Method Article

Primer Dismenore Olan Sıçanlarda Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometrisi Kullanılarak Ham ve İşlenmiş Siperi Rizom Örneklerinin Analizi

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, ham ve işlenmiş Cyperi rizoma (CR) örneklerinin karşılaştırmalı bir analizi, primer dismenore olan sıçanlarda ultra yüksek performanslı sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS) kullanılarak sunulmuştur. Metabolitlerin ve örnek bileşenlerinin kan düzeylerindeki değişiklikler, CR ile tedavi edilen sıçanlar ve sirke (CRV) ile işlenmiş CR arasında incelendi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyperi rizomu (CR) jinekolojide yaygın olarak kullanılmaktadır ve Çin'deki kadın hastalıklarının tedavisinde kullanılan genel bir ilaçtır. Sirke ile işlendikten sonra CR'nin analjezik etkisi arttığından, sirke ile işlenen CR (CRV) genellikle klinik olarak kullanılır. Bununla birlikte, analjezik etkinin sirke işleme ile arttırıldığı mekanizma belirsizdir. Bu çalışmada, dismenore ile CR ile tedavi edilen ve CRV ile tedavi edilen sıçanlar arasındaki eksojen bileşenlerin ve metabolitlerin kan düzeylerindeki değişiklikleri incelemek için ultra yüksek basınçlı sıvı kromatografitandem kütle spektrometresi (UPLC-MS / MS) tekniği kullanılmıştır. Sonuçlar, bu sıçanların kanında 15 bileşenin ve iki metabolitin farklı seviyelerini ortaya çıkardı. Bunlar arasında, CRV grubundaki (-)-myrtenol ve [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroksi-1,4,7,7-tetrametilbisiklo [2.2.1]hept-2-yl]asetik asit seviyeleri CR grubundan oldukça yüksekti. CRV, proinflamatuar, trombosit agregasyonu ve vazokonstriksiyon aktiviteleri ile 2 seri prostanoidlerin ve 4 seri lökotrienlerin seviyesini azaltmış ve arakidonik asit ve linoleik asit metabolizmasını ve doymamış yağ asitlerinin biyosentezini modüle ederek analjezik etkiler sağlamıştır. Bu çalışma, sirke işlemenin CR'nin analjezik etkisini arttırdığını ve CRV'nin etki mekanizmasını anlamamıza katkıda bulunduğunu ortaya koymuştur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer dismenore (PD) klinik jinekolojide en sık görülen durumdur. Üreme sisteminde pelvik patoloji olmadan adet öncesi veya sırasında sırt ağrısı, şişlik, karın ağrısı veya rahatsızlık ile karakterizedir1. Prevalansı ile ilgili bir rapor, öğrencilerin% 85.7'sinin PD2'den muzdarip olduğunu göstermiştir. Düşük doz oral kontraseptifler standart tedavidir, ancak derin ven trombozu gibi yan etkileri giderek daha fazla dikkat çekmektedir3. Oral kontraseptif kullanıcılar arasında derin ven trombozu prevalansı 1.000 kadında >1'dir ve risk ilk 6-12 ay boyunca ve 40 yaşından büyük kullanıcılarda en yüksektir4.

Geleneksel Çin tıbbında (TCM) uzun süredir kullanılan Cyperi rizomu (CR), Cyperaceae familyasından Cyperus rotundus L.'nin kurutulmuş köksapından türetilmiştir. CR adet bozukluklarını düzenler ve depresyon ve ağrıyı hafifletir5. CR jinekolojide yaygın olarak kullanılır ve kadın hastalıklarını tedavi etmek için genel bir ilaç olarak kabul edilir6. Sirke (CRV) ile işlenen CR tipik olarak klinik olarak kullanılır. CR ile karşılaştırıldığında, CRV menstrüasyonun ve ağrının giderilmesinde gelişmiş düzenleme gösterir. Modern çalışmalar, CR'nin siklooksijenaz-2'yi (COX-2) ve ardından prostaglandinlerin (PG'ler) sentezini inhibe ettiğini ve böylece bir anti-enflamatuar etki elde ettiğini göstermiştir. Bu arada, CR yan etkileri olmayan analjezik bir etki gösterir7, bu da CR'yi dismenore hastaları için iyi bir seçim haline getirir. Bununla birlikte, menstrüasyonun düzenlenmesinin ve CRV ile ağrı kesici sağlanmasının altında yatan mekanizma belirsizdir. CR araştırması esas olarak aktif kimyasal bileşenlerindeki ve anti-enflamatuar, antidepresan ve analjezik etkileri gibi farmakolojik aktivitelerindeki değişikliklere odaklanmıştır 8,9,10,11,12.

