Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması

1.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64686

⸱

10 Şubat 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2Department of Nutritional Sciences, The University of Texas at Austin

Bu makalede

Özet

CRISPR-Cas teknolojileri, genom düzenleme alanında devrim yarattı. Bununla birlikte, istenen germline düzenlemesini bulmak ve izole etmek büyük bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, bu protokol, standart PCR, kısıtlama sindirimi ve jel elektroforezi tekniklerini kullanarak germline düzenlemeleri için F0 CRISPR enjekte edilen zebra balığı spermini hızlı bir şekilde taramak için sağlam bir yöntem açıklamaktadır.

Özet

Hedeflenen CRISPR-Cas nükleaz teknolojilerinin ortaya çıkışı, hem yerleşik hem de gelişmekte olan model sistemlerinde hassas genom düzenlemesi gerçekleştirme yeteneğinde devrim yarattı. CRISPR-Cas genom düzenleme sistemleri, CRISPR ile ilişkili (Cas) bir endonükleazı Cas endonükleazının çift iplikli bir kırılma oluşturduğu spesifik genomik DNA lokuslarına hedeflemek için sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) kullanır. Çift iplikçik kopmalarının içsel hataya eğilimli mekanizmalarla onarılması, lokusu bozarak yerleştirmelere ve / veya silmelere yol açar. Alternatif olarak, çift sarmallı DNA donörlerinin veya tek sarmallı DNA oligonükleotidlerinin bu sürece dahil edilmesi, tek nükleotid polimorfizmlerinden küçük immünolojik etiketlere ve hatta büyük floresan protein yapılarına kadar değişen hassas genom düzenlemelerinin dahil edilmesini sağlayabilir. Bununla birlikte, bu prosedürdeki büyük bir darboğaz, germ hattında istenen düzenlemeyi bulmak ve izole etmek olabilir. Bu protokol, Danio rerio'daki (zebra balığı) spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntem ortaya koymaktadır; Bununla birlikte, bu prensipler in vivo sperm toplanmasının mümkün olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir.

Giriş

CRISPR (Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas sistemi, Danio rerio (zebra balığı) model sistemi 1,2,3,4'te lokuslara özgü mutajenez ve hassas genom düzenlemesi gerçekleştirmek için güçlü bir araçtır. Cas-ribonükleoprotein (RNP) iki ana bileşenden oluşur: bir Cas endonükleaz (genellikle Cas9 veya Cas12a) ve bir lokusa özgü sentetik kılavuz RNA (sgRNA)5. Birlikte, Cas-RNP, istenen lokusta, iki içsel onarım mekanizmasından biri tarafından onarılabilen çift sarmallı bir kırılma (DSB) üretir. Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) onarım mekanizması hataya eğilimlidir ve genellikle DSB çevresinde çeşitli eklemeler veya silmeler (indel) ile sonuçlanır. Bu indeller, ortaya çıkan protein dizisinde bir çerçeve kayması mutasyonu veya erken durma meydana getirirlerse zararlı olabilirler. Alternatif olarak, homolojiye yönelik onarım (HDR) mekanizması, hasarı onarmak için DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren bir donör şablonu kullanır. Araştırmacılar, hassas genomik düzenlemeler oluşturmak için HDR sisteminden yararlanabilirler. Spesifik olarak, istenen düzenlemeleri ve genomdaki DSB bölgesini çevreleyen homoloji bölgelerini içeren çift sarmallı bir DNA donör yapısını birlikte enjekte edebilirler. Ticari olarak üretilen bu CRISPR bileşenleri için artan ölçek ekonomisi, çoklu lokusların taranmasının ve hassas genom düzenlemesi için daha büyük ölçekli çabaların oluşturulmasının önündeki engelleri büyük ölçüde azaltmıştır. Bununla birlikte, cinsel olarak üreyen hayvan modellerinde, büyük bir darboğaz, germline stabil mutant hayvanların tanımlanması ve izolasyonudur.

