Yöntem makalesi

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

DOI:

10.3791/64679

⸱

30 Kasım 2022

 ,  , 
1Alcohol Research Center, Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Louisville

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD), prenatal etanol maruziyetine bağlı olarak ortaya çıkan oldukça değişken yapısal bozukluklar ve bilişsel bozukluklar ile karakterizedir. FASD'nin karmaşık patolojisi nedeniyle, hayvan modellerinin etanol kaynaklı gelişimsel kusurlar hakkındaki mevcut anlayışımız için kritik olduğu kanıtlanmıştır. Zebra balığının, zebra balığı ve insanlar arasındaki hem genetiğin hem de gelişimin yüksek derecede korunması nedeniyle etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için güçlü bir model olduğu kanıtlanmıştır. Model bir sistem olarak, zebra balığı, genetik olarak izlenebilir ve yarı saydam olan çok sayıda harici olarak döllenmiş embriyo da dahil olmak üzere, onları gelişimsel çalışmalar için ideal kılan birçok özelliğe sahiptir. Bu, araştırmacıların çoklu genetik bağlamlarda etanol maruziyetinin zamanlamasını ve dozajını hassas bir şekilde kontrol etmelerini sağlar. Zebra balığında bulunan önemli bir genetik araç transgenezdir. Bununla birlikte, transgenik yapılar oluşturmak ve transgenik çizgiler oluşturmak karmaşık ve zor olabilir. Bu sorunu ele almak için, zebra balığı araştırmacıları transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini kurdular. Bu modüler sistem, eksiksiz Tol2 transpozon tabanlı transgenik yapıların hızlı montajı için çok bölgeli bir Ağ Geçidi klonlama yaklaşımı kullanır. Burada, esnek Tol2 sistem araç kutusunu ve zebra balığı transgenezi için hazır transgenik yapılar oluşturmak için bir protokolü ve bunların etanol çalışmalarında kullanımını açıklıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prenatal etanol maruziyeti, fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak adlandırılan yapısal eksikliklerin ve bilişsel bozuklukların sürekliliğine yol açar1,2,3,4. Birden fazla faktör arasındaki karmaşık ilişkiler, insanlarda FASD'nin etiyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırmaktadır. Bu zorluğu çözmek için çok çeşitli hayvan modelleri kullanılmıştır. Bu modellerde bulunan biyolojik ve deneysel araçlar, etanol teratojenitesinin mekanik temeli hakkındaki anlayışımızı geliştirmede çok önemli olduğunu kanıtlamıştır ve bu model sistemlerinden elde edilen sonuçlar, insan etanol çalışmalarında bulunanlarla oldukça tutarlıdır 5,6. Bunlar arasında, zebra balığı, kısmen dış döllenmeleri, yüksek doğurganlıkları, genetik izlenebilirlikleri ve yarı saydam embriyoları nedeniyle etanol teratogenezi 7,8'i incelemek için güçlü bir model olarak ortaya çıkmıştır. Bu güçlü yönler, zebra balığını, transgenik zebra balığı hatlarını kullanarak FASD'nin gerçek zamanlı canlı görüntüleme çalışmaları için ideal hale getirmek için bir araya gelir.