TCM'nin bileşenleri karmaşık olmasına rağmen, kana emilirler ve etkili olmaları için belirli bir kan konsantrasyonuna ulaşmaları gerekir13. TCM'nin aktif bileşenlerinin taranmasının kapsamı, kanda bileşen belirleme stratejisi kullanılarak daraltılabilir. Kimyasal bileşenlerin in vitro olarak incelenmesinde körlükten kaçınılabilir ve bireysel bileşenlerin incelenmesinde tek taraflılıktan kaçınılabilir14. Kandaki CR ve CRV bileşimlerini karşılaştırarak, işlenmiş CR'nin aktif bileşenlerindeki değişiklikler etkili ve hızlı bir şekilde tespit edilebilir. İlaç etkinliği, bir ilacın vücudu etkilediği süreçtir. İlacın etki mekanizması ile ilişkili olabilecek vücudun metabolik tepkisine bağlı olarak ilaç bileşenlerindeki değişiklikler metabonomiklerle belirlenebilir. Metabonomik, geleneksel Çin tıbbının genel etkinliğini belirlemekle tutarlı olan genel ve dinamik metabolik yanıtları ölçmeyi amaçlamaktadır15. Ayrıca, metabolitler, fenotip16 ile en yakından ilişkili olan gen ekspresyonunun nihai ürünüdür. Bu nedenle, metabonomikler PD tedavisinde CR ve CRV arasındaki metabolik yolaklardaki farklılıkları araştırmak için uygun olabilir. sıvı kromatografisi-yüksek çözünürlüklü tandem kütle spektrometrisi (LC-MS / MS) tabanlı hedefsiz metabolomik, yüksek verim, yüksek hassasiyet ve yüksek çözünürlük ile karakterizedir ve birçok farklı küçük moleküler bileşeni ölçmek için kullanılabilir17,18 . Bu yöntem aynı anda kana emilen endojen metabolitleri ve eksojen bileşenleri belirleyebilir. Metabonomik, TCM19, ilaç toksikolojisi 20, sağlık yönetimi21, spor22, gıda23 ve diğer alanlardaki çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu çalışmada, CRV'nin analjezik etkilerinin mekanizmalarını ortaya çıkarmak için LC-MS/MS bazlı hedefsiz metabolomikler kullanılarak CR ile tedavi edilen dismenore model sıçanlar arasında kana emilen ekzojen bileşenler ile endojen metabolitlerdeki farklılıklar ölçülmüştür.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlarla ilgili tüm deneyler, TCM Chongqing Enstitüsü Deney Etik Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirildi. Bu deneyde 8-10 haftalık ve 200 g ± 20 g ağırlığında yirmi dört dişi Sprague Dawley sıçanı (SD) kullanılmıştır.

1. Ekstraksiyonun hazırlanması

  1. Hesaplama
    1. CR veya CRV ekstraktını 3 gün boyunca altı Sprague-Dawley sıçanından (10 g / [kg ∙ gün]) oluşan bir tedavi grubuna uygulamayı planlayın. 1 g / mL'lik bir CR veya CRV ekstrakt konsantrasyonu kullanın (ekstraktın 1 mL'si 1 g bitkiden elde edilir).
      NOT: CR dozu 6-10 g'dır. Bu çalışmada dozaj olarak maksimum 10 g doz kullanılmıştır. Yetişkin bir kişinin ortalama ağırlığı 60 kg olduğundan, yetişkin dozu 0.1667 g / kg'dır. Ağırlık dönüştürme algoritması24'e göre, insanlar ve sıçanlar arasındaki doz dönüşüm katsayısı 6.3 olduğundan, sıçanlar için dozaj 1.05 g / kg'dır. İlaç dozu, sıçanlar için 10 kat artarak 10.5 g / kg'a yükseltildi. Dozaj, hesaplama kolaylığı ve gerçek deney için 10 g / kg olarak ayarlanmıştır. Örneğin, hesaplamaya göre, toplam 36 g CR veya CRV'ye ihtiyaç duyulursa, Çin bitkisel ilacı en az iki kez hazırlanmalıdır. Böylece, 200 g CR gerekli olmuştur - CR olarak 100 g CR kullanılmış ve 100 g CR CRV'ye işlenmiştir.
    2. Denklemi kullanarak sıçan başına uygulanacak CR veya CRV hacmini hesaplayın (1):
      V = 10 g/(kg∙gün) × 200 g/(1 g/mL) = 2 mL (1)
  2. CRV'nin işlenmesi
    1. 100 g CR ve 20 g sirke (>5.5 g asetik asit / 100 mL) iyice karıştırın ve 12 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: CR'nin iç kısmının 12 saat sonra sirke ile nemlendirilmesini sağlamak için, CR ve sirke karıştırıldı, iyice karıştırıldı ve daha sonra iç kısım nemli olana kadar tekrar karıştırıldı.
    2. Karışımı bir demir tavada 110-120 ° C'de 10 dakika karıştırın-kızartın. Ardından, karışımı çıkarın ve oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
      NOT: CR'nin kavurmasını önlemek için, ısıtma sırasında sürekli karıştırmak gerekir. İşlenen CRV çok ıslaksa, 60 ° C'de kurutulabilir. CR'nin yüzeyi sepya olduğunda, kızartma durdurulabilir.
  3. Çıkarma
    1. CR özü
      1. CR'ye 10 kez (CR miktarı) saf su ekleyin ve 2 saat bekletin. Islatma sırasında tıbbi malzemelerin sıvı seviyesinin altında olduğundan emin olun.
