Stentor coeruleus'ta Alışkanlık Eğitimi

Öğrenme genellikle karmaşık bir sinir sistemi ile ilişkilidir, ancak tek hücrelere kadar her seviyedeki yaşamın akıllı davranışlar sergileyebileceğine dair kanıtlar artmaktadır. Hem doğal hem de yapay sistemlerde öğrenme, yeni bilgilere dayanan sistem parametrelerinin uyarlanabilir güncellenmesidir¹ ve zeka, öğrenmeyi kolaylaştıran hesaplama sürecinin bir ölçüsüdür².

Stentor coeruleus , tekrarlanan bir uyaranın ardından davranışsal bir tepkinin azaldığı bir öğrenme şekli olan alışkanlık sergileyen tek hücreli bir gölette yaşayan organizmadır³. Stentor , sucul avcılardan belirgin bir kaçış tepkisi olan mekanik stimülasyon^3'e yanıt olarak büzülür. Bununla birlikte, tekrarlanan düşük kuvvet pertürbasyonları, kasılma olasılığında ilerleyici bir azalma ile gösterilen alışkanlığı indükler³. Alışılmış Stentor, yüksek kuvvetli mekanik stimülasyon⁴ veya fotik stimülasyon 5 aldıktan sonra hala^büzülür. Thompson ve Spencer'ın hayvanlarda alışkanlık için klasik kriterleri⁶ ile uyumlu olan bu gözlemler, orijinal kasılma yanıtı azalmasının yorgunluk veya ATP tükenmesinden ziyade öğrenmeden kaynaklandığını kuvvetle göstermektedir. Serbest yaşayan bir hücre olarak Stentor , çok hücreli bir dokuda olduğu gibi, çevredeki hücrelerden çok fazla müdahale olmadan incelenebilir. Birkaç ek özellik, Stentor'u öğrenmeyi incelemek için izlenebilir bir sistem haline getirir: büyük boyutu (1 mm), ölçülebilir alışkanlık yanıtı³, enjeksiyon ve mikromanipülasyon kolaylığı⁷, tam sıralı genom⁸ ve RNA girişim (RNAi) araçlarının mevcudiyeti⁹. Bu model organizmayı beyin veya sinir sistemi olmadan hücre öğrenimini keşfetmek için kullanmak, Stentor hücrelerini uyarmak ve yanıtı ölçmek için tekrarlanabilir bir prosedür gerektirir.

Burada, belirli bir kuvvet ve frekansta mekanik darbeler verebilen mikrodenetleyici kartına bağlı bir cihaz kullanarak Stentor alışkanlığını ölçmek için, aparatı oluşturma ve deneyi dış karışıklıkları en aza indirecek şekilde kurma yöntemleri de dahil olmak üzere bir yöntem sunuyoruz (Şekil 1). Alışkanlığı tek bir hücre düzeyinde anlamak, karmaşık devrelerden bağımsız öğrenme paradigmalarını karakterize etmeye yardımcı olacaktır.

Şekil 1: Alışkanlık deneyi kurulumu. Stentor içeren Petri plakası, alışkanlık cihazının esnek metal cetvelinin üzerine yerleştirilir. Alışkanlık cihazının armatürü daha sonra metal cetveli belirli bir kuvvet ve frekansta vurur ve hücre alanı boyunca bir uyaran dalgası üretir. USB mikroskop kamerası, Stentor'un stimülasyona verdiği tepkileri kaydeder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Alışkanlık denemesi iş akışının özeti. Şekil, alışkanlık cihazını kullanarak Stentor'u incelemede yer alan temel adımları göstermektedir. Figür BioRender.com ile yaratıldı. BioRender.com (2022) tarafından "Süreç Akış Şeması" ndan uyarlanmıştır. https://app.biorender.com/biorender-templates'dan alındı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Alışkanlık deneyi iş akışının bir özeti Şekil 2'de gösterilmiştir.

