Yöntem makalesi

Osteositlerin Analizi ve Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/64699

⸱

29 Kasım 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, hesaplamalı akışkanlar dinamiği (CFD) analizi için lakünar-kanaliküler ağ (LCN) içindeki osteositlerin üç boyutlu (3D) modellerini görselleştirme ve geliştirme yöntemini özetlemektedir. Bu yöntem kullanılarak oluşturulan modeller, sağlıklı veya hastalıklı kemiklerde osteosit mekanosyumunun anlaşılmasına yardımcı olur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteositler, mekanotransdüksiyon olarak bilinen bir süreçte çeşitli biyolojik yolları aktive ederek mekanik gerilmelere ve sıvı akış kesme stresine (FFSS) yanıt verdiği düşünülen kemik hücreleridir. Osteosit ağlarının konfokal görüntüden türetilmiş modelleri, doğrudan ölçümle belirlenemeyen osteosit zarı üzerindeki kayma gerilmelerini değerlendirmek için Hesaplamalı Akışkanlar Dinamiği (CFD) analizi yapmak için değerli bir araçtır. Kemiğin mikroyapısal mimarisinin bu yüksek çözünürlüklü görüntülerini kullanan hesaplamalı modelleme, kemiğe uygulanan mekanik yükü sayısal olarak simüle etmek ve osteositlerin yüke bağlı stimülasyonunu anlamak için kullanıldı.

Bu çalışma, çeşitli hesaplamalı modelleme yazılımlarını kullanarak CFD analizi yapmak için Lacunar-Canalicular Network'ün (LCN) konfokal mikroskop görüntülerini kullanarak 3D tek osteosit modelleri geliştirme yöntemlerini detaylandırmaktadır. Konfokal mikroskopiden önce, fare kemikleri kesitlere ayrılır ve LCN'yi etiketlemek için Floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası ile boyanır. 100x çözünürlükte, Z-yığını görüntüleri bir konfokal mikroskop kullanılarak toplanır ve LCN ve osteosit-dendritik süreçlerin bir yüzey modelini oluşturmak için MIMICS yazılımına (3D görüntü tabanlı işleme yazılımı) aktarılır.

Bu yüzeyler daha sonra, osteosit hücre gövdesi etrafındaki laküner akışkan boşluğu ve lakunokanaliküler sıvı içeren dendritlerin etrafındaki kanaliküler boşluğu modellemek için 3-Matic yazılımında (3D veri optimizasyon yazılımı) bir Boole işlemi kullanılarak çıkarılır. 3D hacimsel akışkan geometrisi, CFD analizi için ANSYS yazılımına (simülasyon yazılımı) aktarılır. ANSYS CFX (CFD yazılımı), kemiğe sıvı basıncı olarak fizyolojik yükleme uygulamak için kullanılır ve osteositler üzerindeki duvar kesme gerilmeleri ve dendritik süreçler belirlenir. LCN'nin morfolojisi, osteosit hücre zarı ve hücre süreçleri tarafından algılanan kayma gerilmesi değerlerini etkiler. Bu nedenle, konfokal görüntü tabanlı modellerin nasıl geliştirildiğine dair ayrıntılar, osteosit mekanosasyonunu anlamada değerli olabilir ve bu alanda gelecekteki çalışmalar için zemin hazırlayabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteositlerin fiziksel egzersize yanıt olarak kemik kütlesini düzenlediği varsayılmaktadır1. Osteositlerin membran deformasyonu ve mekanik yüklenmeye bağlı dendritik süreçleri, onları osteositler tarafından tespit edilen ve hücre içi sinyalleşmeyi tetikleyen FFSS'ye maruz bırakır 2,3,4. Kemik mikroyapısı, yaşlanma veya osteoporoz ve diyabet gibi kemik hastalıkları ve osteositlerin mekanik yanıtının bozulmasına neden olan perlecan eksikliği gibi durumlar nedeniyle laküner-kanaliküler morfolojisinde bozulma veya değişiklikler geçirir 5,6. Kemik mimarisindeki bu değişiklikler, osteositlerin farklı seviyelerde FFSS ve suşlar yaşamasına neden olur 7,8. Daha da önemlisi, mekanik yüklemeye yanıt olarak osteositler tarafından deneyimlenen FFSS'nin in vivo olarak ölçülmesi zordur çünkü bunlar kalsifiye kemik matrisine gömülüdür.

Konfokal görüntü tabanlı modelleme, LCN 9,10'un bilgisayar modellerini çoğaltarak erişilemeyen osteositleri doğal ortamlarında incelemenin sınırlamalarının üstesinden gelmek için güçlü bir tekniktir. Birbirine bağlı LCN ağını 3D olarak işlemek ve modellemek zor olmuştur. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM), seri blok yüz kesiti alma ve seri odaklı iyon demeti taramalı elektron mikroskobu (FIB/SEM)2,11,12 gibi çeşitli görüntüleme teknikleri vardır. Kemik 13,14,15'i görselleştirmek ve konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile 3D osteosit modelleri oluşturmak için değerli bir teknik geliştirilmiştir. CLSM, lakuna hacminin tamamını ve kanaliküllerin çoğunu 3D olarak görüntüleme yeteneği nedeniyle diğer görüntüleme tekniklerinden ziyade hesaplamalı modelleme için burada seçilmiştir16,17. LCN geometrisi, kemik gerilmelerini tahmin etmek için osteosit Sonlu Elemanlar Analizi (FEA) için CLSM kullanılarak oluşturulabilir. Bununla birlikte, osteositlerin deneyimlediği FFSS'yi tahmin etmek için sıvı analizi, interstisyel sıvının18 etrafında hareket ettiği dar lakünar-kanaliküler boşluğun modellenmesini sağlamak için osteositin hücre zarının ve LCN içindeki dendritlerinin modellenmesini gerektirdiğinden daha karmaşıktır.