Zebra balığı model sistemi, ters genetik çalışmalarda kullanımını artıran birkaç temel nitelik sergilemektedir. Temel su barınağı ekipmanı ile çok sayıda arkaya çekilmeleri kolaydır ve dişiler tüm yıl boyunca6 boyunca yüksek doğurganlık sergilerler. Dahası, dış yumurtlama ve döllenme onları CRISPR / Cas bileşenlerinin mikroenjeksiyonuna uygun hale getirir. Cas-RNP, teoride tüm yavru hücreler tarafından miras alınan DSB'ler / onarımlar üretmek için genellikle tek hücreli aşamalı zebra balığı embriyolarına enjekte edilir. Bununla birlikte, diploid genomlar, her iki homolog kromozomu da mutajenize etmek için iki DSB / onarım olayı gerektirir. Ayrıca, Cas-RNP tek hücreli aşamada enjekte edilmesine rağmen, DSB / onarım, gelişimin sonraki noktalarına kadar gerçekleşmeyebilir. Birlikte, bu faktörler F0 enjekte edilen balıkların mozaik doğasına katkıda bulunur. Yaygın bir uygulama, F0 enjekte edilen balıkları geçmek ve F1 soyunu indeller / spesifik düzenlemeler için taramaktır. Bununla birlikte, F0 enjekte edilen tüm balıklar germline mutasyonlarına sahip olmadığından, bu uygulama istenen düzenlemeyi üretmeyen birçok verimsiz haçla sonuçlanır. F1 somatik doku yerine F0 germline taraması, istenen germline düzenlemesini izole etme olasılığını arttırır ve bu süreçte gerekli olan hayvan sayısını azaltır.

F0 enjekte edilen zebra balıklarından ötenaziye gerek kalmadan kolayca sperm toplanabilir. Bu özellik, dondurulmuş sperm stoklarının kriyoprezervasyonuna ve yeniden türetilmesine izin verir7, ancak istenen genomik mutasyonların germline taşıyıcılarını hızlı bir şekilde taramak, tanımlamak ve izole etmek için de kullanılabilir 8,9. Brocal ve ark. (2016) daha önce F0 enjekte edilen erkek zebra balığı10'da germline düzenlemelerini taramak için dizileme tabanlı bir yöntem tanımlamıştır. Germ hattında bulunan mutasyona uğramış alelleri tanımlamak için yararlı olsa da, bu yaklaşım yüksek verimde maliyetli olabilir ve tüm laboratuvarlar için erişilebilir olmayabilir. Buna karşılık, mevcut protokol, germline düzenlemelerini tanımlamak için ulaşılabilir ve uygun maliyetli bir elektroforez tabanlı strateji sunmaktadır. Spesifik olarak, bu protokol, yüksek çözünürlüklü agaroz jel elektroforezi kullanarak spesifik lokuslarda germline mutasyonlarını taramak ve izole etmek için sağlam bir yöntemi özetlemektedir. Ek olarak, bu protokol, belirli düzenlemeleri içeren bir bağışçı yapısının başarılı entegrasyonunu tanımlamak için benzer bir stratejiyi açıklamaktadır. Her zaman olduğu gibi, belirli düzenlemeler isteniyorsa, sıralama tabanlı stratejiler aşağıda açıklanan protokolle birlikte gerçekleştirilebilir. Bu protokol zebra balığı model sistemine özgü olsa da, bu ilkeler sperm toplanmasının rutin bir prosedür olduğu herhangi bir modele uyarlanabilir olmalıdır. Birlikte, bu stratejiler, F0 enjekte edilen erkeklerin, standart polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve / veya kısıtlama sindiriminden sonra bir jel üzerinde çözülebilen germline indelleri / düzenlemeleri ile tanımlanmasına izin verecektir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nda yer alan kılavuzlar doğrultusunda gerçekleştirilmiştir. Protokol, Austin Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'ndeki Teksas Üniversitesi (AUP-2021-00254) tarafından onaylandı.