Transgenik zebra balığı, embriyonik gelişimin birçok yönünü incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır9. Bununla birlikte, transgenik yapılar ve müteakip transgenik çizgiler oluşturmak son derece zor olabilir. Standart bir transgen, transgeni ve bir poli A sinyalini veya "kuyruğunu" sürmek için aktif bir promotör eleman gerektirir, bunların hepsi genel vektör bakımı için kararlı bir bakteriyel vektördedir. Çok bileşenli bir transgenik yapının geleneksel üretimi, çok zaman alıcı alt klonlama adımları gerektirir10. Gibson montajı gibi PCR tabanlı yaklaşımlar, alt klonlama ile ilgili bazı sorunları atlatabilir. Bununla birlikte, her benzersiz transgenik yapı10'un üretimi için benzersiz astarlar tasarlanmalı ve test edilmelidir. Transgen yapımının ötesinde, genomik entegrasyon, germline iletimi ve uygun transgen entegrasyonu için tarama da zor olmuştur. Burada, transpozon tabanlı Tol2 transgenez sistemini (Tol2Kit) kullanmak için bir protokol açıklıyoruz10,11. Bu modüler sistem, sürekli genişleyen "giriş" ve "hedef" vektörleri kütüphanesinden hızlı bir şekilde çoklu transgenik yapılar oluşturmak için çok bölgeli Ağ Geçidi klonlamasını kullanır. Entegre Tol2 transpoze edilebilir elementler, transgenez oranını büyük ölçüde artırarak, çoklu transgenlerin hızlı bir şekilde oluşturulmasına ve genomik entegrasyonuna izin verir. Bu sistemi kullanarak, bir endoderm transgenik zebra balığı hattının oluşturulmasının, FASD'nin altında yatan dokuya özgü yapısal kusurları incelemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Nihayetinde, bu protokolde, modüler kurulumun ve transgenik yapıların inşasının zebra balığı tabanlı FASD araştırmalarına büyük ölçüde yardımcı olacağını gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedürde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, belirlenmiş IACUC protokolleri12'ye uygun olarak yetiştirildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.

NOT: Bu çalışmada vahşi tip zebra balığı suşu AB ve bmp4st72;smad5b1100 çift mutant hattı kullanılmıştır. Bu işlemde kullanılan suyun tamamı steril ters ozmoz suyuydu. Konfokal görüntüler lazer taramalı konfokal mikroskop altında alındı. Endoderm ölçümleri ImageJ'deki ölçüm aracı kullanılarak yapıldı. Tüm istatistiksel analizler istatistiksel yazılımlar kullanılarak yapıldı.

1. Çözümlerin ve medyanın oluşturulması

  1. Bakteriyel ortam: LB suyunu veya agar'ı üreticinin talimatlarına göre çözün ve otoklavlayın. Ortamı 100 mm Petri kaplarına dökmeden önce, ampisilin (50 μg / mL), kanamisin (50 μg / mL) veya bir ampisilin / kloramfenikol kombinasyonu (sırasıyla 50 μg / mL ve 30 μg / mL) ekleyin.
  2. 20x embriyo ortam stoğu yapmak için, aşağıdakileri 1 L suda çözün: 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl, 2.9 g CaCl 2, 0.41 g K 2 HPO 4, 0.142 g Na 2 HPO 4 ve 4.9 g MgSO4 · 7H 2O. 0.22 μm vakum filtrasyon sistemi kullanarak stok çözeltisini filtreleyin-sterilize edin, ve 4 °C'de saklayın.
    NOT: Oluşan beyaz çökeltiyi yok sayın; bu medyayı etkilemeyecektir.
  3. 19 L suda, 1.2 g NaHCO3'ü çözün ve çalışan embriyo ortamı çözeltisini oluşturmak için 20x embriyo ortamı stoğunun 1 L'sini ekleyin ve bu çözeltiyi 28 ° C'de tutun.
  4. % 2 fenol kırmızısı çözeltisi için, 20 mg fenol kırmızı sodyum tuzunu 1 mL RNaz içermeyen suda çözün ve oda sıcaklığında saklayın.

2. Embriyo enjeksiyon kalıpları

  1. Agaroz enjeksiyon plakasını yapmak için, agarozu embriyo ortamında kaynatarak son konsantrasyona% 3'lük bir konsantrasyona kadar çözün.
  2. 100 mm Petri kaplarına 50 mL agaroz dökün ve agaroz hala sıvı iken, kalıbın altında kabarcık oluşumunu önlemek için enjeksiyon kalıbını agarozun içine yavaşça yerleştirin.
  3. Agaroz plakalarını soğumaya bırakın. Agaroz katı hale geldiğinde, enjeksiyon kalıbını çıkarın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de saklayın.

