Method Article

Kapalı Yarı Otomatik İş Akışı Kullanarak Klinik Uygulamalar için İnsan Mezenkimal Kök Hücre İşleme

DOI:

10.3791/64707

⸱

March 17th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioprocessing Technology Institute (BTI), Agency for Science, Technology and Research (A STAR), 2Thermo Fisher Scientific, 3Thermo Fisher Scientific

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir ters akış santrifüjleme sistemi kullanarak çok katmanlı şişelerden yapışkan hücreleri kapalı yarı otomatik bir şekilde toplamak için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, mevcut adımlarda birkaç değişiklikle diğer hücre genişletme platformlarından hem yapışkan hem de süspansiyon hücrelerini toplamak için uygulanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler) şu anda çeşitli hastalıklar için umut verici bir hücre bazlı terapötik yöntem olarak araştırılmaktadır ve önümüzdeki birkaç yıl içinde klinik kullanım için daha fazla pazar onayı beklenmektedir. Bu geçişi kolaylaştırmak için ölçek, partiden partiye tekrarlanabilirlik, maliyet, mevzuata uygunluk ve kalite kontrolünün darboğazlarını ele almak kritik öneme sahiptir. Bu zorluklar, süreci kapatarak ve otomatik üretim platformlarını benimseyerek ele alınabilir. Bu çalışmada, ters akış santrifüjleme kullanarak çok katmanlı şişelerden Wharton'un jöle (WJ) türevi hMSC'lerin (WJ-hMSC'ler) geçirilmesi ve toplanması için kapalı ve yarı otomatik bir süreç geliştirdik. WJ-hMSC'ler, düzenleyici uyumlu serumsuz kseno içermeyen (SFM XF) ortam kullanılarak genişletildi ve klasik serum içeren ortamlarda genişletilen WJ-hMSC'lerle karşılaştırılabilir hücre proliferasyonu (popülasyonun iki katına çıkması) ve morfolojisi gösterdi. Kapalı yarı otomatik hasat protokolümüz yüksek hücre geri kazanımı (~% 98) ve canlılık (~% 99) göstermiştir. Karşı akış santrifüjleme kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, WJ-hMSC yüzey belirteci ekspresyonunu, koloni oluşturan birimleri (CFU-F), trilineaj farklılaşma potansiyelini ve sitokin sekresyon profillerini korudu. Çalışmada geliştirilen yarı otomatik hücre toplama protokolü, düşük çıktı hacmiyle hacim azaltma, yıkama ve hasat gerçekleştirmek için farklı hücre genişletme platformlarına doğrudan bağlanarak çeşitli yapışkan ve süspansiyon hücrelerinin küçük ila orta ölçekli işlenmesi için kolayca uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler), terapötik potansiyelleri ve klinik olarak ilgili hücre dozlarını üretmek için kritik olan in vitro olarak büyümek için yüksek kendini yenileme potansiyelleri göz önüne alındığında, hem doku mühendisliğinde hem de hücre terapilerinde klinik uygulamalar için mükemmel bir adaydır 1,2,3. ClinicalTrials.gov'ye göre, şu anda çeşitli hastalık koşulları için araştırılmakta olan 1.000'den fazla klinik çalışma bulunmaktadır4. hMSC'lerin kullanımına olan ilginin artması göz önüne alındığında, yakın gelecekte daha fazla klinik çalışma ve pazar onayı yakındır 5,6. Bununla birlikte, hMSC'lerin üretimi, partiden partiye değişkenlik, yüksek riskli hammaddelerin kullanımı, birçok açık ve manuel işlem nedeniyle kontaminasyonla ilgili endişeler açısından birçok doğal zorluğa sahiptir, çünkü üretim birden fazla birim operasyonu, daha yüksek işçilik maliyetleri, ölçeklendirme veya ölçeklendirme maliyeti ve düzenleyici engeller 6,7,8,9,10, 11,12. Bu sorunlar, mevcut ve gelecekteki pazar erişiminin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir.