        NOT: CR'nin ekstraksiyondan önce sadece ikiye bölünmesi gerekir. Islatmanın amacı, aktif bileşenleri daha etkili bir şekilde çıkarmaktır. Islatma işlemi esastır.
      2. Su ve ilaç karışımını yüksek ateşte kaynatın ve 20 dakika kısık ateşte kaynatın. Bir filtre bezi (100 ağ) ile filtreleyin ve filtreyi toplayın.
        NOT: Kaynatma sırasında, kaynatmadan önce yüksek bir ısı kullanılmış ve kaynamayı korumak için düşük bir ısı kullanılmıştır.
      3. Adım 1.3.1.2'yi bir kez tekrarlayın ve filtratları birleştirin.
      4. Ekstraktı döner bir buharlaştırıcı ile 1 g / mL'ye konsantre edin (orijinal ilaca dayanarak, konsantrasyon sıcaklığı 60 ° C'nin altında olmalıdır).
        NOT: CR'deki aktif bileşenler uçucudur, bu nedenle konsantrasyon sıcaklığı 60 °C'den yüksek olmamalıdır.
    2. CRV özü
      1. CR ayıklama yöntemiyle aynı adımları (1.3.1.1-1.3.1.3) gerçekleştirin.
    3. Test için CR özü
      1. 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 500 μL CR ekstraktı ve 500 μL metanol pipet ve karıştırmak için 30 sn boyunca girdap.
        NOT: Metanol ve su karışımı, aktif bileşenleri daha iyi ekstrakte eder. Ekstrakt, test için doğrudan filtrelenmemelidir.
      2. Her numuneyi 4 °C'de 1.6502 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı filtreleyin ve ardından test için numune şişesine aktarın.
        NOT: Metanol ve ekstrakt karışımının yüksek hızlı santrifüjlenmesinden sonra, süpernatant, filtrasyon olmadan belirlenmek üzere doğrudan numune şişesine aktarılabilir. Santrifüjleme işlemi tarafından üretilen ısı nedeniyle, kriyojenik bir santrifüj kullanılması tercih edilir.
    4. Test için CRV özü
      1. CRV özetini sınamaya hazırlamak için 1.3.3.1-1.3.3.2 adımlarını gerçekleştirin.

2. Hayvanlar

  1. Hesaplama
    1. 50 mg östradiol benzoat alın ve 50 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için 1 mL zeytinyağına ekleyin. 50 mg oksitosin alın ve 1 mg / mL'lik bir çözelti hazırlamak için 50 mL normal saline ekleyin.
      NOT: Estradiol benzoat ve oksitosinin intraperitoneal enjeksiyonunun dozu 10 mg / (kg ∙ gün) 'dür. Estradiol benzoat zeytinyağında çözülür ve oksitosin normal salin içinde çözülür. Estradiol benzoatın zeytinyağında çözünmesi kolay değildir ve çözünmeyi hızlandırmak için ultrasonla tedavi edilebilir. Hem östradiol benzoat hem de oksitosin çözeltileri günlük olarak hazırlanmalıdır.
    2. Sıçan başına uygulanacak östradiol benzoat çözeltisinin hacmini hesaplayın (yani, V = 10 mg / [kg ∙ gün] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL). Sıçan başına uygulanacak oksitosin çözeltisinin hacmini hesaplayın (yani, V = 10 mg / [kg ∙ gün] × 200 g / [1 g / mL] = 2 mL).
  2. Hayvan gruplama ve yönetimi
    NOT: Yönetim içinon gün süre verilmiştir 25,26. Tedavi sırasında, sıçanların standart chow ve suya sınırsız erişimi vardı. Oksitosin uygulamasından sonraki 30 dakika içinde, her sıçanın kıvranma aktivitesi izlendi. PD sıçan modeli, model sıçanların uterus kasılması, bir uzuv rotasyonu, arka ekstremite uzantısı, içi boş bir gövde ve abdominal kasılması26'yı içeren büküm tepkileriyle kanıtlandığı gibi, başarıyla geliştirilmiştir.
    1. 24 dişi Sprague-Dawley sıçanını (SD sıçanlar, 8-10 haftalık, 200 g ± 20 g ağırlığında) rastgele kontrol, model, CR ve CRV'de dört gruba ayırın ve 7 gün boyunca besleyin.
    2. Hayvan yönetimi
      1. Model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlara her gün 2 mL östradiol benzoat çözeltisi enjekte ederek intraperitoneal olarak enjekte edilir. Kontrol grubundaki sıçanlara intraperitoneal olarak 2 mL normal salin enjekte edin.
      2. 8. günden itibaren 2.2.2.1 adımını tamamlayın. Daha sonra, CRV grubundaki sıçanlara intragastrik olarak 2 mL CRV ekstresi, CR grubundaki sıçanlara 2 mL CR ekstresi ve kontrol ve model gruplarındaki sıçanlara 2 mL normal salin uygulayın.
      3. 10. günde, 2.2.2.2 adımını tamamlayın. Daha sonra, model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlara 2 mL oksitosin çözeltisi ve kontrol grubundaki sıçanlara 2 mL normal salin ile intraperitoneal olarak enjekte edin.