3. Enjeksiyon pipetleri

  1. Filament içeren 1,0 mm (OD) kılcal damarları, solenoid değeri 2,5 ve ısıtma elemanı 14,6 olarak ayarlanmış dikey bir pipet çektirici kullanarak iğnelere çekin.
    NOT: Isıtılmış herhangi bir çektirme, kılcal damarları temiz ve eşit bir şekilde iki iğneye çekerse işe yarayacaktır, ancak tutarlı enjeksiyon sonuçları için enjeksiyon iğnelerinin, zebra balığı embriyolarına enjekte edildikten sonraki 1 hafta içinde çekilmesi gerekir.
    1. Kılcal damarı çektiriciye yerleştirin, kelepçeyi her iki ucundan sıkın ve ardından ısıtma elemanını etkinleştirin.
    2. İki enjeksiyon iğnesi oluşturmak için kılcal damarları çekin.
    3. Kılcal damarları çektirmeden çıkarın ve iğne tutucu olarak işlev gören bir modelleme kili şeridi ile boş bir Petri kabında saklayın.

4. Transpozaz mRNA preparatı

  1. Aşağıdakileri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirerek Transpozaz içeren Tol2Kit plazmidini NotI kısıtlama endonükleazı ile doğrusallaştırın: 10 μL transpozaz plazmidi (150 ng / μL), 1,5 μL kısıtlama endonükleaz reaksiyon tamponu, 0,3 μL NotI endonükleaz.
  2. 20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından gece boyunca 37 ° C'de karıştırın ve sindirin.
  3. Sindirim reaksiyonuna 1 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL 5 M NH4OAc ve 80 μL 0 EtOH ekleyerek transpozaz sindirimini durdurun ve ardından gece boyunca -20 °C'de karıştırın ve soğutun.
  4. Çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve DNA peletini RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın.
  5. Bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram cinsinden doğrusal plazmid konsantrasyonunu belirleyin (ng / μL), önce RNaz içermeyen bir su boşluğunun 2 μL'sini çalıştırarak ve ardından doğrusallaştırılmış plazmidin 2 μL'sini çalıştırarak.
    NOT: Plazmid konsantrasyonları tipik olarak 100-200 ng/μL arasında değişmektedir
  6. Aşağıdaki bileşenleri 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde sırayla birleştirerek SP6 mRNA üretimini ayarlayın: 10 μL 2x NTP / CAP, 2 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,1-1 μg doğrusal DNA şablonu ve 2 μL SP6 enzim karışımı.
  7. 20 μL'ye kadar reaksiyonu RNaz içermeyen suyla doldurun ve ardından 2 saat boyunca 37 ° C'de karıştırın ve inkübe edin.
  8. 2 saat boyunca inkübe ettikten sonra, 1 μL DNaz ekleyin, iyice karıştırın ve 37 ° C'de 15 dakika daha inkübe edin.
  9. SP6 reaksiyonunu durdurmak için, reaksiyon tüpüne 30 μL LiCl çökeltme çözeltisi ekleyin ve ardından gece boyunca -20 ° C'de karıştırın ve soğutun.
  10. mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 4 ° C'de 20 dakika boyunca 14.000 x g'de santrifüj edin ve daha sonra süpernatantı aspire edin ve mRNA peletini 1 mL% 80 EtOH (RNaz içermeyen su ile seyreltilmiş) ile yıkayın.
  11. mRNA'yı pelet haline getirmek için çözeltiyi 14.000 x g'de 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve ardından süpernatanı aspire edin. Peletin hava ile kurumasını bekleyin.
  12. mRNA peletini 20 μL RNaz içermeyen suda yeniden askıya alın, adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre başına nanogram (ng / μL) cinsinden mRNA konsantrasyonunu belirleyin (en az 100 ng / μL olmalıdır), tek kullanım için tüp başına 100 ng mRNA aliquot ve -80 ° C'de saklayın.
    NOT: mRNA'nın bozulmadığından emin olmak için, 1.950 bps'de tek bir bandı doğrulamak için bir DNA elektroforez jeli üzerinde 2 μL mRNA hızlı bir şekilde çalıştırılabilir.