Kapalı, modüler, otomatik üretim çözümlerinin geliştirilmesi ve düşük riskli yardımcı reaktiflerin kullanılması bu zorlukların üstesinden gelecektir. Bu aynı zamanda tutarlı ürün kalitesi sağlayacak, insan hatasından kaynaklanan parti arızası olasılığını azaltacak, işçilik maliyetlerini düşürecek ve dijital partikaydı tutma 8,12,13,14 gibi süreç standardizasyonunu ve mevzuata uygunluğu iyileştirecektir. Klinik olarak ilgili bir hücre dozu elde edebilmek için, otolog veya allojenik olsun, yukarı akış hücre genişlemesini ve kapalı, otomatik bir şekilde aşağı akış işlemeyi içeren aerodinamik üretim çok önemlidir.

Yukarı akış hMSC genişlemesi için, şu anda kullanılan en yaygın iki üretim yöntemi, ölçek genişletme (2D tek katmanlı) ve ölçek büyütme (3D mikrotaşıyıcı tabanlı süspansiyon sistemi)15,16,17,18'dir. hMSC genişletme için en geleneksel ve yaygın olarak benimsenen yöntem, düşük üretim maliyeti ve kurulum kolaylığı nedeniyle 2D tek katmanlı tabanlı kültürdür19.

Bir kültür kabı içinde istiflenmiş düz yüzey tepsilerinden oluşan çok katmanlı şişeler, hMSC üretimini ölçeklendirmek için yaygın olarak kullanılır. Bu sistemler tipik olarak 1 katmanlı ila 40 katmanlı kültür kapları20 olarak gelir ve biyogüvenlik kabinlerinin içinde manuel olarak kullanılır. Hücre geçişi ve hasadı sırasındaki işleme adımları, genleşme ortamının, ayrışma reaktifinin ve yıkama tamponunun pipetleme veya fiziksel olarak eğilerek tüm kabın manuel olarak dağıtılmasını ve boşaltılmasını içerir. Ayrıca, birden fazla üniteyi kullanmak, boyutları ve ağırlıkları nedeniyle zorlu ve zaman alıcıdır.

Daha sonra, çok katmanlı şişelerden hasat sonrası, ortam değişimi için santrifüjleme, hücre yıkama ve hacim azaltma, tüm hücre üretim iş akışı21 boyunca temel adımlardır. Geleneksel tezgah üstü santrifüjleme, hücre süspansiyonunun bir biyogüvenlik kabini içindeki kapaklı tüplere veya şişelere aktarılması, hücrelerin döndürülmesi, süpernatanın manuel olarak aspire edilmesi, tamponla hücre yeniden süspansiyonu ve tekrarlanan hücre yıkamaları gibi çok sayıda adımı içeren çoğunlukla açık ve manuel bir işlemdir. Bu, hem kapakların açılıp kapanması nedeniyle kontaminasyon riskini hem de manuel aspirasyon/pipetleme işlemi sırasında hücre peletini kaybetme olasılığını önemli ölçüde artırır22. hMSC'ler gibi yapışkan tabanlı hücreler için çok katmanlı kültür sistemlerinin elleçlenmesi bağlamında, operatörün santrifüj ve biyogüvenlik kabini arasında tekrar tekrar durma ve aynı anda ağır bir üniteyi kullanma zahmetli bir süreçten geçmesi gerekecektir. Bu manuel adımlar zahmetlidir, insan hataları ve kontaminasyon açısından risk oluşturur ve23 maliyetli olan B Sınıfı temiz oda ortamında gerçekleştirilmelidir. Ek olarak, geleneksel manuel santrifüjleme işlemi ölçeklenebilir değildir ve hücresel kayma ve strese neden olabilir; Bu nedenle, hücre geri kazanımını, canlılığını ve artık safsızlıkların yıkanma verimliliğini en üst düzeye çıkarmak diğer önemli zorluklardır22. Hücre terapilerinin ticari cGMP ölçekli üretimi, kontaminasyon riskini azaltmak, tutarlı ürün kalitesi sağlamak, işçilik ve üretim maliyetlerini azaltmak ve proses güvenilirliğini artırmak için kapalı, modüler otomasyon çözümleri gerektirir24,25. Çok katmanlı şişeler, steril gaz değişimini kolaylaştırmak için portlardan birinde steril 0,2 μm filtreye ve konektörler aracılığıyla aseptik olarak bağlanmış veya hücre hasadı için doğrudan otomatik bir hücre işleme cihazına tüp kaynaklı ikinci bir porta sahip olarak kapalı bir sistem olarak kullanılabilir. Hücre, gen veya doku bazlı ürünlerin üretimine yönelik yenilikçi bir kapalı karşı akış santrifüjünü değerlendirerek WJ-hMSC geçiş ve hasadının çoğu adımını kapatmak ve otomatikleştirmek için çalıştık. Bu karşı akışlı santrifüj ayrıca, çeşitlihücre tipleri 8,26,27,28 için boyut, orta/tampon değişimi, konsantrasyon ve hasat gibi hücre ayırma gibi çeşitli hücre işleme uygulamalarını gerçekleştirme esnekliğine sahiptir. Cihaz, torbaları aktarmak için boru kaynağı veya aseptik konektörler kullanılarak steril olarak bağlanabilen veya doğrudan tercih edilen herhangi bir genişletme platformuna bağlanabilen kapalı, tek kullanımlık bir kit kullanır.