1. CRISPR mutagenezi için sgRNA'nın tasarlanması

  1. Hedeflenen lokusları içeren ekzon dizisini elde edin.
  2. Cas endonükleazına özgü bir protospacer bitişik motif (PAM) bölgesi ile sentetik bir kılavuz RNA (sgRNA) tasarlayın.
    1. Bir donör yapısını birlikte enjekte ediyorsanız, sgRNA'yı istenen düzenlemelere mümkün olduğunca yakın tahmin edilen bir kesim bölgesine sahip olacak şekilde tasarlayın.
      NOT: APE, Cas9 sgRNA siteleri11'i bulmak için bir araca sahip ücretsiz bir yazılımdır. Alternatif olarak, Cas9 ve diğer Cas endonükleazları12'nin farklı PAM bölgelerini dikkate alan sgRNA'ları tasarlamak için çevrimiçi bir arayüz sunan CHOPCHOP gibi araçlar kullanılabilir.
  3. Tasarlanan CRISPR/Cas kesim bölgesini çevreleyen bölgeyi büyütmek için ileri ve geri astarlar tasarlayın. PCR ürünü, protokolün ilerleyen kısımlarında bir jel üzerindeki küçük indelleri çözebilmek için yaklaşık 200-400 baz çifti (bp) uzunluğunda olmalıdır.
    NOT: CHOPCHOP11 , çıkardığı her sgRNA için otomatik olarak primerler tasarlar.
  4. İsteğe bağlı: İstenilen düzenleme(ler)le bir DNA donör yapısı tasarlayın.
    1. İstenilen mutasyonun lokuslarını içeren ekzonun genomik dizisini elde edin.
      NOT: İntronik sekanslar bireyler arasında değişebilir, bu nedenle intronik sekansların donör yapısına dahil edilmesinden kaçınmak en iyisidir, çünkü bu homolojiye bağlı onarım yoluna müdahale edebilir.
    2. Belirli bir amino asit değişikliği isteniyorsa, spesifik kodonu buna göre değiştirin.
      NOT: Bu değişiklikleri yaparken, kodon frekansının farkında olun. Mümkünse, yüksek kullanımlı bir kodon seçin.
    3. Donör yapının CRISPR / Cas sindirimini önlemek için, (i) PAM'ı bozan ve / veya (ii) sgRNA dizisini bozan, PAM bölgesine daha yakın eşanlamlı olmayan değişiklikler yapmaya daha fazla tercih edilen ek eşanlamlı mutasyonlar yapın.
    4. Vahşi tip dizinin tahmin edilen PCR ürününde benzersiz kısıtlama sitelerini (yalnızca bir kez meydana gelenler) bulmak için bir kısıtlama sitesi bulucu kullanın (APE11 de bu özelliğe sahiptir).
      1. Donör yapısının başarılı entegrasyonunu yansıtan tahmin edilen PCR ürünü için bu işlemi tekrarlayın.
      2. Yalnızca düzenlenen dizide bulunan bir kısıtlama sitesi bulmak için vahşi tür ve bağışçı ile tümleşik diziler arasındaki kısıtlama sitelerinin listesini karşılaştırın.
      3. Benzersiz bir kısıtlama bölgesi bulunmazsa, bu sağlanana kadar donör yapısında eşanlamlı değişiklikler yapmaya devam edin.
        NOT: Mümkünse, donör yapısına sgRNA bağlanmasını bozacak eşanlamlı mutasyonlar yapmaya devam edin.
    5. Donör dizisini, tahmin edilen CRISPR / Cas kesim bölgesini çevreleyen en az 20 bp homoloji ile yönetilebilir bir boyuta (50-100 bp) kırpın ve mümkünse düzenleyin.
  5. Tasarlanan sgRNA ve / veya DNA donör oligonükleotidlerinin yanı sıra genotipleme için gerekli primerleri elde edin.
    NOT: DNA donör oligonükleotidlerinin nükleazlar tarafından sindirimini önlemek için, DNA oligonükleotidlerinin 5' ve 3' uçlarındaki ilk üç fosfat bağının fosforothioat ile değiştirilmesi önerilir.
  6. Enjeksiyon karışımının 1 nL'sini tek hücreli aşama embriyolarına enjekte edin. Tipik olarak, standart bir enjeksiyon karışımı aşağıdakileri içerir:
    1 μL 25 μM lokusa özgü sgRNA
    1 μL 25 μM Cas9 endonükleaz
    İsteğe bağlı: 1 μL 3 μM DNA donör yapısı
    1. 0,1 M RNaz içermeyen KCl ile toplam hacmi 5 μL'ye getirin.
  7. F0 enjekte edilen bireylerin cinsel olarak olgun yetişkinlere dönüşmesine izin verin. Kalan protokol, F0 enjekte edilen erkeklerin germline düzenlemeleri için taranmasına odaklanmaktadır.

2. Islah tanklarının kurulması

  1. F0 erkekleri ve dişileri arasında bölücüler ile üreme tankları kurarak çiftleşme için Asal F0 erkekleri.
    1. Gerekli üreme tanklarının sayısını en aza indirmek için, her tankta iki dişinin karşısında üç erkek ayarlayın.
      1. Sperm toplanmasından sonra etkili bir şekilde taranabilecek ve birey olarak barındırılabilecek kadar F0 erkeği ayarlayın. Bu işlem sırasında gametleri toplanmayacağından dişilerin genotipi önemli değildir.
    2. Dişilerin karşısında vahşi tip erkeklerden oluşan bir üreme tankı kurun. Vahşi tip sperm, prosedürün ilerleyen aşamalarında sonuçların yorumlanması için bir kontrol görevi görecektir.
  2. Hazırlanan üreme tanklarını gece boyunca inkübe edin.