5. Transgenez için giriş vektörleri oluşturmak için Multisite Gateway klonlama

NOT: Bu protokol Kwan ve ark.10'dan modifiye edilmiştir, LR reaksiyonu yarı-LR reaksiyonu olarak yazılmıştır ve toplam hacim 5 μL'dir. Yeni giriş elemanları üretmek için, 5', orta ve 3' donör vektörleri kullanan BP reaksiyonlarının10,13 kullanılması gerekir.

  1. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, p5E, pME ve p3E'nin her biri 10 fmol ve hedef vektörün (pDest) 20 fmol'ünü toplayın.
    NOT: Çok bölgeli LR rekombinasyonu dört farklı plazmid vektörü kullanır: zebra balığı embriyolarına enjekte edilmeye hazır Tol2 tekrarları ile çevrili benzersiz bir transgenik yapı oluşturmak için bir 5' giriş vektörü (p5E), bir orta giriş vektörü (pME), bir 3' giriş vektörü (p3E) ve bir hedef vektör (pDest).
    1. Plazmid kaynağından baz çiftlerindeki dört vektörün tümünün boyutunu tanımlayın (Tablo 1, Tol2Kit Wiki sayfa14 veya Addgene11; Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Yeni vektörler için, ticari dizileme şirketleri aracılığıyla tam plazmid dizileme, bps cinsinden tam plazmid boyutunu sağlayabilir.
    2. Adım 4.5'te açıklandığı gibi bir florometre kullanarak mikrolitre (ng / μL) başına nanogram cinsinden dört vektörün konsantrasyonunu belirleyin.
    3. DNA'nın ağırlığını 660 g / mol ve plazmid boyutunu (bps cinsinden) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken toplam plazmid nanogramını (ng) hesaplayın.
      figure-protocol-1
      NOT: Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü'ndeki Mosimann laboratuvarı, LR reaksiyonu15'te ihtiyaç duyulan vektörlerin ihtiyaç duyulan plazmid miktarını (ng cinsinden) ve hacmini (μL cinsinden) hesaplamak için serbestçe kullanılabilen bir elektronik tablo oluşturmuştur.
  2. Aşağıda açıklanan sox17 :EGFPCAAX yapısını oluşturmak için aşağıdaki vektörleri kullanın: zebra balığı sox17 promotörünü içeren ve16 boyutunda 6.918 bp olan bir p5E vektörü; 10 boyutunda 3.345 bp olan prenylated EGFP'yi içeren bir pME vektörü; SV40 geç poli A sinyal dizisini içeren bir p3E vektörü,boyut 10'da 2.838 bp'dir; ve10 boyutunda 5.883 bp olan pDest.
  3. Adım 5.1.2'de belirlenen plazmid konsantrasyonunu ve her vektör için nanogram (ng) cinsinden miktarı (adım 5.1.3) kullanarak, 10 fmol (giriş vektörleri) veya 20 fmol'e (hedef vektör) ulaşmak için gereken her plazmidin toplam mikrolitresini (μL) hesaplayın ve ardından bunu 5 μL yarı LR reaksiyonlarında kullanılmak üzere ikiye bölün (aşağıda listelenen tüm değerler Tablo 2'de listelenmiştir).
    figure-protocol-2
    1. 10 fmol p5E-sox17 üretmek için 45.66 ng (140.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.65 μL elde etmek için steril suyla 4 faktörü ile seyreltin.