Bu çalışmada, tek kullanımlık karşı akışlı santrifüjleme kiti ile çok katmanlı şişe arasında kapalı steril bağlantılara izin vermek için özel bir boru tertibatı tasarladık. WJ-MSC'leri çok katmanlı şişeden tek bir çalıştırmada tamamen kapalı ve yarı otomatik bir şekilde enzimatik olarak ayırmak, yıkamak ve hasat etmek için bir protokolü optimize ettik. Hasat edilen WJ-hMSC'ler, nihai ürünün lot salınımı için kritik kalite özelliklerini (CQA'lar) karşıladığından emin olmak için saflık (yüzey belirteci analizi) ve potens (CFU-F, trilineage farklılaşması ve sitokin sekresyon profilleri) için karakterize edildi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kültür ortamının hazırlanması ve kültür kaplarının kaplanması

  1. Medya hazırlığı
    1. Klasik serum içeren ortamın bileşimi: αMEM (445 mL), fetal sığır serumu (FBS) (50 mL) ve 100x penisilin-streptomisin (5 mL) karıştırarak klasik serum içeren ortamı hazırlayın.
    2. SFM XF ortamının tamamını hazırlayın.
      1. SFM XF bazal ortamına (500 mL ) aseptik olarak 5 mL SFM XF takviyesi (100x) ve 5 mL 100x L-alanil-L-glutamin (bkz.
      2. SFM XF bazal orta torbasına (2 L) aseptik olarak 20 mL özel MSC SFM XF takviyesi (100x) ve 20 mL 100x L-alanil-L-glutamin (bkz. Malzeme Tabloları) ekleyerek 50 mL'lik bir şırıngayı torbanın uygun portuna bağlayarak 2 L'lik bir medya torbası yapın.
        NOT: Kültürde kullanmadan önce, SF XF ortamının tamamına büyüme faktörleri veya sitokinler (ortamla birlikte verilmez) ekleyin: PDGF-BB (20 ng / mL), FGF bazik (4 ng / mL) ve TGFβ (0.5 ng / mL).
  2. Serumsuz besiyeri ile kullanım için hücre kültürü damarlarının vitronektin ile kaplanması
    1. Bir vitronektin stoğunu (VTN-N; 0.9 mg/mL) 4 °C'de çözün.
    2. Çözülmüş VTN-N'yi 5 μg / mL'lik bir çalışma konsantrasyonuna seyreltmek için steril Dulbecco'nun kalsiyum ve magnezyum içermeyen tamponlanmış salinini (DPBS) kullanın.
      NOT: VTN-N'yi kullanmadan hemen önce seyreltin ve seyreltilmiş vitronektin çözeltisini saklamayın.
    3. İlgili kültür kabına seyreltilmiş VTN-N çözeltisinden 1 mL/10cm2 ekleyin; Son konsantrasyon 0,5 μg/cm2'dir. Örneğin, bir T-75 şişesine (75cm2) 7,5 mL seyreltilmiş VTN-N çözeltisi ekleyin; bir T-175 şişesine (175cm2) 17,5 mL seyreltilmiş VTN-N çözeltisi ekleyin; standart dört katmanlı çok katmanlı bir şişeye (2.528cm2) 250 mL seyreltilmiş VTN-N çözeltisi ekleyin; ve 10 katmanlı çok katmanlı bir şişeye (6.320cm2) 630 mL seyreltilmiş VTN-N çözeltisi ekleyin.
    4. Steril koşullar altında, damarları oda sıcaklığında (RT) 1 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Kaplanmış kültür kabı 4 °C'de 1 haftaya kadar saklanabilir. Kurumasını önlemek için kültür kabını laboratuvar filmi ile sarın. Kullanmadan önce, kültür kabını en az 1 saat boyunca oda sıcaklığına ısıtın.
    5. VTN-N çözeltisini aspire edin, atın ve kaplanmış kap yüzeyinin kurumasını önlemek için hemen yeterli miktarda kültür ortamı ekleyin.
      NOT: VTN-N'nin çıkarılmasından sonra kültür kabının durulanması gerekli değildir.

