramını (ng) hesaplayın.
      
      NOT: Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Mosimann laboratuvarı, LR reaksiyonu^15'te ihtiyaç duyulan vektörlerin ihtiyaç duyulan plazmid miktarını (ng cinsinden) ve hacmini (μL cinsinden) hesaplamak için serbestçe kullanılabilen bir elektronik tablo oluşturmuştur.
2. Aşağıda açıklanan sox17 :EGFPCAAX yapısını oluşturmak için aşağıdaki vektörleri kullanın: zebra balığı sox17 promotörünü içeren ve¹⁶ boyutunda 6.918 bp olan bir p5E vektörü; ¹⁰ boyutunda 3.345 bp olan prenylated EGFP'yi içeren bir pME vektörü; SV40 geç poli A sinyal dizisini içeren bir p3E vektörü,^{boyut 10'da} 2.838 bp'dir; ve¹⁰ boyutunda 5.883 bp olan pDest.
3. Adım 5.1.2'de belirlenen plazmid konsantrasyonunu ve her vektör için nanogram (ng) cinsinden miktarı (adım 5.1.3) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini (μL) hesaplayın ve ardından bunu 5 μL yarı LR reaksiyonlarında kullanılmak üzere ikiye bölün (aşağıda listelenen tüm değerler Tablo 2'de listelenmiştir).
   
   1. 10 fmol p5E-sox17 üretmek için 45.66 ng (140.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.65 μL elde etmek için steril suyla 4 faktörü ile seyreltin.
   2. 10 fmol pME-EGFPCAAX üretmek için 22.08 ng (213.5 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.52 μL elde etmek için steril suyla 10 faktörü ile seyreltin.
   3. 10 fmol p3E-poli A üretmek için, 15.73 ng (276.1 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.57 μL elde etmek için steril suyla 20 kat seyreltin.
   4. Hedef vektörün 20 fmol'ü için, 77.66 ng pDest (307.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 1.63 μL elde etmek için steril suyla 5 faktörü ile seyreltin.
4. 5 μL yarı-LR reaksiyonu kurmak için, adım 5.3'te belirlenen p5E, pME, p3E ve pDest hacimlerini 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve ardından toplam 4 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için steril su ekleyin.
5. Doğru karıştırmayı sağlamak için LR enzim karışımını her biri 1 dakika boyunca 2 kez kuvvetlice vorteksleyin ve ardından reaksiyona 1 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
6. Gece boyunca 25 ° C'de inkübe edin (16+ saat).
7. LR reaksiyonunu 0,5 μL proteinaz K (2 μg/μL) ekleyerek durdurun, 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından oda sıcaklığına soğutun.
8. 3-4 μL plazmidi, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25-30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş, kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.
9. Hücreler buz üzerinde otururken, iki LB-ampisilin agar plakasını oda sıcaklığına ısıtın.
10. 42°C'lik bir su banyosundaki hücreleri tam olarak 30 sn boyunca ısıl şokla geçirin.
11. Isı şokundan sonra, hücrelere 250 μL antibiyotiksiz, zengin sıvı ortam ekleyin ve 1.5 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayarak inkübe edin.
12. Bir ampisilin plakasına 300 μL bakteri yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
13. Ertesi sabah, kolonileri berrak ve opak iki fenotipin varlığı açısından tarayın, berrak kolonileri (Kwan ve ^ark.10'da açıklandığı gibi) birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve ardından gece boyunca 37 ° C'de sallayın.
    NOT: Berrak koloniler neredeyse her zaman doğru LR kolonisini içerir (zamanın %>85'i).
14. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit kullanarak, her sıvı kültüründe bir plazmid hazırlığı yapın ve LR ağ geçidi reaksiyonunun düzgün çalıştığını gösteren transgenik yapının uygun boyutunu doğrulamak için her plazmidi tanısal olarak sindirin.
15. Plazmidin 0.5-1 μL'sini kullanarak 5.4-5.12 adımlarında açıklandığı gibi standart bakteriyel transformasyon protokolünü kullanarak doğru transgenik yapıları yeniden dönüştürün ve sadece 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
16. Kolonileri yeniden çizin ve her birinin adım 5.14'teki gibi LR transgenik yapısına sahip olduğunu onaylayın.
17. Adım 4.5'te açıklandığı gibi plazmid konsantrasyonunu belirleyin (embriyo enjeksiyonu için en az 150 ng / μL gereklidir).