    2. 10 fmol pME-EGFPCAAX üretmek için 22.08 ng (213.5 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.52 μL elde etmek için steril suyla 10 faktörü ile seyreltin.
    3. 10 fmol p3E-poli A üretmek için, 15.73 ng (276.1 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 0.57 μL elde etmek için steril suyla 20 kat seyreltin.
    4. Hedef vektörün 20 fmol'ü için, 77.66 ng pDest (307.3 ng / μL konsantrasyonda) kullanın ve 1.63 μL elde etmek için steril suyla 5 faktörü ile seyreltin.
  4. 5 μL yarı-LR reaksiyonu kurmak için, adım 5.3'te belirlenen p5E, pME, p3E ve pDest hacimlerini 0,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin ve ardından toplam 4 μL reaksiyon hacmine ulaşmak için steril su ekleyin.
  5. Doğru karıştırmayı sağlamak için LR enzim karışımını her biri 1 dakika boyunca 2 kez kuvvetlice vorteksleyin ve ardından reaksiyona 1 μL ekleyin ve iyice karıştırın.
  6. Gece boyunca 25 ° C'de inkübe edin (16+ saat).
  7. LR reaksiyonunu 0,5 μL proteinaz K (2 μg/μL) ekleyerek durdurun, 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin ve ardından oda sıcaklığına soğutun.
  8. 3-4 μL plazmidi, plazmidi ekleyerek ve hücrelerin 25-30 dakika boyunca buz üzerinde oturmasına izin vererek çözülmüş, kimyasal olarak yetkin hücrelere dönüştürün.
  9. Hücreler buz üzerinde otururken, iki LB-ampisilin agar plakasını oda sıcaklığına ısıtın.
  10. 42°C'lik bir su banyosundaki hücreleri tam olarak 30 sn boyunca ısıl şokla geçirin.
  11. Isı şokundan sonra, hücrelere 250 μL antibiyotiksiz, zengin sıvı ortam ekleyin ve 1.5 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayarak inkübe edin.
  12. Bir ampisilin plakasına 300 μL bakteri yayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  13. Ertesi sabah, kolonileri berrak ve opak iki fenotipin varlığı açısından tarayın, berrak kolonileri (Kwan ve ark.10'da açıklandığı gibi) birer birer seçin, sıvı kültürü aşılayın ve ardından gece boyunca 37 ° C'de sallayın.
    NOT: Berrak koloniler neredeyse her zaman doğru LR kolonisini içerir (zamanın %>85'i).
  14. Üreticinin talimatlarına uygun olarak ticari bir kit kullanarak, her sıvı kültüründe bir plazmid hazırlığı yapın ve LR ağ geçidi reaksiyonunun düzgün çalıştığını gösteren transgenik yapının uygun boyutunu doğrulamak için her plazmidi tanısal olarak sindirin.
  15. Plazmidin 0.5-1 μL'sini kullanarak 5.4-5.12 adımlarında açıklandığı gibi standart bakteriyel transformasyon protokolünü kullanarak doğru transgenik yapıları yeniden dönüştürün ve sadece 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  16. Kolonileri yeniden çizin ve her birinin adım 5.14'teki gibi LR transgenik yapısına sahip olduğunu onaylayın.
  17. Adım 4.5'te açıklandığı gibi plazmid konsantrasyonunu belirleyin (embriyo enjeksiyonu için en az 150 ng / μL gereklidir).