3. Sperm toplama işlemi için materyallerin hazırlanması

  1. Küçük bir cam kabı doldurmak için yeterli anestezi çözeltisi (balık suyunda% 0.016 trikain-HCl) hazırlayın.
  2. 40 μL 50 mM NaOH'yi 0,2 mL PCR tüplerine dağıtın. Toplanacak her sperm örneği için bir tüp hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.
  3. İşlem sırasında örneklenecek her balık için ayrı ayrı 0.8 L tankları hazırlayın. Bu tanklar, genotipleme tamamlanana kadar örneklenen balıkları barındıracaktır.
    NOT: Bu, bu protokolde etkili bir şekilde taranabilecek balık sayısını sınırlayan birincil faktördür. Genotipleme tamamlanana kadar örneklenen bireyleri barındırmak için yeterli alan sağlayın.
  4. 1 inç x 1 inçlik bir süngeri (prosedür sırasında erkek zebra balığı ventral tarafını yukarıda tutmak için sığ, oval şekilli bir divot ile kesilmiş) balık suyunda nemlendirin ve fazla sıvıyı sıkın.
    1. Süngeri stereomikroskopun görüş alanına düşük büyütmede yerleştirin (Şekil 1A).
    2. Optimum görüntüleme için eğik baş üstü aydınlatmasını konumlandırın.

4. Erkek balığın uyuşturulması ve spermin toplanması

  1. Temiz bir kılcal tüp hazırlayın.
    1. Tek bir kılcal tüpü serbest bırakmak için tüp kabını yavaşça sallayın.
    2. Kılcal boruyu sağlanan ampulün içine yerleştirin ve bir kenara koyun.
  2. Bir erkek balığı hazırlanan anestezi çözeltisine aktarın (balık suyunda% 0.016 trikain-HCl).
    1. Anestezi işlemini hızlandırmak için çözeltiyi oluklu bir kaşıkla yavaşça karıştırın.
    2. Operkulum (solungaç) hareketi yavaşladığında (yaklaşık 1-2 dakika), sperm toplama işlemine devam edin.
  3. Balıkları temiz bir kağıt havlu yığınına aktarmak için oluklu kaşığı kullanın.
    1. Fazla suyu gidermek için balığı yavaşça yuvarlamak için oluklu kaşığı kullanın.
    2. Kalan suyu çıkarmak için balıkları temiz, katlanmış kağıt mendille nazikçe lekeleyin.
  4. Balıkları hazırlanan süngere aktarmak için oluklu kaşığı kullanın (Şekil 1B).
    1. Balık ventral tarafını, başı prosedürü gerçekleştiren kişinin baskın eline en yakın olacak şekilde yerleştirin.
    2. Anal yüzgeçlerin etrafındaki alanı temiz, katlanmış kağıt mendille nazikçe lekeleyin.
  5. Spermi toplayın.
    1. Kılcal tüpün ucunu kullanarak, kloakı açığa çıkarmak için pelvik yüzgeçleri yavaşça orta hattan yanal olarak uzaklaştırın (Şekil 1C).
    2. Kılcal tüpün ucunu kloakın yanına yerleştirin.
    3. Forsepsleri kullanarak, solungaçların hemen altından başlayıp kloakta biten balığın kenarlarını hafifçe sıkın (Şekil 1C').
    4. Kılcal etki ile kılcal tüpe sperm toplayın. Bu işlem için yaklaşık 1 μL yeterlidir (Şekil 1D).
      NOT: Bazı laboratuvarlar sperm toplanması için kılcal tüpler yerine p10 pipet uçlarının kullanıldığını bildirmektedir.
    5. Sperm hafif basınçla serbest bırakılmazsa, balığı sistem suyuna geri döndürün.
      1. Anesteziden iyileşme için monitör.
      2. Spermleri dışarı atmak için balıkları sert bir şekilde sıkmayın, çünkü bu balığa zarar verebilir.
      3. Tekrar sperm toplamaya çalışmadan önce balıkları 2 hafta dinlendirin.
    6. Toplandıktan sonra, balıkları ayrı ayrı muhafaza için sistem suyu ile temiz bir izolasyon tankına yerleştirin.
      1. Anesteziden kurtulmak için balıkları izleyin.
      2. Tekrar sperm toplamaya çalışmadan önce balıkları 2 hafta dinlendirin.
    7. Toplanan sperm ile kılcal tüpü hazırlanan PCR tüpüne yerleştirin (40 μL 50 mM NaOH ile).
    8. Toplanan numuneyi dışarı atmak için kauçuk ampulü sıkın.
    9. Kullanılmış kılcal boruyu onaylanmış bir cam atık kabına atın.
    10. Tüm erkekler sıkılana kadar örnekleri buz üzerinde inkübe edin.
  6. Her bir erkek için 4.1-4.5 arasındaki adımları yineleyin.
  7. İzolasyon tanklarını ve sperm örneklerini etiketleyin, böylece nihai sperm genotipleme sonuçları, varsayılan mutasyonlarla ilgili bireye kadar izlenebilir.
  8. Tüm bireyleri izleyin ve tankları sisteme geri koymadan önce dik olduklarından ve tanklarını keşfettiklerinden emin olun.
  9. Astarlama için kullanılan dişileri sistemdeki kendi tanklarına geri koyun.
  10. Herhangi bir balık 10 dakika sonra anesteziden iyileşmezse, laboratuvarla ilişkili kurum tarafından onaylanan ötenazi prosedürünü izleyin.
    1. Örnek: Bireyi 2-4 °C balık suyu ile bir buz banyosunda hızlı bir şekilde soğutun.
    2. Ötanazi yapılan balıkları, laboratuvarla ilişkili kurum tarafından onaylanan prosedüre göre uygun bir hayvan karkası atık kabına atın.