    3. Oksitosin enjeksiyonundan sonraki 30 dakika içinde sıçanların kıvrılma sürelerini kaydedin.
  3. Örnek toplama
    1. Abdominal aort kan örneklerini toplayın, uterusu hızlı ve tamamen çıkarın ve uterus duvarına yapışan bağ dokusunu ve yağları dikkatlice ayırın.
      NOT: Kan, son dozdan sonra 1 saat içinde toplandı.
    2. Rahim dokusunu korumak ve sıvı azota aktarmak için mikrosantrifüj tüpleri kullanın. Doku örneklerini -80 °C'de saklayın.
    3. Kan örneklerini 4.125 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Serum içeren süpernatanı çıkarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.502 × g'da santrifüj yapın. Serumu santrifüj edin ve daha sonra depolama için tüpte -80 ° C'de tutun.
      NOT: Kan örnekleri yeniden işlenmek üzere oda sıcaklığında 1 saat bekletilmelidir.
  4. Numune işleme
    1. Serum örnekleri
      1. Bir mikrosantrifüj tüpüne 400 μL metanol ve 200 μL serum koyun ve karıştırmak için 30 s boyunca vorteks koyun. Her numuneyi 4 °C'de 16.502 × g'da 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Toplama ve filtrelemeden sonra numune şişelerini süpernatantla doldurun. Test için kalite kontrol numuneleri hazırlamak üzere her numunedeki tüm süpernatantları aynı hacimle karıştırın.
    2. Rahim dokusu örnekleri
      1. İpsilateral segmentten 100 mg uterus dokusu alın ve dokuz kat normal salin hacmi ile öğütün. Homojenatı 4.125 × g'da 10 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatanı toplayın. Süpernatantı test için 4 ° C'de veya aynı gün test edilmeyecek ise -80 ° C'de bir buzdolabına yerleştirin.
      2. Normal salin, doku ve çelik bilyeleri 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin, mikrosantrifüj tüpünü 3-5 s boyunca sıvı azot içine koyun ve ardından dokuyu taşlama için bir doku öğütücüye koyun.
  5. Numune testi
    1. Sıçan örneklerinin uterus dokularındaki PGF2α ve PGE2 içeriğini ölçmek için enzime bağlı bir immünosorbent testi (ELISA) kullanın.
      NOT: PGE 2 içeriğini ölçmek için sıçan PGE2 ELISA kiti kullanıldı ve PGF 2α seviyesini ölçmek için sıçan PGF2α ELISA kiti kullanıldı. Ayrıntılı adımlar üreticinin talimatlarında bulunabilir. Kitin detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.
    2. Serum örneğini, CR ekstraktını ve CRV ekstraktını UPLC-MS/MS kullanarak değerlendirin.
      1. UPLC için, bir C18 sütunu (2.6 μm, 2.1 mm x 100 mm) ve% 0.1 formik asit içeren mobil faz A ve asetonitril içeren mobil faz B ile ikili gradyan yöntemi kullanın. Elüsyon gradyanını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0 dakikadan 1 dakikaya,% 15 B; 1 dakika ila 8,5 dakika,% 15 ila% 85 B; 8,5 dakikadan 11,5 dakikaya,% 85 B; 11,5 dakika ila 11,6 dakika,% 99 ila% 1 B; ve 11,6 dakika ila 15 dakika arasında,% 15 B. Akış hızını 0,35 mL / dak ve enjeksiyon hacmini 2 μL'ye ayarlayın.
      2. MS için sıcaklığı 600 °C'ye, perde gazı (CUR) akış hızını 0,17 MPa'ya ve hem kılıf hem de yardımcı gaz akış hızlarını 0,38 MPa'ya ayarlayın. Pozitif iyon modunun ve negatif iyon modunun iyon püskürtme voltajını sırasıyla 5,5 kV ve -4,5 kV, kümelenme potansiyeli (DP) voltajını 80 V veya -80 V, çarpışma enerjisini (CE) 40 eV veya -25 eV ve çarpışma enerjisi süperpozisyonu (CES) 35 eV ± 15 eV olarak ayarlayın.
      3. UPLC-MS/MS kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek testi gerçekleştirin. MS'i 50-1.000 m/z kütle aralığında gerçekleştirin.
      4. UPLC-MS/MS sonuçlarını, algılama modunun bilgiye bağımlı alımı, çoklu kütle hatası filtresi ve dinamik arka plan çıkarımı ile birlikte eşleşen iş istasyonu programını kullanarak elde edin. Geleneksel yaklaşımı doğrulamak amacıyla UPLC-MS/MS ekipmanının tekrarlanabilirliğini ve kararlılığını test etmek için havuzlanmış serumun kalite kontrol örneklerini kullanın. Araştırma numunelerinden önce, art arda dört çalışma için kalite kontrol numunelerini enjekte edin ve ardından her beş serum örneğinden sonra enjekte edin.

3. Veri işleme

  1. Veri hazırlama
    1. Ham verileri mzXML biçimine dönüştürmek için dönüştürme yazılımı kullanın. Her numunenin toplam iyon akımı (TIC) verilerini normalleştirin.