Bu protokolde, kemik içindeki LCN'yi etiketlemek için konfokal mikroskopiden önce dekalsifiye edilmemiş kalın kemik bölümlerine floresein izotiyosiyanat (FITC) boyası uygulanır ve LCN'den alınan görüntüleme verilerine dayalı olarak osteosit-dendritik membranlar modellenir. Lakunar-kanaliküler boşluk, hesaplamalı modelleme kullanılarak simüle edilmiştir ve fiziksel aktiviteye bağlı fizyolojik yüklenme, bir CFD yaklaşımı kullanılarak modellenmiştir. Osteositler, LCN içindeki sıvı profilini analiz etmek ve osteosit ve dendritik membranlar üzerindeki FFSS'yi ölçmek için CFD yazılımında bir sıvı basınç gradyanına tabi tutulur. Ayrıca, bir FEA yaklaşımı, sıkıştırıcı mekanik yükleme uygulayarak osteosit suşlarını veya streslerini ölçebilir.

Yaşlı hayvanlarda veya kemik hastalığı olanlarda değişmiş lakunar-kanaliküler morfolojiyi simüle etmek için genç, sağlıklı kemik görüntülerinden türetilen mikro yapıları değiştirmek için bir geometri modifikasyon tekniği de geliştirilmiştir. Kemik mikroyapısındaki değişiklikler arasında yaşlanma ile birlikte kanalikül sayısının azaltılması, perlekan eksikliğinde ne olduğunu modellemek için lakünar-kanaliküler boşluk alanının azaltılması ve yaşlanma etkilerini modellemek için arttırılması ve diyabetik kemiği modellemek için kanaliküler ve dendritik duvar alanının azaltılmasıyer almaktadır 5,6. Geometri modifikasyon tekniği, kemikteki osteositlerin deneyimlediği FFSS'yi, sağlıklı ve hastalıklı hayvanlarda genç ve yaşlı veya kemikler gibi farklı mikro yapılarla karşılaştırmamıza olanak tanır.

Genel olarak, konfokal görüntü tabanlı modelleme, sağlıklı kemikteki osteositlerin morfolojisini simüle etmenin yanı sıra osteosit morfolojisindeki yaşlanma / hastalıkla ilişkili değişiklikleri simüle etmek için değerli bir araçtır. Ayrıca, yüzey alanı ve lakunar-kanaliküler boşluğun hacmi gibi osteosit morfolojik parametreleri, mekanik zorlanmaya hücresel tepkileri tahmin etmek için çeşitli kemiklerde ölçülebilir ve karşılaştırılabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, Missouri Üniversitesi, Kansas City'deki (UMKC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi ve ilgili federal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Kemik hazırlama işlemi

  1. 4 aylık ve 22 aylık dişi C57BL6 farelerden femurları toplayın ve bunları PBS'de 24 saat boyunca 4 ° C'de hafifçe sallayarak soğuk% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin, ardından PBS'de durulayın ve gömmeden önce% 70 etanol içinde saklayın.
    NOT: Fiksatif hacim, doku hacminin yaklaşık 20 katı olmalıdır
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek kemikleri hızlı bir şekilde polimerize eden bir akriliğe (Malzeme Tablosu) hızlı bir şekilde gömün.
    NOT: Bu adım için hızlı polimerize edici bir reçine kullanmak önemlidir (~ 10 dk). Amaç, elmas testere kullanılarak kesit alma sırasında kemik dokusunu desteklemektir, ancak reçine LCN'ye nüfuz etmeden, bu da FITC lekesinin içeri girmesini engelleyecektir.
  3. Bir elmas testere kullanarak üçüncü trokanterin üzerindeki standart bir bölgeden 300 μm kalınlığında enine dilimler kesin ve FITC boyamadan önce bunları 4 °C'de% 70 etanol içinde saklayın.
  4. Bölümleri 600, 800 ve ardından 1200 kumlu zımpara kağıdı kullanarak ~90-100 μm nihai kalınlığa kadar cilalayın.
    NOT: Uygun kalınlığa ulaşılması dijital kumpas kullanılarak sağlanmıştır.
  5. Bölümleri %70, %95 ve %100 etanolde 5 dakika durulayın.
  6. Karanlıkta oda sıcaklığında (RT) 4 saat boyunca orta derecede çalkalanarak% 100 etanol içinde% 1 FITC'de boyayın.
  7. Bölümleri karanlıkta hafifçe çalkalayarak 30 dakika boyunca %100 etanol içinde yıkayın. Ardından, gece boyunca karanlıkta havayla kurutun.
  8. Monte etmek için, bölümü bir cam mikroskop lamı üzerindeki bir damla montaj ortamına yerleştirin. Kesiti slayta karşı mümkün olduğunca düz konumlandırmak için forseps kullanın, hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve numuneyi manipüle etmek için çevredeki reçineyi kullanın. Numunenin üzerine bir lamel monte edin.