1. Alışkanlık cihazının montajı

1. Motor sürücüsünü motora bağlayın (bkz. Şekil 3).
   1. Sürücü kartından A etiketli iki kabloyu motordaki mavi ve kırmızı tellere bağlayın. B etiketli iki kabloyu sürücü kartından motordaki yeşil ve siyah tellere bağlayın.
      NOT: Motor kabloları üstte olacak şekilde sürücü kartına yukarıdan bakıldığında, dört giriş kablosu motor kablolarına şu sırayla bağlanmalıdır: mavi, kırmızı, siyah ve yeşil.
2. LED'leri doğru polaritede bağlamak için özel bir dikkatle Şekil 4'te gösterilen breadboard devresini oluşturun.
3. Vcc'yi (+5 V) sürücü kartından beyaz breadboard'un üst rayına ve Gnd'yi sürücü kartonundan breadboard'un alt rayına bağlayın.
4. Breadboard'un zeminini mikrodenetleyici kartının toprak pimine bağlayın. Yeşil LED'i, kırmızı LED'i, anahtarı ve düğme tellerini sırasıyla mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 8, 9, 10 ve 11'e bağlayın.
5. Mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 2 ve 3'ü sürücü kartı kablolarına bağlayın Step ve Dir.
6. Mikrodenetleyici kartı dijital pimleri 4, 5, 6 ve 7'yi sürücü kartı kablolarına bağlayın.
   1. Pin 4'ü MS1'e, Pin 5'i MS2'ye, Pin 6'yı MS3'e bağlayın ve Pin 7'yi Enable'a bağlayın.
7. Sürücü kartını 12 V güç kaynağıyla çalıştırın. 12 V beslemeyi, motor sürücü kartına iki kırmızı telle tutturulmuş siyah/yeşil adaptör fişine takın.
   NOT: 12 V beslemeyi mikrodenetleyici kartı fişine takmayın.
8. Kontrol programını (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) mikrodenetleyici kartına indirin.
9. Mikrodenetleyici kartını bir bilgisayara bağlamak için bir USB kablosu kullanın, bu da mikrodenetleyici kartı için güç kaynağı görevi görür.
10. Kullanıcı denetimlerinin çalışıp çalışmadığını kontrol edin.
    1. Slayt düğmesinin otomatik modu açıp kapattığını onaylayın. Otomatik modda, sistem kullanıcı tarafından belirtilen düzenli aralıklarla bir adım atacaktır (aşağıya bakınız).
    2. Otomatik mod açıkken yeşil LED'in yandığından emin olun.
    3. Motor darbe uygulamadan önce kırmızı LED'in 1 s yanıp söndüğünü kontrol edin. Kırmızı LED, sistemin ne zaman mekanik bir darbe vermek üzere olduğunu gösteren bir uyarı ışığıdır.
    4. Sistemin otomatik modda olup olmadığına bakılmaksızın, düğmeye her basıldığında 1/16 mikro adımı tetikleyen kırmızı düğmeyi test edin.

Şekil 3: Alışkanlık cihazının bileşenleri. Makineyi monte etmek için etiketli tüm elektronikler gereklidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Elektronik şematik. Bu, breadboard üzerindeki devredir. Mikrodenetleyici kartına bağlanan teller protokolde açıklandığı gibi numaralandırılır. D1 ve D2 sırasıyla kırmızı ve yeşil LED'lerdir ve 330 Ω direnç aracılığıyla toprağa bağlanır. İki anahtar 10 KΩ dirençle yukarı çekilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Alışkanlık deneyinin kurulması