5. Sperm örneklerinden DNA çıkarılması

  1. Tüm sperm örneklerini bir mini santrifüjde kısaca döndürün ve PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin.
  2. Termal çevrimcinin kapağını kapatın.
  3. Termal çevrimcide aşağıdaki ayarları çalıştırın:
    1. Numuneleri 95 °C'de 40 dakika ısıtın.
    2. Numuneleri 25 °C'ye soğutun.
  4. Numuneleri termal çevrimciden çıkarın.
  5. Her numune için temiz bir pipet ucu ile 10 μL 1 M Tris-HCl (pH 8'e tamponlanmış) ekleyerek pH'ı nötralize edin.
  6. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
  7. Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.
  8. Genomik DNA örnekleri 4 ° C'de birkaç gün saklanabilir veya 6 aya kadar -20 ° C'ye yerleştirilebilir.

6. İstenilen lokusun PCR amplifikasyonu (ve / veya kısıtlama özeti)

  1. Standart bir PCR protokolü kullanarak istenen lokusu yükseltin.
    1. Termal döngüleyiciyi aşağıdaki PCR reaksiyonundaki ilk denatürasyon sıcaklığına önceden ısıtın.
    2. PCR tüplerindeki her sperm örneği için 25 μL'lik bir reaksiyon karışımı hazırlayın:
      12,5 μL 2x Taq Polimeraz Ana Karışımı
      1,5 μL 10 μM ileri astar
      1,5 μL 10 μM ters astar
      4,5 μL nükleaz içermeyen su
      5 μL nötralize sperm DNA örneği
    3. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    4. Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.
    5. Numuneleri aşağıdaki ayarlarla önceden ısıtılmış termal döngüleyiciye yerleştirin:
      İlk denatürasyon: 3 dakika boyunca 95 °C
      35 döngü denatürasyon (30 s için 95 °C), tavlama (30 s için 55 °C) ve uzatma (30 s için 72 °C)
      Son uzatma: 5 dakika boyunca 72 °C
      NOT: Spesifik Taq polimerazına ve PCR amplifikasyon ürününün beklenen uzunluğuna bağlı olarak uzatma sıcaklığını ve/veya süresini ayarlamak gerekebilir.
    6. PCR numunelerini termal çevrimciden çıkarın.
  2. İsteğe bağlı: Donöre özgü kısıtlama sindirimini PCR ürününün küçük bir hacminde gerçekleştirin ve jel elektroforezi için en az 5-10 μL sindirilmemiş PCR ürünü bırakın.
    1. 0,2 mL PCR tüplerinde 30 μL'lik bir reaksiyon hazırlayın:
      10 μL saflaştırılmamış PCR ürünü
      15 μL nükleaz içermeyen su
      3 μL 10x restriksiyon enzim tamponu
      2 μL restriksiyon enzimi (BstNI, dnah10 knock-in alelini analiz etmek için temsili sonuçlarda kullanılır)
      NOT: Birçok restriksiyon enzimi tipik bir PCR reaksiyon tamponunda hala aktiftir; Bununla birlikte, kısıtlama özeti arabelleğinin eklenmesi sonuçların iyileştirilmesine yardımcı olabilir. Herhangi bir sorun oluşursa sorun gidermek için üreticinin özel talimatlarına bakın.
    2. Yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    3. Numuneleri bir mini santrifüjde kısaca döndürün.
    4. Numuneleri aşağıdaki ayarlara sahip bir termal döngüleyiciye yerleştirin:
      1. PCR amplikonu 1 saat boyunca 60 ° C'de kesin.
        NOT: Kesme sıcaklığının ve inkübasyon süresinin, kullanılan spesifik kısıtlama enzimi için ayarlanması gerekebilir.
      2. Üretici tarafından belirtilmişse, kısıtlama enzimini gerekli sıcaklık ve inkübasyon süresi ile devre dışı bırakın.
        NOT: BstNI enzimi ısı inaktivasyonu gerektirmez.