2. Konfokal mikroskopi

  1. FITC ile boyanmış kemik dilimlerinin görüntülenmesi için konfokal bir mikroskop kullanın.
  2. 1024 x 1024 piksel, 0,089 μm piksel çözünürlükte 400 Z düzleminden oluşan ayrıntılı Z yığınlarını toplamak için 1,7 dijital yakınlaştırma ve 0,126 μm adım boyutuna sahip 100x 1,44NA yağ objektifi kullanın.
  3. Uyarma için 496-596 nm'lik bir emisyon toplama penceresi ile 488 nm'lik bir lazer kullanın. Artan görüntüleme derinliği ile sinyal kaybını düzeltmek için telafi ayarlarını kullanarak görüntü yığınlarını toplayın.
  4. Yüksek hızda örnekleme ve artırılmış satır ortalaması gibi görüntü toplama tekniklerini kullanarak görüntülerin doğruluğunu ve çözünürlüğünü artırın. Ayrıca, Şekil 5'de gösterildiği gibi femur bölümlerinin enine kesitlerinin 20x, 100x ve 1x çözünürlüğünde büyütme ile görüntüleri toplayın.
    NOT: Şekil 1'deki düşük çözünürlüklü (5x) görüntü, 100x görüntüleme alanı için seçilen üç bölge ile uyluk kemiğinin tam kesit alanını göstermektedir.
  5. Osteositlerin bilgisayar modellemesi için 100x Z-yığınlarını kullanın.

3. Bilgisayar modelleme

  1. Toplanan 100x görüntüleri TIFF formatında ImageJ yazılımına aktarın ve LCN'nin Z yönünde bir dizi görüntüsünü oluşturun.
  2. Görüntü yönünü tanımladıktan sonra LCN'nin bir maskesini oluşturmak için Z yığınlarını 3B görüntü tabanlı işleme yazılımına aktarın.
  3. LCN'ye çok benzemek için genç ve yaşlı farelerden alınan orijinal görüntüyü sırasıyla 30.012-45.677 Hounsfield birimi ve 15.000-46.701 Hounsfield birimi arasında eşikleyin. Maskeye dahil edilmek üzere piksel yoğunluğu sınırlarını değiştirmek için bölüm menüsünde Eşik'i ayarlayın.
  4. Kırpma Maskesi işlemini kullanarak yığından ilgi alanı (ROI) olarak kanalikülleri ile bir lacuna kırpın. ROI'yi, küpün ortasındaki lacuna'yı çevreleyecek ve tüm bağlı kanalikülleri küpün kenarlarına uzanacak şekilde tanımlayın. Lacuna'yı, kenar uzunlukları 21 μm, 14 μm ve 19 μm olan hayali daha büyük bir küple kaplayın.
  5. Model birden çok parçadan oluşturulduğundan, bağlı piksel bölgelerini seçmek, tek tip bir LCN oluşturmak için gürültüyü gidermek ve benekleri gidermek için bir bölge büyütme işlemi gerçekleştirin.
  6. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımındaki Hesaplanan Parça işlemini kullanarak lakunar-kanaliküler maskeyi bir nesneye dönüştürün.
  7. Yumuşatma işlemini kullanarak LCN hacmini azaltarak osteosit ve dendritik zarları oluşturun. Sırasıyla 0,75 μm ve 0,08 μm'lik bir laküner ve kanaliküler boşluk kalınlığı elde etmek için bu işlemi birkaç kez gerçekleştirin 9,18.
  8. Nesneleri (STL formatı) 3B görüntü tabanlı işleme yazılımının son adımı olarak dışa aktarın.
  9. Bir hacim ağı oluşturmak için LCN ve osteosit-dendritik membranların iki katmanını 3D veri optimizasyon yazılımına aktarın.
  10. Her parçadaki ağ sorunlarını belirlemek için yazılımdaki Düzeltme Sihirbazı aracını kullanın. Her işlemden sonra Düzeltme Sihirbazı'nın tanılama bölümünde ağ kalitesini kontrol edin.
  11. Düzeltme Sihirbazı'ndaki Otomatik Düzeltme işlemini kullanarak ters çevrilmiş normal parçaları, kesişen üçgenleri ve bozuk konturları kaldırın.
  12. Çakışan üçgenleri yenilerini tanımlayarak manuel olarak veya Deliği Normal Doldurma işlemi aracılığıyla otomatik olarak değiştirin.
  13. Keskin üçgenleri, küçük kenarları ve küçük kabukları filtreleme gibi işlemleri kullanarak ağ kalitesini iyileştirin.
  14. Ağ kalitesini iyileştirdikten sonra, LCN ve osteosit-dendritik membranların iki yüzeyini, manifold olmayan bir montaj kullanarak her iki parçaya ait tek bir yüzeyde (lakünar-kanaliküler akışkan boşluk) birleştirin.
  15. Remesh işlemini kullanarak lacunar-kanaliküler boşluğun hacimsel bir modelini oluşturun ve ardından bunu bir STL dosyası olarak dışa aktarın. Dışa aktarma bölümünde nesne ölçeğini mikrometre cinsinden olacak şekilde ayarlayın.

4. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımında ve 3D veri optimizasyon yazılımında geometri modifikasyon tekniği

NOT: Geometri modifikasyon tekniği, yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı olarak kanaliküler yoğunluk ve çap ve lakunar-kanaliküler kalınlık gibi osteosit morfolojisindeki değişiklikleri modellemek için kullanılır.