2. WJ-hMSC genişletmesi

  1. Kriyoviyal 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirerek WJ-hMSC'leri (p2) hızla çözün; İçindekiler çözülmeye başlayana kadar şişeyi yavaşça döndürün.
  2. Çözüldükten sonra, WJ-hMSC'leri bir T-175 şişesinde (VTN-N kaplaması olmadan) 5.000 hücre /cm2'de tohumlayın ve hücre genişlemesi için% 5 CO2'lik nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de klasik serum içeren ortamda inkübe edin. İki pasajdan sonra (p4), genişletilmiş hücreleri istenen kriyoprezervasyon ortamında çalışan bir hücre bankası (WCB) olarak yatırın.
  3. Toplam hücre sayısını, hücre canlılığını ve hücre boyutunu belirlemek için canlılık ve hücre sayımı yöntemini izleyen otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin29.
  4. p4'ten itibaren, WJ-hMSC'leri klasik serum içeren ortamda veya SFM XF ortamında T-75 şişelerinde 5.000 hücre/cm2'de kültürleyin (SFM XF ortamına sahip VTN-N kaplı şişeler kullanın).
  5. Hücreleri her iki kültür ortamında toplam üç pasaj (12 gün) boyunca tutun ve her pasajın kültürünün sonunda sayılan canlı hücrelerin sayısını, kültürün başlangıcındaki canlı hücrelerin sayısına (hücre tohumlama günü) bölerek her geçişteki hücre genişlemesini (katlanma artışı) ölçün.