6. Transgenin embriyolara enjeksiyonu

1. Tek kullanımlık bir transpozaz mRNA örneğini ve Tol2 transgenik yapısını buz üzerinde çözün ve bir agaroz enjeksiyon plakasını oda sıcaklığına önceden uyarın.
2. Aşağıdakileri buz üzerinde birleştirin: 150 ng plazmid, 100 ng transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısı (0.3 μL). Ardından, hacmi 3 μL'ye çıkarmak için RNA'sız su ekleyin.
3. Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyolarını, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına (adım 2'de tarif edilmiştir) aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50-75 embriyoyu hafifçe bastırın.
4. mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin, kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon teçhizatını açın.
   NOT: Enjeksiyon teçhizatı, aktive edildiğinde mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımının istenen hacmini (adım 6.5'te açıklanmıştır) embriyoya atmak için hava gibi sıkıştırılmış gaz kullanır.
5. Kılcal iğneyi enjeksiyon plakasının EM'sine indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın.
6. Embriyoları, mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının küçük bir 3 nL bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin.
   NOT: 3 nL'lik bir bolus, yedi bolusun teorik olarak embriyonun orta çizgisi boyunca eşit olarak sığabileceği bir mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımı hacmidir.
7. Embriyoları enjekte etmeyi bitirdiğinizde, yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve taze EM (yaklaşık 40 mL) ile 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve daha sonra embriyoların gelişmesine izin vermek için 28.5 ° C'de inkübe edin.

7. Transgenik yerleştirme için embriyoların taranması

1. Floresan proteinlerinin ekspresyonu için, floresan transgeninin eksprese edilmesi gereken uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında floresan varlığını tarayın.
   NOT: Bu embriyolar ifadelerinde mozaik olacak ve transgenik yapının genomik bir yerleşimini gösterecektir.
2. Floresan olmayan transgenleri tarayarak, cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP veya farklı hedef vektörlerde bulunan αcyrstallin'in lense özgü promotörü tarafından tahrik edilen mCherry gibi floresan olmayan transgenleri (adım 7.1'de açıklandığı gibi) tarayarak tarayın.
3. Transgenik yerleştirme için pozitif embriyoların yetişkin zebra balığı aşamalarına tamamen gelişmesine izin verin.
4. Potansiyel transgenik balıklar üreme çağına ulaştığında, vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek hem germline iletimi hem de transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın.
5. Embriyoları normal olarak gelişen ve en güçlü ve en uygun transgen ekspresyonunu veren yetişkinler, gelecekteki çalışmalar ve analizler için benzersiz transgenik zebra balığı çizgileri olarak tutulur.
   NOT: Transgenik yapıların genomik yerleştirilmesi için taramaya alternatif bir yaklaşım olarak, vahşi tip DNA'yı değil, sadece transgenik yapıyı güçlendiren PCR primerleri tasarlayın.

Transgenik yapıları oluşturmak için Tol2 transgenez sistemini kullandık. Gen promotör/arttırıcı elementleri tutan p5E, promotör/arttırıcı elementler tarafından ifade edilecek geni tutan pME ve en azından poliA kuyruğunu tutan p3E dahil olmak üzere üç giriş vektörü, çok bölgeli ağ geçidi LR klonlaması yoluyla transgenik yapıyı oluşturmak için kullanıldı. Hedef vektör pDest, zebra balığı embriyolarında transgenik yapının genomik yerleştirilmesi için Tol2 tekrarlarını sağlar ve bakteri büyümesi için gerekli tüm genetik bilgileri içerir (Şekil 1A). Bu makalenin amaçları doğrultusunda, bir sox17:EGFPCAAX transgenik yapısı oluşturduk ve enjekte ettik. Endoderm belirtecinin promotörü olan sox17, zebra balığının gelişmekte olan endoderminde membran etiketli EGFP'yi sürmek için kullanıldı. Florofor olmayan proteinleri eksprese eden transgenik yapılar için, cmlc2: EGFP gibi floresan transgenik bir belirteç içeren bir pDest vektörü, genomik yerleştirmeye yardımcı olmak için kullanılabilir (Şekil 1A).

Yukarıdaki protokolde açıklanan değerler kullanılarak (Tablo 2), sox17: EGFPCAAX transgenik yapısı üretildi ve bu yapının 4 μL'si kimyasal olarak yetkin Escherichia coli hücrelerine dönüştürüldü. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edildikten sonra, agar plakası yaklaşık 250 koloni içeriyordu (LR reaksiyonları tipik olarak laboratuvarımızda plaka başına ortalama 150-300 koloni). Bu kolonilerin taranması opaklığa dayalı olarak yapıldı. Ellerimizde, berrak olan koloniler doğru sox17: EGFPCAAX ürününe sahipti >zamanın% 85'i, opak koloniler ise hiçbir zaman doğru rekombinasyon ürününü içermedi (Şekil 1B, ok ucuna karşı ok). Plazmidi birkaç koloniden izole ettikten sonra, rekombinant ürünlerin kısıtlama sindirimi, kısıtlama enzimi NcoI ile gerçekleştirildi. İki farklı berrak koloni ve bir opak koloni sindirildi. Her iki berrak koloni de 9.544 bp'lik doğru boyutta tek bir banda sahipti (sindirim kontrolü olarak yüklenen sindirilmemiş plazmidler), opak koloninin ise hiç bandı yoktu (Şekil 2A). Bu pozitif sox17: EGFPCAAX yapıları yeniden dönüştürüldü, sonraki koloniler yeniden çizgilendi, bu kolonilerin plazmid olduğu doğrulandı ve -80 ° C bakteriyel dondurucu stokları üretildi. Hem sox17:EGFPCAAX plazmidinin hem de kapaklı-transpozaz mRNA'nın konsantrasyonları belirlendi, böylece her ikisi de enjeksiyon için kullanılabilir (Şekil 2B).