7. Farklı boyutlardaki PCR amplikonlarını ayırmak için jel elektroforezi yapılması

  1. 500 mL 0,5x TBE çalışma tamponu hazırlayın: 450 mL deiyonize suya 50 mL 10x TBE tampon konsantresi ekleyin.
  2. 0.5x TBE çalışma tamponunda 100 mL% 4 agaroz jeli hazırlayın: 100 mL 0.5x TBE çalışma tamponuna 10 μL 10.000x jel lekesi ile 4 g agaroz ekleyin. Agaroz tozu tamamen çözülene kadar mikrodalgada pişirin.
    1. Jel çözeltisini uygun boyutta bir jel döküm çerçevesine dökün ve tarağı jelin bir tarafına yerleştirin.
      NOT: Daha büyük bir jel boyutu (önerilen: 15 cm x 15 cm) bu prosedür için avantajlıdır, çünkü amplikonlara jel üzerinde çözülmesi için daha fazla alan sağlar.
      1. Bir kısıtlama özeti ürünü analiz edilecekse, sonuçların karşılaştırılabilmesi için PCR ürünüyle aynı jel üzerinde çalıştırmak en iyisidir. Tüm numuneleri jel üzerine sığdırmak için tarak kuyusu boyutunu gerektiği gibi ayarlayın.
    2. Jeli katılaşana kadar oda sıcaklığında bırakın. Tarağı dikkatlice çıkarın. Jeli döküm çerçevesinden dikkatlice çıkarın.
  3. Jel elektroforez makinesini kurun.
    1. Jeli, kuyucuklar negatif elektrota en yakın olacak şekilde elektroforez teçhizatına yerleştirin. Kuyucuklar tamamen suya batırılana kadar elektroforez makinesine 0,5x TBE çalışma tamponu dökün.
  4. Jeli yükleyin.
    1. İlk kuyucuğa 5 μL DNA merdiveni yükleyin (PCR amplikonuna benzer boyutta DNA parçaları içeren bir DNA merdiveni seçin).
    2. Her numune için yeni bir pipet ucu kullanarak (vahşi tip kontrol numunesi dahil), PCR ürününün 5-10 μL'sini kalan kuyucuklara yükleyin.
    3. İsteğe bağlı: Bir kısıtlama özeti ürünü analiz edilecekse, bu numuneleri de jele yükleyin.
      NOT: PCR ve kısıtlama sindirimi ürünü arasına eşit miktarda DNA yüklemek en iyisidir. Örneğin, 30 μL kısıtlama sindirimi sindirimi reaksiyonu karışımında, 10 μL PCR ürünü eklenmiştir. Bu nedenle, 15 μL sindirim ürününün DNA konsantrasyonu, 5 μL saflaştırılmamış PCR ürünü ile karşılaştırılabilirdi.
  5. Jeli çalıştırın.
    1. Elektrotları jel elektroforez tertibatına bağlayın ve amplikonların yeterli şekilde ayrılmasını sağlamak için en az 1 saat boyunca 150 V uygulayın.
    2. DNA bantlarını görüntülemek için jeli görüntüleyin.
      NOT: Güçlü bir şekilde mutajenize edilmiş CRISPR hedefli lokuslar, vahşi tip amplikonlarla yerleştirme / silme alellerinin bir kombinasyonunu temsil eden çoklu bant boyutları olarak çalışacaktır.
      1. Jel bantları 1 saat sonra çözülmezse, bantlar jel üzerinde yeterince ayrılana kadar 15 dakikalık aralıklarla jele 150 V uygulayın.
      2. İsteğe bağlı: SNP, epitop etiketi veya floresan etiketi gibi hassas bir düzenlemenin eklenmesi için tarama yapılıyorsa, sperm DNA'sını istenen düzenlemeye özgü PCR yöntemleriyle tarayın. Örneğin, donöre özgü bir kısıtlama bölgesi belirlerken, sperm örneğinin PCR ürününe kıyasla kısıtlama sindirimi ürününde ek bir bant bulunacaktır.