1. Stentor'u edinin.
2. % 0.01 poli-ornitin çözeltisi ile 35 mm'lik bir plaka kaplayın.
   1. Plakaya% 0.01 poli-ornitin çözeltisinden 3 mL ekleyin ve gece boyunca bırakın.
   2. Tabağı iki kez ultra saf suyla ve bir kez pastörize kaynak suyuyla (PSW) yıkayın (Malzeme Tablosu).
3. 35 mm'lik plakaya 3,5 mL PSW ekleyin.
4. Stentoru 6 delikli bir plakada yıkayın (Malzeme Tablosu).
   1. Birinci kuyuya 3 mL PSW ve ikinci ve üçüncü kuyulara 5 mL PSW ekleyin. Bir kültür kabından 6 delikli plakanın ilk kuyucuğuna 2 mL Stentor eklemek için bir P1.000 pipet kullanın.
   2. Bir stereo mikroskopla (Malzeme Tablosu) tek tek Stentor'u tanımlayın ve ardından 100 Stentor'u birinci kuyudan ikinci kuyucuğa aktarmak için bir P20 pipet kullanın.
   3. Stereo mikroskopla tek tek Stentor'u tanımlayın ve ardından 100 Stentor'u ikinci kuyudan üçüncü kuyucuğa aktarmak için bir P20 pipet kullanın.
5. 6 delikli plakanın üçüncü kuyucuğundan 35 mm plakaya toplam 500 μL hacimde 100 Stentor'u aktarmak için bir P200 pipet kullanın, böylece 35 mm plakadaki son hacim 4 mL'dir.
6. Alışkanlık cihazındaki metal cetvele bir parça (7 cm x 7 cm) beyaz kağıt bantlayın. Kağıdın sol kenarının, armatüre en yakın cetvelin ucundan 2 cm uzakta olduğundan emin olun.
7. 35 mm'lik plakanın alt kısmını, alışkanlık cihazındaki cetvelin üstündeki kağıttaki 2 inç x 2'nin ortasına yapıştırmak için çift taraflı bant kullanın.
8. 35 mm'lik plakayı, kapak kapalıyken alışkanlık cihazında en az 2 saat (bu gece boyunca uzatılabilir) bırakın. Bu iklimlendirme süresi boyunca, plakayı deneysel ışık koşullarına uyan ortam ışığı koşullarında tutun (yani, hücreleri açık / karanlık dalgalanmalarına maruz bırakmayın). Ayrıca, plakanın kazara sarsıntıdan kaynaklanan herhangi bir mekanik bozulma yaşamadığından emin olun.
9. USB mikroskop kamerasını (Malzeme Tablosu) doğrudan 35 mm'lik Stentor plakasının üzerine ortalayın. Gerekirse, yüksekliği ayarlamak için evrensel seri yol (USB) mikroskop kamerasının altına pipet ucu kutusu gibi bir pervane yerleştirin. Alternatif olarak, yüksekliği ayarlamak için bir halka standı kullanılabilir.
10. Web kamerası kaydedici uygulamasını bir dizüstü bilgisayara (Malzeme Tablosu) yükleyin ve mikroskop girişi yoluyla hücreleri görselleştirmek için kullanın.
    1. Web kamerası kaydedici uygulamasını açın ve açılır menüden USB mikroskobu seçin. USB mikroskop kamerasındaki odağı, hücreler net bir şekilde görünecek şekilde ayarlayın.
    2. Görüş alanındaki hücre sayısını en üst düzeye çıkarmak için USB mikroskop kamerasının konumunu ayarlayın.
11. Mikrodenetleyici kartı seri monitörünü açın: Satır Sonu Yok'u seçin ve 9.600 baud'a ayarlayın.
12. Armatürü cetvele zar zor dokunana kadar indirmek için mikrodenetleyici kart programındaki l komutunu kullanın. Tam konumu ayarlamak üzere gerekirse kolu kaldırmak için r komutunu kullanın.
    NOT: Armatür cetvelden önemli bir mesafedeyse, kolun cetvele doğru manuel olarak hareket ettirilebilmesi için motor bobini akımını devre dışı bırakmak üzere d komutunu yazın. Kolu manuel olarak hareket ettirdikten sonra, motor bobini akımını etkinleştirmek ve kolu yerinde kilitli tutmak için e komutunu kullanın. Bir deneyin başlamasından önce uygun şekilde alçaltıldığında, armatürün alt ucu cetvelin sol kenarından 1 cm uzakta olmalıdır. Armatür, cetvele çarparak mekanik darbeyi verecektir.
13. Alışkanlık cihazında otomatik modu başlatmak için i komutunu kullanın.
14. Adım boyutunu komut satırına girin. Düzey 5 en küçük adımdır ve Düzey 1 en büyük adımdır. Düzey 4, temel alışkanlık deneyleri için kullanılan adım boyutudur.
    NOT: Seviye 5 uyaranı, cetvelin ~ 0,5 mm aşağı doğru yer değiştirmesiyle sonuçlanır; Seviye 4, ~ 1 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; Seviye 3, ~2 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; Seviye 2, ~ 3-4 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır; ve Seviye 1, ~8 mm aşağı doğru yer değiştirmeyle sonuçlanır. Bir Seviye 5 uyaranı, armatürün ~ 0.122 N'lik cetvele karşı aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır; Seviye 4, ~ 0.288 N'lik aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır; ve Seviye 3, ~ 0.557 N'lik aşağı doğru bir tepe kuvveti ile sonuçlanır. Seviye 1 ve Seviye 2 tarafından üretilen aşağı doğru kuvvetlerin, armatür temas ettikten sonra meydana gelen önemli cetvel salınımları nedeniyle bir dinamometre ile ampirik olarak ölçülmesi daha zordur.
15. Darbeler arasındaki süreyi dakika cinsinden girin. Temel alışkanlık deneyleri için kullanılan aralık 1 dakikadır.
16. Kırmızı kayıt düğmesine basarak Web kamerası kaydedici uygulamasını kullanarak video çekmeye başlayın. Ardından, ilk otomatik mekanik darbe dağıtımı ile deneye başlamak için alışkanlık aparatındaki anahtarı çevirin.