6. Transgenin embriyolara enjeksiyonu

  1. Tek kullanımlık bir transpozaz mRNA örneğini ve Tol2 transgenik yapısını buz üzerinde çözün ve bir agaroz enjeksiyon plakasını oda sıcaklığına önceden uyarın.
  2. Aşağıdakileri buz üzerinde birleştirin: 150 ng plazmid, 100 ng transpozaz mRNA ve% 2 fenol kırmızısı (0.3 μL). Ardından, hacmi 3 μL'ye çıkarmak için RNA'sız su ekleyin.
  3. Transfer pipetleri kullanarak bir hücre aşaması embriyolarını, agar'ı tamamen kaplayan EM ile doldurulmuş enjeksiyon plakasına (adım 2'de tarif edilmiştir) aktarın ve ardından enjeksiyon plakasının yuvası başına yaklaşık 50-75 embriyoyu hafifçe bastırın.
  4. mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımını kılcal enjeksiyon iğnesinin açık ucuna ekleyin, kılcal iğneyi enjeksiyon teçhizatı armatürüne yerleştirin ve enjeksiyon teçhizatını açın.
    NOT: Enjeksiyon teçhizatı, aktive edildiğinde mRNA/plazmid/fenol kırmızı karışımının istenen hacmini (adım 6.5'te açıklanmıştır) embriyoya atmak için hava gibi sıkıştırılmış gaz kullanır.
  5. Kılcal iğneyi enjeksiyon plakasının EM'sine indirin ve enjeksiyon teçhizatı tarafından sadece az miktarda mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının pompalanmasına izin vermek için forseps kullanarak ucu kırın.
  6. Embriyoları, mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımının küçük bir 3 nL bolusu ile embriyonun hücre gövdesine enjekte edin.
    NOT: 3 nL'lik bir bolus, yedi bolusun teorik olarak embriyonun orta çizgisi boyunca eşit olarak sığabileceği bir mRNA / plazmid / fenol kırmızı karışımı hacmidir.
  7. Embriyoları enjekte etmeyi bitirdiğinizde, yavaşça yuvadan dışarı atarak enjeksiyon plakasından çıkarın ve taze EM (yaklaşık 40 mL) ile 100 mm'lik bir Petri kabına aktarın ve daha sonra embriyoların gelişmesine izin vermek için 28.5 ° C'de inkübe edin.