      NOT: XCMS üzerine kurulu dahili bir R tabanlı uygulama (www.lims2.com), entegrasyon, hizalama, ayıklama ve tepe algılama bilgilerini analiz etmek içinkullanılmıştır 27.
    2. Özel bir MS2 veritabanı (www.lims2.com) kullanarak metabolit ek açıklaması gerçekleştirin. Ek açıklama eşiğini 0,328 olarak ayarlayın.
      NOT: Endojen metabolitler her grupta tanımlandı.
  2. Ana bileşen analizi ve ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analizi
    1. Ana bileşen analizini (PCA) ve modellemeyi gerçekleştirmek için analiz yazılımını kullanın. Metabolitlerin standartlaştırılmış verilerini analiz yazılımına aktarın. Ardından, analiz modelini oluşturmak için otomatik sığdırmayı kullanın. Son olarak, PCA'nın skor dağılım grafiğini elde etmek için skoru kullanın.
      NOT: Her grubun kümelenmesi PCA'nın skor dağılım grafiği ile elde edilmiştir. PCA, esas olarak numuneleri müdahale etmeden boyut küçültme yoluyla gruplandıran denetimsiz bir analiz modudur.
    2. Ortogonal kısmi en küçük kare diskriminant analizini (OPLS-DA) gerçekleştirmek için analiz yazılımını kullanın.
      1. CR ve CRV gruplarındaki metabolitlerle ilgili standartlaştırılmış verileri analiz yazılımına aktarın.
      2. Verileri CR grubundan oluşturulan CR grubuna alın ve verileri CRV grubundan oluşturulan CRV grubuna alın.
        NOT: OPLS-DA denetimli bir analiz modudur ve örneklerin gruplandırılması gereklidir.
      3. Ardından, analiz modelini oluşturmak için otomatik sığdırmayı kullanın ve OPLS-DA'nın puan dağılım grafiğini elde etmek için puanı kullanın. Son olarak, OPLS-DA'daki projeksiyon (VIP) değerindeki değişken anlamlılığı elde etmek için VIP'yi kullanın.
        NOT: CR ve CRV gruplarındaki metabolitlerin projeksiyon (VIP) değerlerindeki değişken anlamlılık OPLS-DA aracılığıyla elde edilmiştir.
  3. Potansiyel diferansiyel metabolitlerin tanımlanması
    1. Adım 3.2.2.3'te VIP değerleri 1'den büyük olan metabolitleri eleyin.
    2. Öğrencinin t-testi tarafından adım 3.3.1'de taranan metabolitlerin P değerini hesaplamak için istatistiksel yazılım kullanın.
      NOT: CR ve CRV gruplarındaki potansiyel diferansiyel metabolitlerdeki anlamlı farklılıklar bir Student'ın t-testi ile belirlendi. Potansiyel diferansiyel metabolitler, bir Student'ın t-testi p-değeri 0.05 < ve projeksiyonda (VIP) 1'den büyük değişken bir öneme sahip olanlardı. Temsil, volkanik bir arsa kullanılarak gerçekleştirildi.
  4. Diferansiyel metabolitlerin tanımlanması
    1. Adım 3.3'te potansiyel diferansiyel metabolitleri inceleyin. Bu diferansiyel metabolitleri tanımlamak için adım 3.1.2'nin sonuçlarını kullanın.
      NOT: Az sayıda potansiyel diferansiyel metabolit tanımlanmıştır ve bunlar aday diferansiyel metabolitler haline gelmiştir.
    2. KEGG veritabanında eşleştirilecek diferansiyel metabolitleri eleyin. CR ve CRV gruplarındaki diferansiyel metabolitlerdeki değişiklikleri bir ısı haritası çizerek gösterin.
      NOT: Az sayıda aday diferansiyel metabolit eşleştirildi ve bunlar diferansiyel metabolitler haline geldi.
  5. Potansiyel metabolik yolakların incelenmesi
    1. Farklı metabolitleri Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca) veritabanına yükleyin.
    2. Potansiyel metabolik yolları elde etmek için Yol Analizi'ni kullanın.
      NOT: Potansiyel metabolik yollar CR ve CRV gruplarında elde edildi. P değeri ve etki değeri, kritik yolların seçiminde çok önemli iki göstergeydi. P değeri, etki değerinden daha önemliydi. Anlamlılık, 0.05 < bir P değeri ile tanımlandı; Daha büyük etki değerleri daha iyi korelasyonlarla ilişkilendirildi.
    3. Farklı metabolitleri KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) veritabanına yükleyerek potansiyel metabolik yolları analiz edin.
      NOT: Metabolik yolun fonksiyonu ile PD arasındaki ilişki de göz önünde bulundurulmalıdır. Kritik metabolik yolaklar elde edildi.
  6. Kana emilen bileşenlerin tanımlanması
    1. Şirket içi MS2 veritabanı (www.lims2.com), İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB) ve Massbank ve Chemspider veritabanlarını kullanarak CR ve CRV ekstraktlarındaki kimyasal bileşenleri tanımlayın.