8. Germline stabil alellerin izole edilmesi

  1. Sperm sıkma prosedüründen 2 hafta dinlendikten sonra, sperm genomik DNA'sı istenen düzenlemeleri içeren F0 bireylerini geride bırakın.
    NOT: Bireysel spermatogonia klonlarından sperm üretimi zebra balıklarında siklik olabilir; Bu nedenle, istenen alel, çıkış sırasında sperm üretmiyor olabilir. Bu nedenle, ilk taramanın içerdiği aleli izole etmek için bir kereden fazla ek geçiş yapılması gerekebilir.
  2. F1 çapraz balıkları cinsel olarak olgunlaştıktan sonra, sperm genomik DNA'sının taranması sırasında gerçekleştirilen aynı PCR ve jel elektroforez protokolünü kullanarak standart genotipleme yöntemleriyle (örneğin, yüzgeç klip DNA'sı) devam edin.
    1. Sanger, istenen aynı düzenlemeye sahip F1 bireylerini tanımlamak için PCR ürünlerini sıralar.
    2. İsteğe bağlı: İstenen düzenleme bir kısıtlama sitesi sunar veya siteyi bozarsa, uygun bir kısıtlama özeti protokolüyle ekranlayın.
  3. Aynı istenen düzenlemeye sahip çapraz F1 heterozigotları.
  4. F2 soyunu beklenen fenotip ve / veya genomik düzenlemeler için tarayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolde açıklanan deneysel yaklaşımlar, F0 enjekte edilen erkek spermlerinin toplanmasından elde edilen binlerce genomun analizine odaklanarak genom düzenlemelerinin veya varsayılan zararlı alellerin daha hızlı tanımlanmasına izin verir. Şekil 2 , bu protokol kullanılarak elde edilen sonuçların nasıl yorumlanacağını vurgulamaktadır.

P2ry12 lokusunda mutasyon oluşturmak için, tek hücreli evre zebra balığı embriyolarına Cas9 endonükleaz ve p2ry12'...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, F0 erkek sperm genomlarına odaklanmış analiz yoluyla CRISPR-Cas teknolojisini kullanarak varsayılan genom düzenlemelerini veya hedeflenen mutasyonları hızlı bir şekilde karakterize etmek için bir yöntem açıklamaktadır. Bu protokol, spermin ötenazi olmadan örnekleme için hazır olduğu diğer hayvan modellerine uygun olmalıdır. Bu yöntem, istenen düzenlemeler için tarama verimini artırır ve özellikle nadir HDR aracılı zincirleme olayları tanımlamak için kullanışlıdır. Bu yaklaşım aynı zamanda, varsayılan bir F0 ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden Anna Hindes'e, sıcak atış yöntemini kullanarak kaliteli sperm genomik DNA'sı elde etme konusundaki ilk çabaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Artrit ve Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü tarafından Ödül kapsamında finanse edilmiştir (R01AR072009 to R.S.G.).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agaroz tozu Fisher BioReagentsBP1356-100
Üreme tanklarıCarolina Biological 
BstNI Kısıtlama EnzimiNEBR0168S
Cas9 EndonükleazIDT1081060
DNA Merdiveni, 100 bp Termo Bilimsel 
dnah10 donör yapısı   Tüpte Sigma-AldrichDNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru.
Hem 5' hem de 3' uçlardaki ilk üç fosfat bağında donör üzerindeki fosforotiyoat bağı (5'-CCTCTCTCTCTTTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTTCTGCCT
GGACCGAGTGTACCGTGCCGTC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 ileri astar Tüpte Sigma-AldrichDNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 ters astar ve nbsp;Tüpte Sigma-AldrichDNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 sentetik sgRNA Synthego Sentetik sgRNA, hedef dizi: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Elektroforez
güç kaynağıThermo Scientific 105ECA-115
Filtre forsepsKırlangıç XX6200006P
Balık (sistem) suJenerikn/a
Jel elektroforez sistemi (döküm çerçevesi, tarak ve elektroforez odası dahil) Termo Bilimsel B2
Jel görüntüleme ışık kutusu Azure BiosystemsAZI200-01
Jel boyası, 10000X InvitrogenS33102
Cam kase, 250 mL Jenerikn/a
İzolasyon tankları, 0.8 L AquaneeringZT080
Ampullü Microcap kılcal boru, 20 & L Drummond1-000-0020/CA
MinisantrifüjBio-Rad12011919EDU
Mikropipetler, uygun uçlara sahip çeşitliJenerik n/a
Mikrodalga Jenerik n/a
Nükleaz içermeyen suPromegaP119-C
Kağıt havluJenerikn/a
PCR tüpleri, 0,2 mLBioexpressT-3196-1
Plastik kaşık, delinmiş delikler/yuvalar Jenerikn/a
KCl çözeltisi, 0.2 M RNAse FreeSigma-AldrichP9333
p2ry12 ileri astar Tüpte Sigma-AldrichDNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 ters primerTüpte Sigma-AldrichDNA Oligo; 0.025 nM, standart tuz giderme saflaştırması, kuru (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 sentetik sgRNA Synthego Sentetik sgRNA, hedef dizi: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Restriksiyon
Enzimi 10X TamponNEBB6003SVIAL
NaOH çözeltisi, 50 mM Termo Bilimsel S318; 424330010
Sünger, 1 inç x 1 inç kesimli, küçük oval divot ileGenel n/a
StereomikroskopZeissStemi 508
Taq polimeraz ana karışımı, 2XPromegaM7122
TBE Tampon Konsantresi, 10XVWRE442
Termal DöngüleyiciBio-Rad1861096
Kağıt MendilFisher Scientific06-666
Trikain-metansülfonat çözeltisi (Syncaine, MS-222), balık suyunda% 0.016 (pH 7.0± 0.2) Syndel200-266
Tris Base, 1M (HCl ile ph 8.0 arası tamponlu) PromegaH5131
161937FERSM0241 İkinci El