7. Transgenik yerleştirme için embriyoların taranması

  1. Floresan proteinlerinin ekspresyonu için, floresan transgeninin eksprese edilmesi gereken uygun gelişim aşamasını seçin ve floresan diseksiyon mikroskobu altında floresan varlığını tarayın.
    NOT: Bu embriyolar ifadelerinde mozaik olacak ve transgenik yapının genomik bir yerleşimini gösterecektir.
  2. Floresan olmayan transgenleri tarayarak, cmlc2 geni için kardiyak spesifik promotör tarafından tahrik edilen GFP veya farklı hedef vektörlerde bulunan αcyrstallin'in lense özgü promotörü tarafından tahrik edilen mCherry gibi floresan olmayan transgenleri (adım 7.1'de açıklandığı gibi) tarayarak tarayın.
  3. Transgenik yerleştirme için pozitif embriyoların yetişkin zebra balığı aşamalarına tamamen gelişmesine izin verin.
  4. Potansiyel transgenik balıklar üreme çağına ulaştığında, vahşi tip zebra balıklarına yetiştirerek hem germline iletimi hem de transgen ekspresyonu için ayrı ayrı tarayın.
  5. Embriyoları normal olarak gelişen ve en güçlü ve en uygun transgen ekspresyonunu veren yetişkinler, gelecekteki çalışmalar ve analizler için benzersiz transgenik zebra balığı çizgileri olarak tutulur.
    NOT: Transgenik yapıların genomik yerleştirilmesi için taramaya alternatif bir yaklaşım olarak, vahşi tip DNA'yı değil, sadece transgenik yapıyı güçlendiren PCR primerleri tasarlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transgenik yapıları oluşturmak için Tol2 transgenez sistemini kullandık. Gen promotör/arttırıcı elementleri tutan p5E, promotör/arttırıcı elementler tarafından ifade edilecek geni tutan pME ve en azından poliA kuyruğunu tutan p3E dahil olmak üzere üç giriş vektörü, çok bölgeli ağ geçidi LR klonlaması yoluyla transgenik yapıyı oluşturmak için kullanıldı. Hedef vektör pDest, zebra balığı embriyolarında transgenik yapının genomik yerleştirilmesi için Tol2 tekrarlarını sağlar ve bakteri büyümesi için gerekli tüm gen...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zebra balığı, etanol maruziyetinin gelişim ve hastalık durumları üzerindeki etkisini incelemek için idealdir 7,8. Zebra balığı, çok sayıda yarı saydam, harici olarak döllenmiş, genetik olarak izlenebilir embriyolar üretir, bu da birden fazla çevresel bağlamda aynı anda birkaç transgen etiketli doku ve hücre tipinin canlı görüntülenmesine izin verir 19,20. Bu güçlü yönler, insanlarla güçlü gelişimsel genet...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri / Ulusal Alkol Kötüye Kullanımı Enstitüsü (NIH / NIAAA) R00AA023560'tan C.B.L.'ye bir hibe ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Addgene Tol2 araç kutusuhttps://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
HavaDoğrudan üniversite tarafından sağlanır
AmpisilinFisher ScientificBP1760
Analitik TeraziVWR10204-962
Borozil 1,0 mm Dış Çap x 0,75 mm İç Çap KılcalFHC30-30-0
Kalsiyum KlorürVWR97062-590
KloramfenikolBioVision2486
EDTAFisher ScientificBP118-500
Floresan Diseksiyon MikroskobuOlympusSZX16
KanamisinFisher ScientificBP906
Lazer Taramalı Konfokal MikroskopOlympusFluoview FV1000
Lawson Lab Donör Plazmid Hazırlıkhttps://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB AgarFisher ScientificBP9724
LB Et SuyuFisher ScientificBP1426
Düşük EEO/Çok Amaçlı/Moleküler Biyoloji Sınıfı AgarozFisher ScientificBP160-500
LR Klonaz II Plus EnzimFisher Scientific12538200
Magnezyum Sülfat (Heptahidrat)Fisher ScientificM63-500
Mikro Pipet tutucuUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMIMPH-M-PIP
Mikrosantrifüj tüpü 0.5 mL VWR10025-724
Mikrosantrifüj tüpü 1.5 mL VWR10025-716
MikromanipülatörUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMM33
Mikropipet uçları 10 μ L Fisher Scientific13611106
Mikropipet uçları 1000 μ L Fisher Scientific13611127
Mikropipet uçları 200 μ L Fisher Scientific13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transkripsiyon KitiFisher ScientificAM1340
Mosimann Lab Tol2 Hesaplama Çalışma Sayfasıhttps://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop SpektrofotometreNanoDropND-1000
NcoINEBR0189S
NotINEBR0189S
Petri kapları 100 mm Fisher ScientificFB012924
Fenol Kırmızı sodyum tuzuSigma AldrichP4758-5G
Pipetman L p1000L MikropipetGilsonFA10006M
Pipetman L p200L MikropipetGilsonFA10005M
Pipetman L p2L MikropipetGilsonFA10001M
Potasyum KlorürFisher ScientificP217-500
Potasyum Fosfat (Dibazik)VWRBDH9266-500G
Basınç EnjektörüUygulamalı Bilimsel EnstrümantasyonMPPI-3
QIAprep Spin Miniprep KitiQiagen27106
Sodyum BikarbonatVWRBDH9280-500G
Sodyum KlorürFisher ScientificS271-500
Sodyum Fosfat (Dibazik)Fisher ScientificS374-500
Stericup .22 & mikro; M Vakum Filtrasyon Sistemi Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Sayfasıhttp://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coliFisher ScientificC404010
Dikey Pipetleyici ÇektirmesiDavid Kopf Instruments720
Zebra balığı mikroenjeksiyon kalıbıUyarlanabilir Bilim Araçlarıi34

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460(2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26(2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregan. (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School. , Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017).
  14. The Tol2Kit. , Available from: http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page (2007).
  15. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  16. Chung, W. -S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  17. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  18. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  19. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665(2022).
  20. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813(2021).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  22. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  23. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  24. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  25. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tol2 TransgeneziZebrafish ModeliGateway KlonlamaTransgenik ZebrafishEmbriyo EnjeksiyonuFetal Alkol SpektrumuTranspozaz mRNAGerm hatt Aktar mFloresan Mark rEtanol Maruziyeti

İlgili makaleler