3. Tohum treni ölçek genişletme genişletme

  1. T-175 şişesinde WJ-hMSC genişletme
    1. Kriyoviyal 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirerek WJ-hMSC'leri p4'te hızla çözün; Çözelti buz çözmeye başlayana kadar şişeyi yavaşça döndürün.
    2. VTN-N kaplı bir T-175 şişesine 5.000 hücre/cm2 tohumlayın. Hücrelerin% 5 CO2 ile 37 ° C'de bir inkübatörde büyümesine izin verin.
    3. Optimum performans ve hücre büyümesi için harcanan kültür ortamını her 2-3 günde bir taze hazırlanmış, önceden ısıtılmış komple SFM XF ortamı ile değiştirin.
  2. Çok katmanlı şişelerin taşınması (Şekil 1A, B)
    1. Tüm aseptik bağlantıların steril bir ortamda yapılması gerekir.
    2. Çok katmanlı şişeyi biyolojik bir güvenlik kabininin içinden çıkarın.
    3. Karşı akış santrifüjünü kullanarak sıvı transferi sırasında basıncın serbest bırakılmasını sağlamak için önceden sterilize edilmiş hava filtresini (0,2 μm) bir porta bağlayın.
    4. Çok katmanlı şişe konektörünü özel boru setinden diğer bağlantı noktasına takın (Şekil 1B).
    5. Özel boru setinin PVC hattını, SFM XF ortamının tamamını içeren 2 L PVC transfer torbasına kaynaklayın.
      NOT: Orta boy torbayı yerçekimi akışı ile çok katmanlı sisteme eklemeden önce tamamen karıştırın. PVC transfer torbasının çok katmanlı şişeden daha yükseğe asılı olduğundan emin olun.
    6. Çok katmanlı şişeyi, hava filtresi üstte olacak şekilde uzun tarafına yerleştirin (Şekil 1B).
    7. Çok katmanlı şişeyi doldurmaya başlamak için PVC boru üzerindeki kelepçeyi açın. Dolum sırasında ortamın tepsiler arasında düz olduğundan emin olun.
    8. Ortam tüm tepsilerde tamamen düzleştikten sonra, çok katmanlı şişeyi bağlantı noktaları dik olacak şekilde kısa tarafına çevirin.
    9. PVC hattındaki kelepçeyi kapatın ve boru bağlantısını MPC mavi kapatma kapağıyla değiştirerek transfer torbasını çıkarın.
      NOT: Hava filtresini çıkarmayın, çünkü bu, hücre genleşmesi sırasında gaz değişimine izin verir.
    10. Çok katmanlı şişeyi kuluçka konumuna getirin.
      NOT: Filtre ve boru bağlantısı yukarı bakmalıdır.
    11. Çok katmanlı şişeyi bir aspiratör şişesine bağlayarak boşaltın; Aspiratör şişesinin üzerine yerleştirin ve sıvı dışarı akacaktır.
      NOT: Harcanan ortamı yerçekimi ile tamamen boşaltmak için çok katmanlı şişeyi yana doğru eğin. Alternatif olarak, harcanan ortam özel bir boru tertibatı kullanılarak bir atık şişeye dökülebilir.
    12. Taze ortamı doldurmak için 3.2.5-3.2.11 adımlarını tekrarlayın.
  3. Çok katmanlı şişedeki WJ-hMSC'lerin alt kültürü (T-175 > 4 katmanlı > 10 katmanlı)
    1. Ön sıcak hücre ayrışma reaktifi (TrypLE) ve kullanımdan önce 37 ° C'lik bir inkübatör içinde SFM XF ortamını tamamlayın.
    2. Harcanan ortamı T-175 şişesinden aspire edin ve atın.
    3. Hücre tek katmanını önceden ısıtılmış DPBS ile yıkayın, aspire edin ve atın.
    4. Her şişeye TrypLE ekleyin, hücre tek katmanının tam olarak kaplanmasını sağlayın ve 37 ° C'de 5-10 dakika inkübe edin.
    5. Süspansiyonu steril bir 50 mL konik tüpe aktarın.
    6. RT'de tüpü 100-200 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
    7. Hücre sayımı için hücre peletini minimum hacimde (10 mL) ön ısıtmalı tam SFM XF ortamında yeniden askıya alın.
    8. VTN-N kaplı dört katmanlı bir kültür kabını, yukarıdaki bölüm 2'de belirtildiği gibi, yaklaşık 800 mL tam SFM XF ortamı ile doldurun. 5.000 hücre/cm2 ekleyin (yani, 1,26 x 107 canlı hücre/şişe). Eşit bir dağılım sağlamak için hücre süspansiyonunu yavaşça döndürün.
    9. Nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    10. Hücreler% 60-80 akıcılığa ulaşana veya 10 katmanlı çok katmanlı şişeye alt kültüre alınmaya hazır olana kadar optimum hücre büyümesi için her 2-3 günde bir harcanan kültür ortamını taze, önceden ısıtılmış tam SFM XF ortamı ile değiştirin.
    11. VTN-N kaplı 10 katmanlı çok katmanlı bir şişeyi, bölüm 2'de belirtildiği gibi yaklaşık 2 L tam SFM XF ortamı ile doldurun. 5.000 hücre/cm2 ekleyin (yani, 3,1 x 107 hücre/şişe). Eşit bir dağılım sağlamak için hücre süspansiyonunu yavaşça döndürün.
    12. Nemlendirilmiş bir atmosferde% 5 CO2 içeren 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    13. Hücreler% 60-80 akıcılığa ulaşana veya hasat edilmeye hazır olana kadar optimum hücre büyümesi için her 2-3 günde bir harcanan kültür ortamını taze, önceden ısıtılmış tam SFM XF ortamı ile değiştirin.