  1. Temel model olarak genç osteositi seçin ve morfolojik değişiklikler uygulayarak diğer farklı osteosit modelleri oluşturmak için değiştirin.
  2. 3D görüntü tabanlı işleme yazılımında görüntü eşiğini değiştirerek temel modelden farklı kanaliküler yoğunluklara sahip bir osteosit modeli oluşturun.
    1. Görüntünün ışık yoğunluğunu azaltmak ve daha az kanaliküllü bir lakuna elde etmek için daha düşük bir eşik seçin. Eşikleme tekniğinin avantajı, lakuna şeklinin ve boyutunun aynı kalması ve sadece kanaliküler yoğunluğun etkisinin incelenmesidir. Şekil 2 , geometri modifikasyon tekniği kullanılarak genç osteositten oluşturulan simüle edilmiş yaşlı modeli göstermektedir.
  3. 3 boyutlu görüntü tabanlı işleme yazılımı ve 3 boyutlu veri optimizasyon yazılımında farklı lakünar-kanaliküler boşluk kalınlıklarına veya dendrit/kanal çaplarına sahip osteosit modelleri geliştirin. Sırasıyla Sarma veya Düzleştirme işlemleri ile daha büyük veya daha küçük osteosit modelleri oluşturun. Şekil 3 , genç osteositten geliştirilen değişmiş geometriye sahip altı osteosit modelini göstermektedir.

5. CFD analizi

NOT: Hacimsel osteosit modelleri oluşturulduktan sonra, simülasyon yazılımının CFX modülünde geometri, ağ ve kurulum dahil olmak üzere çeşitli adımlar gerçekleştirilir.

  1. Modelleri CFD analizine hazırlamak için simülasyon yazılımında bir Akışkan Akışı oluşturun.
  2. Geliştirilen konfokal görüntü tabanlı geometrileri, ANSYS SpaceClaim (3D modelleme aracı) olarak bilinen CFX'in geometri bölümüne aktarın. Ayarda birim boyutlarını nanometre olarak ayarlayın.
  3. Geometri, LCN ve osteosit-dendritik süreçlerin iki yüzü olarak görünür. Üst menüdeki Faset'e tıklayın ve kesişimler, keskin veya aşırı bağlı kenarlar ve her faset için köşeler, açıklıklar veya delikler gibi geometrik hataları kaldırın.
  4. Tek bir lakünar-kanaliküler boşluk gövdesi elde etmek için daha küçük faset ve osteosit-dendritik süreçleri daha büyük faset olan LCN'den azaltmak için Faset menüsünde Çıkar'a tıklayın. Ardından, oluşturulan fasete sağ tıklayın ve yüzleri birleştirmeden fasetlerden sağlam bir etki alanına dönüştürün. Şekil 4, lakünar-kanaliküler boşluğu temsil eden genç osteosit modelinin enine kesit alanını göstermektedir.
  5. Mesh'e tıklayın ve 0,06 μm'lik bir eleman boyutu kullanarak doğrusal tetrahedral elemanları seçin. Sonuçların ağ boyutundan bağımsız olduğundan emin olmak için küçük dendritik sistemde yeterli öğeye sahip olmak için ağı bir ağ yakınsama etüdü ile rafine edin.
  6. Yüzeyi seçin ve hayali küpün üst tarafındaki kanalcıkları sıvı girişleri olarak seçin. Box select'i kullanarak diğer beş yüzdeki kanalikülleri sıvı çıkışları olarak seçin.
  7. Bir sonraki adımda kurulumda daha hızlı yüklendiği için ağı (akıcı dosya formatı) dışa aktarın.
  8. Simülasyon yazılımında başka bir Akışkan Akışı oluşturun ve akıcı ağı CFX'in kurulum bölümüne aktarın. Sınır Ekle seçeneğini kullanarak giriş/çıkış olarak önceden seçilen yüzler için girişler ve çıkışlar için iki sınır koşulu tanımlayın.
  9. Fizyolojik koşulları taklit etmek için, girişlere ve çıkışlara sırasıyla 300 Pa ve 0 Pa'lık bir sıvı giriş basıncı uygulayın,19,20. Kalan yüzeylere, duvarların arayüzünde sıfır hıza sahip olan bu sıvıda kaymaz bir duruma sahip duvarlar olarak muamele edin. Sıvı, dendritler ve osteosit hücre gövdesi etrafındaki girişlerden akar ve çıkış olarak atanan diğer kanaliküllerden çıkar.
  10. İnterstisyel laminer sıvıyı, malzeme kütüphanesinden seçilen su9 olarak değerlendirin. Sorunda tanımlanmış bir ısı transferi olmadığı için Isı Transferi, Yanma ve Termal Radyasyon bölümlerini Yok olarak ayarlayın. Laminer bir sıvı9 olan LCN'de akışkan karakteristiği olarak Türbülans modunu seçin.
  11. Yazılımı, gönderim türü olarak Çift Duyarlık ve Doğrudan Başlatma'yı kullanarak çalıştırın. Kalıntılar düşüp sabit hale gelene kadar kütle ve momentumu izleyin. Çözüm yakınsamasından sonra, CFD yazılımının CFD-post bölümünü kullanarak FFSS verilerini ölçün.