    2. CR ve CRV gruplarında kana emilen bileşenleri belirleyin ve CR ve CRV grupları arasındaki bileşenleri karşılaştırın.
      NOT: Kana emilen bileşenler CR veya CRV gruplarında tespit edilmelidir, ancak kontrol grubunda tespit edilemez.
  7. İstatistiksel analiz
    1. Tek değişkenli analiz (UVA) ve varyans analizi (ANOVA) ve Öğrencinin t-testi dahil olmak üzere çok değişkenli istatistiksel yöntemleri kullanarak verileri analiz edin.
      NOT: Deneysel bilgiler ortalama ± standart sapma (±SD) olarak istatistiksel yazılım kullanılarak sunulmuştur. P < 0.01 oldukça anlamlı bir fark olarak kabul edildi ve P < 0.05 anlamlı bir farkı temsil etti28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dismenore modeli deneyinin analizi
Kontrol grubunda 30 dakika içinde kıvranan bir yanıt yoktu, çünkü bu sıçanlara ağrıya neden olmak için intraperitoneal olarak oksitosin ve östradiol benzoat enjekte edilmedi. Model, CR ve CRV gruplarındaki sıçanlar, oksitosin enjeksiyonunu takiben önemli kıvranma reaksiyonları gösterdi. Bu sonuçlar, dismenoreyi indüklemek için östradiol benzoat ve oksitosin kombinasyonunun etkinliğini göstermektedir. Model ve kontrol grupları arasındaki PGF 2α, PGE 2 ve PGF2α

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TCM'lerin çok çeşitli ve farklı doğası nedeniyle, bu otlar bazen klinik uygulamada çalışmaz ve bu, TCM'lerin uygun olmayan şekilde işlenmesi ve kaynatılmasından kaynaklanabilir. TCM'nin mekanizmaları çağdaş bilim ve teknolojinin kullanımı ile daha belirgin hale gelmektedir29,30. Bu çalışma, PD model sıçanlarda hem CR hem de CRV'nin terapötik etkilere sahip olduğunu ve CRV'nin terapötik etkisinin daha önemli olduğunu göstermektedir. CRV'nin etki mekanizması, sirke...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Chongqing Belediye Sağlık ve Aile Planlaması Komisyonu Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Projesi (Proje Numarası: ZY201802297), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı'nın Genel Projesi (Proje Numarası: cstc2019jcyj-msxmX065), Chongqing Modern Dağ Alanı Karakteristik Yüksek Verimli Tarım Teknolojisi Sistemi İnovasyon Ekibi Bina Planı 2022 [10] ve Çin Materia'nın Chongqing Belediye Sağlık Komisyonu Anahtar Disiplin İnşaat Projesi tarafından desteklenmiştir Medica İşleme.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Asetonitril Fisher Scientific, Pittsburg, PA, ABD197164
BECKMAN COULTER Mikrofüj 20Beckman  Coulter, Inc.
Estradiol benzoatShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
formik asitFisher Scientific, Pittsburg, PA, ABD177799
LC 30A sistemiShimadzu, Kyoto, Japonya228-45162-46
ZeytinyağıShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Oksitosin sentetikZhejiang peptit biyoloji Co, Ltd & nbsp;
Sıçan PGF2α ELISA kitiShanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Sıçan PGFE2 ELISA kitiŞangay lmai Biyomühendislik Co., LtdEDL202006217
SPF Sprague-Dawley sıçanlarıHunan SJA Laboratory Animal Co., LtdSertifika numarası SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Avusturya1510002987
Üçlü TOF 4600 sistemiSCIEX, Framingham, MA, ABDBK20641402
suFisher Scientific, Pittsburg, PA, ABD152720
MRZ15K0472019092001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yu, W. Y., et al. Acupuncture for primary dysmenorrhea: A potential mechanism from an anti-inflammatory perspective. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 1907009(2021).
  2. Rafique, N., Al-Sheikh, M. H. Prevalence of primary dysmenorrhea and its relationship with body mass index. Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 44 (9), 1773-1778 (2018).
  3. Tong, H., et al. Bioactive constituents and the molecular mechanism of Curcumae Rhizoma in the treatment of primary dysmenorrhea based on network pharmacology and molecular docking. Phytomedicine. 86, 153558(2021).
  4. Ferries-Rowe, E., Corey, E., Archer, J. S. Primary dysmenorrhea: Diagnosis and therapy. Obstetrics & Gynecology. 136 (5), 1047-1058 (2020).
  5. Lu, J., et al. The association study of chemical compositions and their pharmacological effects of Cyperi Rhizoma (Xiangfu), a potential traditional Chinese medicine for treating depression. Journal of Ethnopharmacology. 287, 114962(2021).
  6. Lu, J., et al. Quality status analysis and intrinsic connection research of growing place, morphological characteristics, and quality of Chinese medicine: Cyperi Rhizoma (Xiangfu) as a case study. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2022, 8309832(2022).
  7. Taheri, Y., et al. Cyperus spp.: A review on phytochemical composition, biological activity, and health-promoting effects. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 4014867(2021).
  8. El-Wakil, E. A., Morsi, E. A., Abel-Hady, H. Phytochemical screening, antimicrobial evaluation and GC-MS analysis of Cyperus rotundus. World Journal Of Pharmacy And Pharmaceutical Sciences. 8 (9), 129-139 (2019).