4. Kapalı yarı otomatik WJ-hMSC ayrışması ve kapalı karşı akış santrifüjleme kullanılarak hasat

  1. Tek kullanımlık ters akışlı santrifüj kiti tertibatı
    1. Tek kullanımlık kiti tek kullanımlık PVC transfer torbalarına Şekil 1A'da gösterilen konfigürasyona benzer şekilde boru kaynağı yoluyla bağlayın.
      NOT: Tek kullanımlık kitin varsayılan akış hızı 30-165 mL/dak'dır.
    2. Akıcı WJ-hMSC'ler içeren 10 katmanlı çok katmanlı bir şişeyi, bir biyogüvenlik kabini içindeki özel boru tertibatına takın.
    3. Özel boru tertibatı ile ekli 10 katmanlı kültür kabını bir tezgaha aktarın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi tek kullanımlık kitin E Hattına (ID PVC'de 3/32) kaynak yapın.
    4. Yüksek akışlı tek kullanımlık kitin G Hattına steril bir numune portu kaynak yaptığınızdan emin olun.
    5. Ardından, hasat H hattını 50 mL'lik bir şırınga ile donatılmış steril bir Luer'e bağlayın.
      NOT: Yukarıdaki adımların tümünde, her bir kit torbasındaki sıvıyı sabitlemek için manuel kelepçelerin kapalı olduğundan emin olun.
  2. Enstrüman çalıştırmayı ayarlama
    1. Cihazın arkasındaki geçiş düğmesini açarak cihazı " AÇIK" duruma getirin.
    2. Sağlanan USB-C kablosunu kullanarak dizüstü bilgisayarı cihazdaki USB-C bağlantı noktasına bağlayın (Şekil 1B).
    3. Karşı akışlı santrifüj grafik kullanıcı arabirimi (GUI) yazılımını masaüstünden veya başlat menüsünden çalıştırın.
    4. Oturum açtıktan sonra, ana karşılama sayfasındaki Bir Protokol Seç düğmesine tıklayarak protokolü yükleyin.
      NOT: Karşı akış santrifüjleme hasat protokolü (Tablo 1), Protokol Oluşturucu yazılımı kullanılarak oluşturulmuş ve yerel olarak depolanmıştır.
    5. Cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve cam kapıyı açın.
    6. Monte edilmiş tek kullanımlık kiti karşı akışlı santrifüjleme sistemine yükleyin.
    7. Askı kancalarına asılı torbaları, Şekil 1B'de gösterildiği gibi, 10 katmanlı çok katmanlı şişe bir açıyla yerleştirilmişken, kabarcık sensörü şeritleri üzerindeki tüp bağlantı noktalarıyla en iyi şekilde hizalayacak şekilde asarak başlayın.
    8. Kiti iki kit konum düğmesiyle hizalayın, pompa borusunu peristaltik pompanın etrafına gerin ve beyaz ampul şeklindeki konektörü yerine bastırın .
      NOT: Basınç sensörü üzerindeki borunun boru rayına doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun.
    9. Santrifüj odasını, ters akışlı santrifüj odası taşıyıcısının gümüş kolunu kaldırarak ve kolu dik konumuna getirerek sabitleyerek takın.
    10. Kit üzerindeki her bir bağlantı noktasından boruyu kabarcık sensörü şeritleri boyunca uzanan izlere bastırın.
      NOT: Protokol sürecinin kolayca takip edilebilmesi için torbaların karışık olmadığından emin olun.
    11. Kapı mandalına bastırarak kapıyı kapatın .
      NOT: Pompa kelepçe kolu kapanacak, santrifüj odası dönecek ve valfler kapanacaktır. Kapıyı kapatmadan, sistem protokolü başlatamaz ve çalıştıramaz.
    12. GUI'deki Başlat düğmesine basın. Bir kontrol listesi görünecektir; İlk dört öğe cihaz kontrolleridir ve son iki öğe kullanıcı kontrolleridir (çantaların ve bağlantıların kit görüntüsüyle eşleştiğinden emin olun ve manuel kelepçelerin açık olduğundan emin olun).
      NOT: Cihaz kontrollerinde, bir şeyler yolunda gitmiyorsa mavi onay işaretleri yerine kırmızı X'ler gösterilir.
    13. Protokol girişleri ekranını göstermek için Onayla'ya basın.
    14. Veri girişi (Hasat Hacmi) iletişim kutusu değerini 45 mL olarak ayarlayın ve Onayla'ya basın.