Embriyolar, bir hücre evresi embriyo önceden ısıtılmış embriyo enjeksiyon kalıbına yerleştirilerek enjeksiyona hazırlandı (Şekil 3A-C). Enjeksiyon kalıbına yerleştirildikten sonra, sox17:EGFPCAAX mRNA'yı içeren enjeksiyon iğnesi, mikromanipülatör üzerindeki bir mikropipet tutucuya yerleştirildi (Şekil 3D, E). Embriyolara 100 ng transpozaz mRNA, 150 ng sox17:EGFPCAAX plazmid ve fenol kırmızısı (enjeksiyon izleme boyası) enjekte edildi. 3 nL'lik bir bolus (protokolde tarif edildiği gibi boyuta göre belirlenir, adım 6.6), en iyi entegrasyon şansı için embriyonun sarısına değil, hücre gövdesine enjekte edildi (Şekil 3F)10.

Enjeksiyondan sonra, embriyolar enjeksiyon kalıbından çıkarıldı ve 24 saat boyunca gelişmesine izin verildi. Döllenme sonrası 24 saatte (hpf), embriyolar EGFPCAAX'ın endoderm ekspresyonu için tarandı. Mozaik endoderm EGFPCAAX ekspresyonu, enjekte edilen embriyoların ~u'inde gözlendi (Şekil 4A,A'). Gal4 veya CreERT2 gibi floresan olmayan transgenlerle enjekte edilen embriyoları taramak için, transgenik bir belirteç (yani, cmlc2: EGFP) içeren bir hedef vektör kullanılabilir (Şekil 1A) (Şekil 4B, B'). Sox17: EGFPCAAX'ın germline transgenezine sahip yetişkin zebra balığı, endoderm tamamen EGFPCAAX ile etiketlenmiş floresan embriyolar üretti (Şekil 4C).

Yeni oluşturulan sox17:EGFPCAAX transgenik hattını kullanarak, etanolün endodermal poşetlerin oluşumu üzerindeki etkisini doğrudan değerlendirebildik. Poşetler, endodermin lateral kenarında oluşan çıkıntılardır ve yüz iskeletinin ve çoklu organ sistemlerinin oluşumunda önemlidir17. Daha önce kemik morfogenetik protein (Bmp) sinyalizasyonunun bloke edilmesinin poşetlerin hipoplazisi ile sonuçlandığını göstermiştik18. Şimdi, 10-18 hpf'den Bmp mutantlarının etanol tedavisinin, kese boyutu üzerinde ince ama önemli bir etkiye sahip olduğunu gösteriyoruz. 1-5 poşetlerden (zebra balıklarının altı poşeti vardır, ancak altıncısı henüz görülen gelişim aşamasında tam olarak oluşmamıştı) her bir poşetin dorsal-ventral uzunluğu kontrol ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip Bmp mutant embriyolarında ölçülmüştür (Şekil 5A). Etanol maruziyetine bağlı genel büyüme etkilerinin kontrolü olarak, tüm endodermin anterior-posterior uzunluğu ölçüldü (Şekil 5A). Endodermin toplam uzunluğu genotip veya tedaviden etkilenmedi (Şekil 5B). Bununla birlikte, 1 ve 3 numaralı torbalar, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip embriyolar arasındaki torba uzunluğunda anlamlı artışlar göstermiş, ancak tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş Bmp mutantları arasındaki uzunlukta önemli azalmalar göstermiştir (Şekil 5C; iki yönlü ANOVA; torba 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; poş 3: F(1,54) = 12,70, p = 0.0008). Poşet 2, sırasıyla işlenmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve Bmp mutant grupları arasında kese boyutunda anlamlı artışlar göstermiştir (Şekil 5C; iki yönlü ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001).