  9. Rocha, F. G., et al. Preclinical study of the topical anti-inflammatory activity of Cyperus rotundus L. extract (Cyperaceae) in models of skin inflammation. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112709(2020).
  10. Hao, G., Tang, M., Wei, Y., Che, F., Qian, L. Determination of antidepressant activity of Cyperus rotundus L extract in rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research. 16 (4), 867-871 (2017).
  11. Kakarla, L., et al. Free radical scavenging, α-glucosidase inhibitory and anti-inflammatory constituents from Indian sedges, Cyperus scariosus R.Br and Cyperus rotundus L. Pharmacognosy Magazine. 12 (47), 488-496 (2016).
  12. Shakerin, Z., et al. Effects of Cyperus rotundus extract on spatial memory impairment and neuronal differentiation in rat model of Alzheimer's disease. Advanced Biomedical Research. 9 (1), 17-24 (2020).
  13. Li, J., et al. Pharmacokinetics of caffeic acid, ferulic acid, formononetin, cryptotanshinone, and tanshinone IIA after oral Administration of naoxintong capsule in rat by HPLC-MS/MS. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2017, 9057238(2017).
  14. Zhang, A., et al. Metabolomics: Towards understanding traditional Chinese medicine. Planta Medica. 76 (17), 2026-2035 (2010).
  15. Li, L., Ma, S., Wang, D., Chen, L., Wang, X. Plasma metabolomics analysis of endogenous and exogenous metabolites in the rat after administration of Lonicerae Japonicae Flos. Biomedical Chromatography. 34 (3), 4773(2020).
  16. Guijas, C., Montenegro-Burke, J. R., Warth, B., Spilker, M. E., Siuzdak, G. Metabolomics activity screening for identifying metabolites that modulate phenotype. Nature Biotechnology. 36 (4), 316-320 (2018).
  17. Hu, L., et al. Functional metabolomics decipher biochemical functions and associated mechanisms underlie small-molecule metabolism. Mass Spectrometry Reviews. 39 (5-6), 417-433 (2020).
  18. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  19. Liu, F., et al. Metabonomics study on the hepatoprotective effect of Panax notoginseng leaf saponins using UPLC/Q-TOF-MS analysis. The American Journal of Chinese Medicine. 47 (3), 559-575 (2019).
  20. Zhao, L., Hartung, T. Metabonomics and toxicology. Methods in Molecular Biology. 1277, 209-231 (2015).
  21. Martin, F. J., Montoliu, I., Kussmann, M. Metabonomics of ageing - Towards understanding metabolism of a long and healthy life. Mechanisms of Ageing and Development. 165, 171-179 (2017).
  22. Heaney, L. M., Deighton, K., Suzuki, T. Non-targeted metabolomics in sport and exercise science. Journal of Sports Sciences. 37 (9), 959-967 (2019).
  23. Yang, Y., et al. Metabonomics profiling of marinated meat in soy sauce during processing. Journal of the Science of Food and Agriculture. 98 (4), 1325-1331 (2018).
  24. Xu, S. Y. Methodology of Pharmacological Experiment. , People's Medical Publishing House. Beijing, China. (2002).
  25. Ma, B., et al. An integrated study of metabolomics and transcriptomics to reveal the anti-primary dysmenorrhea mechanism of Akebiae Fructus. Journal of Ethnopharmacology. 270, 113763(2021).
  26. Li, X., et al. Regulation of mild moxibustion on uterine vascular and prostaglandin contents in primary dysmenorrhea rat model. Evidence-Based Complementary and Alternative. 2021, 9949642(2021).
  27. Smith, C. A., Want, E. J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry. 73 (3), 779-787 (2006).
  28. Wang, D., et al. UPLC-MS/MS-based rat serum metabolomics reveals the detoxification mechanism of Psoraleae Fructus during salt processing. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 5597233(2021).
  29. Wang, X., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA 210/ISCU1/2(COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801(2019).
  30. Xie, H., et al. Raw and vinegar processed Curcuma wenyujin regulates hepatic fibrosis via bloking TGF-β/Smad signaling pathways and up-regulation of MMP-2/TIMP-1 ratio. Journal of Ethnopharmacology. 246, 111768(2020).
  31. Jung, S. H., et al. α-Cyperone, isolated from the rhizomes of Cyperus rotundus, inhibits LPS-induced COX-2 expression and PGE2 production through the negative regulation of NFkappaB signalling in RAW 264.7 cells. Journal of Ethnopharmacology. 147 (1), 208-214 (2013).
  32. Dantas, L. B. R., et al. Nootkatone inhibits acute and chronic inflammatory responses in mice. Molecules. 25 (9), 2181(2020).
  33. Xu, Y., et al. Nootkatone protects cartilage against degeneration in mice by inhibiting NF- κB signaling pathway. International Immunopharmacology. 100, 108119(2021).
  34. Heimfarth, L., et al. Characterization of β-cyclodextrin/myrtenol complex and its protective effect against nociceptive behavior and cognitive impairment in a chronic musculoskeletal pain model. Carbohydrate Polymers. 244, 116448(2020).