Kaynaklar

  1. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
  2. Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31 (3), 227-229 (2013).
  3. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  4. Troutwine, B. R., et al. The Reissner fiber is highly dynamic in vivo and controls morphogenesis of the spine. Current Biology. 30 (12), 2353-2362 (2020).
  5. Xu, Y., Li, Z. CRISPR-Cas systems: Overview, innovations and applications in human disease research and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 2401-2415 (2020).
  6. Creaser, C. W. The technic of handling the zebrafish (Brachydanio rerio) for the production of eggs which are favorable for embryological research and are available at any specified time throughout the year. Copeia. 1930 (4), 159-161 (1934).
  7. Carmichael, C., Westerfiel, M., Varga, Z. M. Cryopreservatin and in vitro fertilization at the zebrafish international resource center. Methods in Molecular Biology. 546, 45-65 (2009).
  8. Wang, Y., Troutwine, B. R., Zhang, H., Gray, R. S. The axonemal dynein heavy chain 10 gene is essential for monocilia motility and spine alignment in zebrafish. Developmental Biology. 482, 82-90 (2021).
  9. Gray, R. S., et al. Postembryonic screen for mutations affecting spine development in zebrafish. Developmental Biology. 471, 18-33 (2021).
  10. Brocal, I., et al. Efficient identification of CRISPR/Cas9-induced insertions/deletions by direct germline screening in zebrafish. BMC Genomics. 17, 259(2016).
  11. Davis, M. W., Jorgensen, E. M. ApE, A Plasmid Editor: A freely available DNA manipulation and visualization program. Frontiers in Bioinformatics. 2, 816619(2022).
  12. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  13. Hill, J. T., et al. Poly Peak Parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
  14. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Research. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  15. Liu, Q., et al. Hi-TOM: A platform for high-throughput tracking of mutations induced by CRISPR/Cas systems. Science China. Life Sciences. 62 (1), 1-7 (2019).
  16. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  17. Draper, B. W., Moens, C. B. A high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments. (29), e1395(2009).
  18. Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

CRISPR Genom DüzenlemeZebrafish Germ hattı DüzenlemeleriSperm TaramaPCR Restriksiyon EnzimleriJel ElektroforeziIn Vitro FertilizasyonF0 Erkek TaşıyıcılarIndel TespitiTermal DöngüleyiciDNA Dizileme
Zebra balıklarında germline düzenlemelerinin hızlı izolasyonu için sperm taraması
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.