6. CFD sonrası işleme

  1. Osteositler ve dendritleri tarafından deneyimlenen FFSS'yi tasvir etmek için, CFD yazılımının sonuçlar bölümüne yeni bir kontur ekleyin. Etki alanındaki değişken olarak osteosit-dendritik membranlar üzerindeki duvar makasını seçerek bir FFSS konturu oluşturun.
    NOT: Dendritik membranlarda yüksek FFSS'yi daha iyi göstermek için, FFSS'nin min/maks değerlerini değiştirmek için FFSS aralığı Kullanıcı Tarafından Belirlendi olarak ayarlanmıştır.
  2. Girişlerden başlayarak lakunar-kanaliküler alanın içine bir hız akış çizgileri konturu yerleştirin. Örneklemeyi eşit aralıklı olarak ayarlayın ve nokta sayısını 2500 olarak seçin. CFD yazılımındaki bir animasyon bölümü, hız akış grafiğini kullanarak sıvı parçacıklarının lakünar-kanaliküler boşluklar içinde nasıl aktığını 3D olarak doğru bir şekilde gösterir.
  3. Özellikle çeşitli osteosit modellerinin olduğu yerlerde (yani, genç ve yaşlı) geometrik parametrelere dayalı olarak FFSS'nin büyüklüğünü veya hızını analiz etmek için CFD yazılımındaki Fonksiyon Hesaplayıcı aracını kullanın. Lakünar-kanaliküler boşluğun hacmini ve yüzey alanını, maksimum, minimum veya ortalama FFSS değerleriyle birlikte geometrik parametreler olarak ölçün.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, bir osteositin ve dendritik süreçlerinin mekanik yükleme nedeniyle maruz kaldığı sıvı akış kesme gerilimi miktarını araştırmak için konfokal türevli osteosit modellerinin nasıl geliştirileceğini açıklar. Genç ve yaşlı konfokal görüntü tabanlı osteosit modelleri oluşturmak için yaşlı bir fare ve genç bir C57BL6 fare seçildi. Yaşlanma veya kemik hastalığına bağlı LCN morfolojisinin değişimini incelemek için geometri modifikasyon tekniği kullanılarak aynı genç osteosit modelinden altı başka simüle edilmiş osteosit modeli oluşturuldu. Geometrisi değiştirilmiş parametreler lakünar-kanaliküler kalınlığı, kanal yoğunluğu ve çapı içeriyordu. Modifiye osteosit modelleri, her seferinde bir parametrenin değiştirilmesi ve diğer parametrelerin aynı tutulmasıyla geliştirilmiştir. Bu nedenle, morfolojik parametrelerin her birinin FFSS üzerindeki etkisi ayrı ayrı incelenir. Sonuçlar, bir osteosit tarafından deneyimlenen FFSS miktarının bu osteosit modellerinde farklı olduğunu ve FFSS'nin LCN morfolojisine bağımlılığını gösterdiğini ortaya koydu. FFSS değerleri, osteosit hücre gövdesi veya dendritik membranlar gibi osteosit modelinin çeşitli kısımlarında tahmin edildi. Tüm modellerdeki dendritler, osteosit hücre gövdesi zarından daha yüksek FFSS değerlerine sahipti.

Şekil 5, doğrudan konfokal FITC görüntü yığınlarından oluşturulan genç ve yaşlı osteosit modelleri ve geometri modifikasyon tekniği kullanılarak Model 1'den geliştirilen diğer altı osteosit modeli için FFSS konturlarını göstermektedir. Genç osteosit modelinde (Model 1) osteosit ve dendritik membranlar üzerindeki ortalama FFSS 0.42 Pa idi, bu da yaşlı osteosit modelindeki (Model 2) ortalama 0.13 Pa'dan daha anlamlıdır. Elde edilen veriler, daha geniş lakünar-kanaliküler aralığa sahip osteositlerde ortalama FFSS'de bir artış (Model 7 ve Model 8) ve daha düşük kanaliküler yoğunluğa sahip osteositlerde FFSS'de bir azalma (Model 3 ve Model 4) gösterirken, Model 5 ve Model 6'da FFSS'de dendrit çapı değiştikçe anlamlı olarak değişmedi. Model 2 ve Model 4 sırasıyla 0.19 Pa ve 0.13 Pa ile en düşük FFSS değerlerine sahipti. Model 8'deki FFSS'nin büyüklüğü diğer osteosit modellerinden daha büyüktür. Model 8'de dendritlerin çoğu kırmızı renkte olmakla kalmaz, aynı zamanda osteosit hücre gövdesi de diğer modellere göre daha yüksek FFSS'ye maruz kalır.

Osteositler tarafından deneyimlenen FFSS, FFSS ile LCN'nin değişen yapısı arasındaki korelasyonu bulmak için ANSYS CFX'te son işlemle elde edilen lakunar-kanaliküler boşluk hacmi ve yüzey alanına dayalı olarak da sunuldu. FFSS'ye maruz kalan her modelin yüzey alanının, kemik oluşumuna neden olanFFSS seviyesi olduğu düşünülen 0.8 Pa'dan daha büyük olması da mümkün olmuştur 21,22. Osteosit modellemesi, Tablo 1'de gösterildiği gibi, tüm osteosit modelleri için ortalama FFSS ile lakünar-kanaliküler boşluk hacmi veya yüzey alanı arasında bir korelasyon göstermiştir. En düşük kanal yoğunluğuna sahip yaşlı osteosit (Model 2) ve simüle edilmiş orta yaşlı osteosit (Model 4) 1372.7μm2 ve 1122.6μm2 ile en düşük laküner-kanaliküler yüzey alanına sahipti. Model 2 ve Model 4 ayrıca sırasıyla 229.4μm3 ve 203.5μm3 ile en düşük lakünar-kanaliküler boşluk hacmine sahipti ve bu da düşük FFSS miktarları ile ilişkilendirilebilir. En büyük dendrit çapına sahip olan Model 6, en büyük lakünar-kanaliküler yüzey alanına sahipti. Model 8, en büyük lakünar-kanaliküler boşluk hacmine ve en büyük FFSS değerlerine sahipti.