  35. Viana, A., et al. (-)-Myrtenol accelerates healing of acetic acid-induced gastric ulcers in rats and in human gastric adenocarcinoma cells. European Journal of Pharmacology. 854, 139-148 (2019).
  36. Bejeshk, M. A., et al. Anti-inflammatory and anti-remodeling effects of myrtenol in the lungs of asthmatic rats: Histopathological and biochemical findings. Allergologia et Immunopathologica. 47 (2), 185-193 (2019).
  37. Christie, W. W., Harwood, J. L. Oxidation of polyunsaturated fatty acids to produce lipid mediators. Essays in Biochemistry. 64 (3), 401-421 (2020).
  38. Wiktorowska-Owczarek, A., Berezinska, M., Nowak, J. Z. PUFAs: Structures, metabolism and functions. Advances in Clinical and Experimental. 24 (6), 931-941 (2015).
  39. Araujo, P., et al. The effect of omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids on the production of cyclooxygenase and lipoxygenase metabolites by human umbilical vein endothelial cells. Nutrients. 11 (5), 966(2019).
  40. Shahidi, F., Ambigaipalan, P. Omega-3 polyunsaturated fatty acids and their health benefits. Annual Review of Food Science and Technology. 9, 345-381 (2018).
  41. Meier, S., Ledgard, A. M., Sato, T. A., Peterson, A. J., Mitchell , M. D. Polyunsaturated fatty acids differentially alter PGF(2α) and PGE2 release from bovine trophoblast and endometrial tissues during short-term culture. Animal Reproduction Science. 111 (2), 353-360 (2009).
  42. Cheng, Z., et al. Altering n-3 to n-6 polyunsaturated fatty acid ratios affects prostaglandin production by ovine uterine endometrium. Animal Reproduction Science. 143 (1-4), 38-47 (2013).
  43. Sultan, C., Gaspari, L., Paris, F. Adolescent dysmenorrhea. Endocrine Development. 22, 171-180 (2012).
  44. Zeev, H. M. D., Craig, L. M. D., Suzanne, R. M. D., Rosalind, V. M. D., Jeffrey, D. M. D. Urinary leukotriene (LT) E4 in adolescents with dysmenorrhea: A pilot study. Journal of Adolescent Health. 27 (3), 151-154 (2000).
  45. Fajrin, I., Alam, G., Usman, A. N. Prostaglandin level of primary dysmenorrhea pain sufferers. Enfermería Clínica. 30, 5-9 (2020).
  46. Iacovides, S., Avidon, I., Baker, F. C. What we know about primary dysmenorrhea today: a critical review. Human Reproduction Update. 21 (6), 762-778 (2015).
  47. Barcikowska, Z., Rajkowska-Labon, E., Grzybowska, M. E., Hansdorfer-Korzon, R., Zorena , K. Inflammatory markers in dysmenorrhea and therapeutic options. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1191(2020).
  48. Wang, T., et al. Arachidonic acid metabolism and kidney inflammation. International Journal of Molecular Science. 20 (15), 3683(2019).
  49. Szczuko, M., et al. The role of arachidonic and linoleic acid derivatives in pathological pregnancies and the human reproduction process. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9628(2020).
  50. Serrano-Mollar, A., Closa, D. Arachidonic acid signaling in pathogenesis of allergy: Therapeutic implications. Current Drug Targets-Inflammation and Allergy. 4 (2), 151-155 (2005).
  51. Toit, R. L., Storbeck, K. H., Cartwright, M., Cabral, A., Africander, D. Progestins used in endocrine therapy and the implications for the biosynthesis and metabolism of endogenous steroid hormones. Molecular and Cellular Endocrinology. 441, 31-45 (2017).
  52. Ghayee, H. K., Auchus, R. J. Basic concepts and recent developments in human steroid hormone biosynthesis. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 8 (4), 289-300 (2007).
  53. Liang, J. J., Rasmusson, A. M. Overview of the molecular steps in steroidogenesis of the GABAergic neurosteroids allopregnanolone and pregnanolone. Chronic Stress. 2, 2470547018818555(2018).
  54. Pettus, B. J., et al. The sphingosine kinase 1/sphingosine-1-phosphate pathway mediates COX-2 induction and PGE2 production in response to TNF-α. The FASEB Journal. 17 (11), 1411-1421 (2003).
  55. Zeidan, Y. H., et al. Acid ceramidase but not acid sphingomyelinase is required for tumor necrosis factor-α-induced PGE2 production. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24695-24703 (2006).
  56. Kawamori, T., et al. Role for sphingosine kinase 1 in colon carcinogenesis. The FASEB Journal. 23 (2), 405-414 (2009).
  57. Hannun, Y. A., Obeid, L. M. Sphingolipids and their metabolism in physiology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (3), 175-191 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cyperi RhizomaVinegar ProcessingPrimary DysmenorrheaLiquid ChromatographyTandem Mass SpectrometryMetabonomics AnalysisDifferential MetabolitesKEGG PathwayPrincipal Component AnalysisOrthogonal Partial Least Squares

Related Articles