      NOT: Kullanıcı tarafından oluşturulan protokolde herhangi bir değişken veri girişi ayarlanmışsa, protokol giriş ekranı sorulur. Hasat hacmi bu protokolde bir değişken olarak ayarlanır ve kullanıcı son hücre yoğunluğu gereksinimlerine bağlı olarak farklı hacimleri test etmeyi seçebilir. Sistemin izin verdiği minimum hasat hacmi 5 mL'dir. Sistem, her protokol için en fazla dört veri değişkeninin ayarlanmasına izin verir.
  3. Protokolü çalıştırma
    1. GUI'de Başlat'a tıklayın ve protokol çalışmasını başlatmak için cihazdaki yeşil Başlat düğmesine basın (Tablo 1'e bakın).
      NOT: Sistem, sistemdeki havayı bir tampon ile değiştirerek astarlama sekansından başlayarak protokole göre adımları başlatacaktır.
    2. Astarlama tamamlandıktan sonra (Tablo 1, adım 8), harcanan ortamın tamamen atık torbasına pompalandığından emin olun.
      NOT: 10 katmanlı çok katmanlı şişe boşaldığında, sistem GUI'deki kullanıcıdan kabın boş olup olmadığını onaylamasını isteyecektir. Gemi boşsa cihazdaki "Atla" düğmesine basın; değilse, kalan sıvıları kaptan boşaltmaya devam etmek için yeşil "Oynat / Duraklat" düğmesine basın.
    3. Duraklatma adımları 15, 19 ve 22'de (Tablo 1) çok katmanlı şişeyi kaldırdığınızdan ve arabelleği tüm tepsilere eşit olarak dağıtmak için salladığınızdan emin olun. Tamamlandığında, sonraki adımlar için 10 katmanlı çok katmanlı şişeyi orijinal çizim konumuna geri yerleştirin.
      NOT: Sadece Tablo 1'deki 19. adım için, salladıktan sonra, çok katmanlı şişeyi düz bir şekilde yerleştirdiğinizden emin olun ve hücreleri ayırmak için RT'de 10-15 dakika inkübe edin.
    4. Adım 20 ve adım 23'te (Tablo 1), tripnize edilen hücrelerin tamamen ara torbaya aktarıldığından emin olun.
    5. Ara torbayı adım 25'te manuel olarak iyice karıştırın (Tablo 1).
    6. 26. adımda (Tablo 1), örnekleme portundan numune almak için 2 mL'lik bir Luer şırıngası kullanın.
      NOT: Doğru hücre sayımı için en az üç kez numune alınması önerilir.
    7. Adım 29 ve adım 30'da (Tablo 1), akışkanlaştırılmış hücre yatağının kararlı oluşumunu kontrol edin; Şekil 1C'de gösterildiği gibi akışkanlaştırılmış hücre yatağına benzer olmalıdır.
      NOT: Kararlı akışkanlaştırılmış hücre yatağı Şekil 1C'de gösterilene benzer şekilde oluşturulmamışsa, g kuvvetinin akış hızına (G / F) oranını optimize etmek, hücre yükleme ve yıkama adımları sırasında odada kararlı bir akışkanlaştırılmış hücre yatağı (yüksek hücre geri kazanımı) elde etmek için kritik öneme sahiptir. G / F oranı, hücrelerin boyutuna ve ortamın yoğunluğuna bağlıdır. Yüksek yoğunluklu bir numune/yıkama tamponu için yüksek bir G/F oranı gerekirken, düşük yoğunluklu bir numune/yıkama tamponu için düşük bir G/F oranı kullanılabilir.
    8. Çalıştırma, Rampadan Durmaya adımında ( Tablo 1'deki adım 35) tamamlanır ve karşı akış santrifüjleme sistemindeki tüm sıkıştırma değerleri otomatik olarak kapanır.
      NOT: Son olarak, kapıyı açmadan önce her bir kit torbasındaki sıvıyı sabitlemek için manuel kelepçelerin kapalı olduğundan emin olun.
    9. Protokol çalışması tamamlandıktan sonra, cihazdaki mavi kilit açma düğmesine basın ve cam kapıyı açın. Hasat edilen konsantreyle birlikte tek kullanımlık kiti cihazdan çıkarın.
    10. Hasat hattını elle taşınan bir tüp kapatıcı kullanarak aseptik olarak kapatın. Konsantre hücre hasadı ile doldurulmuş kapalı şırıngayı, hücre sayımı ve kriyoprezervasyon için biyolojik güvenlik kabinine dikkatlice aktarın.
    11. Kolu kullanarak odayı tekrar ayırın, ampul konektörünü bağlantı parçasından çekin ve kiti dikkatlice kaldırın ve bir biyolojik tehlike torbasına atın.
    12. Cihazı etanol mendiller kullanarak temizleyin ve kapıyı kapattığınızdan emin olun.
    13. Cihazın arkasındaki anahtarı kapatmadan önce GUI uygulamasını kapatın.
      NOT: Hücre toplama protokolü biyolojik üçlülerde test edilmiştir (n = 3).