figure-results-1
Şekil 1: 5x, 20x ve 100x yağ objektifleri ile çekilen FITC ile boyanmış bir uyluk kemiğinin enine kesitinin tek Z-düzlemi konfokal görüntüleri. Lacunar-kanaliküler ağ, 100x objektif ile çekilen görüntüde görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: 4 aylık ve 22 aylık C57BL6 farenin FITC ile boyanmış uyluk kemiğinden oluşturulan genç (Model 1) ve yaşlı (Model 2) osteositin konfokal görüntü tabanlı modelleri. Büyütülmüş görüntü, genç osteosit için lakünar-kanaliküler (LC) kalınlığını ve yaşlı osteosit için aynı kalınlığı gösterir. Model 1 görüntüsü, Niroobakhsh ve ark.23'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Geometri modifikasyon tekniği kullanılarak Model 1'den geliştirilen altı osteosit modeli. Kanal yoğunluğu, Model 3 (simüle edilmiş orta yaşlı) ve Model 4 (simüle edilmiş yaşlı) oluşturmak için azaltılırken, dendrit çapı ve LC kalınlığı Model 1 ile aynıydı. Model 5 ve Model 6, Model 1 ile aynı kanal yoğunluğu ve LC kalınlığı ile geliştirilirken, dendrit çapları Model 1'den iki ve dört kat daha büyüktü. Model 7 ve Model 8 sırasıyla iki kat ve dört kat daha fazla laküner-kanal kalınlığına sahipken, kanal yoğunluğu ve dendrit çapı Model 1'deki ile aynı kalmıştır. Model 1 görüntüsü, Niroobakhsh ve ark.23'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 3D görünüm konfokal görüntü tabanlı genç osteosit modeli. Osteosit ve dendritler etrafında sıvı analizi için kullanılan lakunar-kanaliküler boşluğun modellenmesini gösteren konfokal görüntü tabanlı genç osteosit modelinin kesit alanının 3 boyutlu görünümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Tüm osteosit modelleri için FFSS dağılımı, FFSS büyüklüğünün osteosit morfolojisine bağımlılığını göstermektedir. Kırmızı bölgeler, özellikle osteosit hücre gövdesinden ziyade dendritik membranlarda en yüksek FFSS değerlerini gösterir. Bu görüntü, Niroobakhsh ve ark.23'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

ModelLakünar-kanaliküler yüzey alanı (μm2)Lakünar-kanaliküler boşluk hacmi (μm3)Cadde FFSS (PA)
Konfokal görüntü tabanlı osteosit modelleriModel 12652.92610.42
Genç (4 aylık)
Model 21372.7229.40.19
Yaşlı (22 aylık)
Geometri modifikasyon tekniği kullanılarak oluşturulan simüle edilmiş osteosit modelleriModelleri 31530.4242.60.27
(Simüle edilmiş orta yaşlı)
Model 41122.6203.50.13
(Simüle edilmiş yaşlı)
Model 53724.9302.90.49
(2 x dendrit çapı)
Model 647913370.57
(4 x dendrit çapı)
Model 73116.3440.61.17
(2 x LC kalınlığı)
Model 83542.2658.21.89
(4 x LC kalınlığı)

Tablo 1: Osteosit modellerinin karşılaştırılması. İki konfokal görüntü tabanlı model ve geometri modifikasyon tekniği kullanılarak Model 1'den oluşturulan altı simüle edilmiş model dahil olmak üzere sekiz farklı osteosit modelinde ortalama FFSS, lakünar-kanaliküler boşluk hacmi ve yüzey alanının karşılaştırılması.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, osteositlerin görselleştirilmesi ve hesaplamalı modellemesi için konfokal bir görüntüleme tekniğini ana hatlarıyla belirtir. Konfokal görüntülemeden önce kemik örneklerinin kesit alınması ve boyanması için kemik hazırlama işlemi yapılır. 100x büyütmeli konfokal görüntüler, osteositlerin ve lakunar-kanaliküler boşluğun bilgisayar modellerini geliştirmek için çeşitli yazılımlara aktarılır. Son olarak, kemik matriksindeki osteositlere erişilememesi nedeniyle in vivo olarak teknik olarak zor olan, fiziksel aktiviteye bağlı osteositleri ve dendritik membranları çevreleyen FFSS'yi modellemek için konfokal görüntü tabanlı modeller üzerinde bir CFD analizi yapılmıştır. Sağlanan protokol, multifizik modellemede sonlu elemanlar veya akışkan-yapı etkileşimi (FSI) yaklaşımı kullanılarak diğer stres veya gerinimlerin belirlenmesinde de yardımcı olur.