Resim 1: Transgen yapımı için LR ağ geçidi reaksiyonu. (A) Modüler dört parçalı LR ağ geçidi klonlama reaksiyonunun şeması. LR Clonase, embriyo enjeksiyonuna hazır yeni bir transgenik ürün üretmek için üç giriş vektörünü, p5E, pME ve p3E ile hedef vektör pDest'i oldukça spesifik bir reaksiyonda yeniden birleştirir. Floresan olmayan transgenleri taramak için, pDest vektörleri isteğe bağlı transgenik belirteçler içerebilir (örnek olarak cmlc2: EGFP). (B) LR rekombinasyon ürünlerinin dönüşümünden elde edilen örnek bakteri kolonileri. Berrak koloniler doğru bir LR rekombinasyon ürünü >zamanın% 85'ini (ok ucu) içerirken, opak koloniler hiçbir zaman doğru bir rekombinasyon ürünü (ok) içermemiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Plazmid DNA'sının ve transpozaz mRNA'sının analizi . (A) LR rekombinasyon ürünlerinin dönüşümünden üç koloninin tanısal sindirimi. Tek opak koloni taranacak herhangi bir plazmid içermezken, iki açık koloni 9.544 bp'de (kesilmemiş ve kesilmiş) tek bir bant içeriyordu. (B) Transpozaz mRNA 1.950 bp'de. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Zebra balığı embriyo enjeksiyonu kurulumu. (A) Bir enjeksiyon kalıbı, EM (% 3 v / v) içinde seyreltilmiş sıvı agaroz içine yerleştirilir. (B) Katılaştıktan sonra, kalıp agaroz plakasından çıkarılır. (C) Embriyolar enjeksiyon kalıplarında düzenlenir. (D,E) mRNA/plazmid/fenol kırmızısı karışımı, mikromanipülatördeki mikropipet tutucusuna yerleştirilen enjeksiyon iğnesine pipetlenir. (F) Tek hücreli aşamada embriyonun hücre gövdesine 3 nL'lik bir bolus enjekte edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Transgenik yapı ile enjekte edilen zebra balıklarının taranması. (A,A') 24 hpf'de görüntülenen bir embriyonun konfokal görüntüsü, sox17: EGFPCAAX transgeninin mozaik ekspresyonunu göstermektedir. (B,B') Gelişmekte olan kalpte cmlc2:EGFP'nin transgenik belirteç ekspresyonu 24 hpf'de. Embriyoların yanal görünümleri, solda ön, üstte dorsal. (C) Transgen taşıyan yetişkin bir zebra balığından üretilen bir embriyonun konfokal görüntüsü. Tüm endoderm EGFPCAAX'ı eksprese ediyor. Embriyonun yanal görünümü, solda önde, üstte ventral. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve Bmp mutant embriyolarda kese ölçümleri. (A) Endodermin toplam uzunluğunun ve poşetlerin uzunluğunun ölçümünü gösteren şematik. (B) Genel anterior-posterior endoderm uzunluğunun ölçümleri, tedavi edilmemiş ve etanol ile tedavi edilmiş vahşi tip ve Bmp mutant embriyolar arasında bir fark göstermemektedir. (C) Dorsal-ventral kese uzunluğu ölçümleri, 1 ve 3 numaralı torbaların, tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip embriyolar arasındaki kese uzunluğunda artışlar gösterdiğini, ancak tedavi edilmemiş ve etanol ile muamele edilmiş Bmp mutantları arasındaki uzunlukta azalma gösterdiğini göstermektedir (iki yönlü ANOVA; kese 1: F(1,54) = 10,39, p = 0,0021; kese 3: F(1,54) = 12,70, p = 0.0008). Poşet 2, işlenmemiş ve etanol ile muamele edilmiş vahşi tip ve Bmp mutant grupları arasında uzunlukta bir artış gösterir (iki yönlü ANOVA; F(1,54) = 18,94, p < 0,0001). Poşet uzunluğunda 4 ve 5 poşetleri arasında fark gözlenmedi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Lovely Lab'de bulunan Tol2Kit bileşenleri. Lovely Lab'de bulunan her giriş ve hedef vektörü, açıklamaları ve menşe laboratuvarları. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 2: LR rekombinasyon reaksiyonundaki her bir vektörün miktarının ve uyumunun hesaplanması. Her vektörün miktarı, her bir bileşen için gereken boyuttan (bp cinsinden) ve fmolden hesaplanmıştır: her giriş vektörünün 10 fmol'ü ve hedef vektörün 20 fmol'ü. Plazmid konsantrasyonundan, her vektör LR reaksiyonuna 1 μL veya daha az eklemek için steril suda seyreltilir. Vektör havuzuna 4 μL'ye eşit steril su eklenir, reaksiyona 1 μL LR reaksiyon karışımı eklenir ve gece boyunca 25 ° C'de inkübe edilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.