3. Deney videosunun analizi

1. Videoda ilk mekanik darbe görünmeden hemen önce, her ikisi de 35 mm'lik plakanın altına tutturulmuş ve uzatılmış, trompet benzeri bir şekilde uzatılan Stentor sayısını duraklatın ve sayın (Şekil 5A, Video 1).
2. İlk darbeden hemen sonra, hem plakanın dibine tutturulmuş hem de top benzeri bir şekle büzülmüş Stentor sayısını sayın (Şekil 5B, Video 1).
   NOT: Kasılan hücreler uzatılmış hücrelerden kolayca ayırt edilebilir, çünkü Stentor bir kasılma olayı³ sırasında vücut uzunluklarını 10 ms içinde% 50'den fazla kısaltır.
3. Mekanik uyarana yanıt olarak büzülen Stentor fraksiyonunu belirlemek için ikinci sayımı ilk sayıma bölün.
4. Deney videosundaki tüm mekanik darbeler için 3.1-3.3 arasındaki adımları tekrarlayın.

Şekil 5: Mekanik bir uyaran aldıktan sonra Stentor büzülüyor . (A) Stentor uzatılmış durumdadır ve Petri plakasının dibine sabitlenmiştir. (B) Stentor, alışkanlık cihazından Seviye 4 mekanik stimülasyon aldıktan sonra büzülmüştür. Görüntüler USB mikroskopla çekildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Stentor sözleşme videosu. Stentor, alışkanlık cihazından her dakika Seviye 4 mekanik uyaran alır. Bu hücreler henüz alışmamıştır, bu yüzden nabzı aldıktan sonra büzülürler. Hücreler, alışkanlık cihazının üzerine yerleştirilmiş Petri plakasındadır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Yukarıda açıklanan yöntem, Seviye 4 mekanik darbeyi 1 musluk / dak frekansında kullanarak, Stentor'un büzülme olasılığında 1 saat içinde ilerleyici bir azalmaya neden olmalıdır. Bu, alışkanlığın göstergesidir (bkz. Şekil 6, Video 2).

Şekil 6: Temel alışkanlık. Stentor'un büzülme olasılığı , 1 musluk / dak frekansında Seviye 4 mekanik darbeler aldıktan sonra 1 saat boyunca kademeli olarak azalır (n = 22-27). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2. Alışılmış Stentor'un videosu. Hücreler, 1 musluk / dak frekansında aynı kuvvette mekanik darbeler aldıktan 1 saat sonra Seviye 4 mekanik uyaran alırlar. Hücrelerin çoğu saat boyunca uyaranlara alışmıştır ve bu nedenle büzülmezler. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Mekanik darbe iletiminin kuvvetini ve / veya frekansını değiştirmek, Stentor alışkanlık dinamiklerini değiştirebilir. Örneğin, Seviye 2 darbesini 1 musluk/dk frekansında kullanmak, 1 saat boyunca alışkanlığı engeller (bkz. Şekil 7). Seviye 5 nabız, birkaç ila sıfır Stentor'da kasılmalara neden olmalıdır.

Şekil 7: Daha güçlü kuvvetler için 1 saat içinde alışkanlık eksikliği. Stentor'un büzülme olasılığı , 1 musluk / dak frekansında Seviye 2 mekanik darbeler aldıktan sonra 1 saat boyunca önemli ölçüde azalmaz (n = 7-33). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.