Kemiğin FITC boyaması kullanılarak elde edilebilen yüksek çözünürlüklü görüntüler sayesinde LCN 7,9,24,25'i görselleştirmek için konfokal görüntüleme kullanılmıştır. Kanaliküllerin çapı mikroskobun çözünürlük sınırına yakın olmasına rağmen, kanaliküllerin güvenilir konfokal görüntüleri elde edilebilir ve bu da kanaliküllerin çoğunu yakalayabilir. Osteosit dendritlerinin daha küçük çapı nedeniyle, dendritlerin görüntülerini doğru bir şekilde yakalamak teknik olarak daha zordur. Bu nedenle, yazılımda bir yumuşatma işlemi kullanarak hacimlerini azaltarak LCN'nin konfokal görüntülerinden osteosit ve dendritleri modellemek için yardımcı bir teknik geliştirilmiştir. Yayınlanmış diğer bazı çalışmalar, osteosit-dendritik membran9'u oluşturmak için LCN'yi dengelemek için benzer bir yaklaşım kullanmıştır. Düzleştirme tekniğinin diğer bir yararı, optik görüntülemenin bir özelliği olan Z eksenindeki daha düşük görüntüleme çözünürlüğü nedeniyle Z ekseninde meydana gelen kanal çapının uzaması gibi CLSM'deki bazı görüntüleme hatalarının iyileştirilmesidir. Dekonvolüsyon, orijinal veri setindeki sinyal-gürültüyü iyileştirdiği için Z yönündeki optik gerilmeyi azaltmak için alternatif bir yöntem olarak da kabul edilir. Lakünar-kanaliküler boşluk, LCN içindeki sıvı profilini analiz etmek için LCN ve osteosit-dendritik membranlardan modellenmiştir.

Özellikle, başka bir fareyi feda etmeden geometri modifiye osteosit modelleri geliştirmek için mevcut yöntemlere göre yeni bir teknik tanıtıldı. Geometri modifikasyon tekniği ayrıca yaşlanma veya osteoporoz, diyabet gibi kemik hastalıkları ve perlecan eksikliği gibi durumlar nedeniyle kemik mikro yapısının değişimini simüle etmeye yardımcı olur. Bu teknikte, kanal yoğunluğu, lakünar-kanaliküler boşluk ve dendrit çapı gibi parametreleri değiştirerek yaşlı veya diğer kemik hastalıklı osteositlerin morfolojisini modellemek için genç bir farenin konfokal görüntü tabanlı osteosit modeli kullanıldı. Bu yaklaşım, biri 22 aylık bir fareden alınan gerçek bir osteositin konfokal görüntü tabanlı modellemesinden ve diğeri orijinal olarak 4 aylık bir fareden alınan bir osteositin kanaliküler yoğunluğunu azaltarak geometri modifikasyon modellemesinden olmak üzere iki yaşlı osteosit modelinin benzerliği ile doğrulanmıştır. Bu iki yaşlı osteosit modeli, tüm osteosit modelleri arasında en düşük olan benzer bir FFSS büyüklüğü gösterdi. Geometri modifikasyon tekniği, bir hayvandan alınan gerçek osteositler kullanılarak oluşturulan osteosit modelleriyle karşılaştırılabilir sonuçları tahmin edebildiği için farklı biyolojik alanlarda birçok uygulamaya sahip olabilir. Bu çalışmanın sınırlamalarından bazıları, düzleştirme tekniği nedeniyle yüzey pürüzlülüğünün bazı ayrıntılarının kaybolmasını ve kanal çaplarının konfokal mikroskopların çözünürlük sınırında olması gerçeğini içerir, bu da daha küçük çaplara sahip kanaliküller için potansiyel olarak bazı yanlışlıklara yol açabilir ve ayrıca salınımlı akış kullanarak modelleme yerine sıvı akışı idealizasyonu.

Tekniğin işlevselliğini göstermek için, genç ve yaşlı bir fareden veya geometri modifikasyon tekniği kullanılarak oluşturulan farklı osteosit modelleri için osteosit FFSS değerleri ölçüldü. Bu bilgisayar modellerini kullanan dikkate değer bulgulardan biri, lakünar-kanaliküler boşluk hacminin, osteositlerin yaşadığı ortalama FFSS ile doğru orantılı olmasıdır. Daha önce araştırılmamış olan bu yeni bulgu, osteosit ağ morfolojisini osteositler ve süreçleri tarafından tespit edilen FFSS ile ilişkilendirebildiğinden, osteosit mekano-duyarlılığını belirlemede çeşitli uygulamalara sahip olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı'na (NSF, ödül numarası NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), Ulusal Sağlık Enstitüsü'ne (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) ve (NIH / SIG S10OD021665 ve S10RR027668 PI: SL Dallas) ve Missouri-Kansas City Üniversitesi Lisansüstü Çalışmalar Okulu Araştırma Hibe Programı'na teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.200 Kumlu zımpara kağıdıBuehler30-5170-012-100
3-Matic yazılımıMaterializehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-matic3D veri optimizasyon yazılımı
600 kumlu zımpara kağıdıBuehler30-5118-600-100
800 Kumlu zımpara kağıdıBuehler30-5170-800-100
ANSYS yazılımıANSYShttps://www.ansys.com/simülasyon yazılımı
Floresein İzotiyosiyanat (FITC)Sigma-AldrichF7250
ImageJ yazılımıhttps://imagej.net/ij/
Mikroskoplar için Daldırma YağıLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II konfokal mikroskop Leica MicrosystemsTCS SP5 II 
Leitz 1600 iç delikli elmas testereLeica 
MIMICS Innovation Suite yazılımı3D görüntü tabanlı işleme yazılımıhttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite
Performize montaj ortamıFisher scientificSP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Akrilik KitBuehler20-3560
Tek Platformlu Laboratuvar ÇalkalayıcıGüvenilir bilimsel INC55S Modeli

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, M. C. M., Chow, S. K. H., Wong, R. M. Y., Qin, L., Cheung, W. H. The role of osteocytes-specific molecular mechanism in regulation of mechanotransduction - A systematic review. J Orthop Translat. 29, 1-9 (2021).
  2. Fritton, S. P., Weinbaum, S. Fluid and solute transport in bone: Flow-induced mechanotransduction. Annu Rev Fluid Mech. 41, 347-374 (2009).
  3. Klein-Nulend, J., Bacabac, R. G., Bakker, A. D. Mechanical loading and how it affects bone cells: the role of the osteocyte cytoskeleton in maintaining our skeleton. Eur Cell Mater. 24, 278-291 (2012).
  4. Knothe Tate, M. L. "Whither flows the fluid in bone?" An osteocyte's perspective. J Biomech. 36 (10), 1409-1424 (2003).
  5. Tiede-Lewis, L. M., et al. Degeneration of the osteocyte network in the C57BL/6 mouse model of aging. Aging (Albany NY). 9 (10), 2190-2208 (2017).
  6. Lai, X., et al. The dependences of osteocyte network on bone compartment, age, and disease. Bone Res. 3 (1), 15009(2015).
  7. Schurman, C. A., Verbruggen, S. W., Alliston, T. Disrupted osteocyte connectivity and pericellular fluid flow in bone with aging and defective TGF-β signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (25), e2023999118(2021).
  8. van Tol, A. F., et al. The mechanoresponse of bone is closely related to the osteocyte lacunocanalicular network architecture. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (51), 32251-32259 (2020).
  9. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Fluid flow in the osteocyte mechanical environment: a fluid-structure interaction approach. Biomech Model Mechanobiol. 13 (1), 85-97 (2014).
  10. Ganesh, T., Laughrey, L. E., Niroobakhsh, M., Lara-Castillo, N. Multiscale finite element modeling of mechanical strains and fluid flow in osteocyte lacunocanalicular system. Bone. 137, 115328(2020).
  11. Schneider, P., Meier, M., Wepf, R., Müller, R. Serial FIB/SEM imaging for quantitative 3D assessment of the osteocyte lacuno-canalicular network. Bone. 49 (2), 304-311 (2011).
  12. Kamioka, H., et al. A method for observing silver-stained osteocytes in situ in 3-microm sections using ultra-high voltage electron microscopy tomography. Microsc Microanal. 15 (5), 377-383 (2009).
  13. Ciani, C., Doty, S. B., Fritton, S. P. An effective histological staining process to visualize bone interstitial fluid space using confocal microscopy. Bone. 44 (5), 1015-1017 (2009).
  14. Sharma, D., et al. Alterations in the osteocyte lacunar-canalicular microenvironment due to estrogen deficiency. Bone. 51 (3), 488-497 (2012).
  15. Verbruggen, S. W., Vaughan, T. J., McNamara, L. M. Strain amplification in bone mechanobiology: a computational investigation of the in vivo mechanics of osteocytes. J R Soc Interface. 9 (75), 2735-2744 (2012).
  16. Goggin, P. M., Zygalakis, K. C., Oreffo, R. O., Schneider, P. High-resolution 3D imaging of osteocytes and computational modelling in mechanobiology: insights on bone development, ageing, health and disease. Eur Cell Mater. 31, 264-295 (2016).
  17. Kamioka, H., et al. Microscale fluid flow analysis in a human osteocyte canaliculus using a realistic high-resolution image-based three-dimensional model. Integr Biol. 4 (10), 1198-1206 (2012).
  18. Wang, L., et al. In situ measurement of solute transport in the bone lacunar-canalicular system. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (33), 11911-11916 (2005).
  19. Manfredini, P., Cocchetti, G., Maier, G., Redaelli, A., Montevecchi, F. M. Poroelastic finite element analysis of a bone specimen under cyclic loading. J Biomech. 32 (2), 135-144 (1999).
  20. Steck, R., Niederer, P., Knothe Tate, M. L. A finite element analysis for the prediction of load-induced fluid flow and mechanochemical transduction in bone. J Theor Biol. 220 (2), 249-259 (2003).
  21. You, L., Cowin, S. C., Schaffler, M. B., Weinbaum, S. A model for strain amplification in the actin cytoskeleton of osteocytes due to fluid drag on pericellular matrix. J Biomech. 34 (11), 1375-1386 (2001).
  22. Weinbaum, S., Cowin, S. C., Zeng, Y. A model for the excitation of osteocytes by mechanical loading-induced bone fluid shear stresses. J Biomech. 27 (3), 339-360 (1994).
  23. Niroobakhsh, M., Laughrey, L. E., Dallas, S. L., Johnson, M. L., Ganesh, T. Computational modeling based on confocal imaging predicts changes in osteocyte and dendrite shear stress due to canalicular loss with aging. Biomech Model Mechanobiol. 23 (1), 129-143 (2024).
  24. Dallas, S. L., Moore, D. S. Using confocal imaging approaches to understand the structure and function of osteocytes and the lacunocanalicular network. Bone. 138, 115463(2020).
  25. Boyde, A., Wolfe, L. A., Maly, M., Jones, S. J. Vital confocal microscopy in bone. Scanning. 17 (2), 72-85 (1995).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Osteosit G r nt lemeKonfokal MikroskopiAk kan Ak Kayma KuvvetiHesaplamal Ak kanlar Dinami iLak nar Kanalik ler AOsteosit Mekanotransd ksiyonu3B Osteosit ModelleriDendritik MembranlarG r nt Tabanl ModellemeKayma Gerilmesi Analizi

İlgili makaleler