5. Kritik kalite öznitelikleri (CQA) değerlendirmesi

  1. Hücre kimliği yüzey belirteçleri (CD73, CD90 ve CD105) ve stromal olmayan belirteçler (CD34 ve CD45)
    1. Hasat edilen WJ-hMSC hücre süspansiyonunu, uygun hacimde bir akış sitometri tamponu (% 1 BSA veya% 2 FBS ile DPBS) ekleyerek 1 x 106 canlı hücre / mL konsantrasyonuna seyreltin.
    2. Her bir mikrosantrifüj tüpüne veya 96 delikli plakaya 100 μL hücre süspansiyonu ekleyin. 100 μL hücre süspansiyonu başına en az 0,1 x 106 hücre bulunduğundan emin olun.
    3. Antikor satıcısı tarafından önerildiği gibi, uygun bir seyreltmede numuneye florofor konjuge antikor ekleyin.
    4. Karanlıkta 20 dakika kuluçkaya yatırın.
    5. İnkübasyondan sonra, numuneleri 3 dakika boyunca 380 x g'de santrifüjleme ile yıkamak için 100 μL akış sitometri tamponu ekleyin.
    6. Peletleri geride bırakarak süpernatanı atın.
    7. Hücre peletini 200 μL akış sitometri tamponunda yeniden askıya alın ve akış sitometri analizine tabi tutun30.
  2. Koloni oluşturan birimler fibroblastik tahlil (CFU-F)
    1. Hücre süspansiyonunu 1.000 canlı hücre / mL tam kültür ortamı konsantrasyonuna seyreltin.
    2. Tam kültür ortamında 6 delikli bir doku kültürü plakasında kuyu başına ~ 500 hücre plakası.
    3. %5 nemlendirilmiş CO2'de 37 °C'de 10-14 gün boyunca inkübe edin, PBS ile yıkayın ve RT'de 30 dakika boyunca metanol içinde% 0.5 Kristal menekşe ile lekeleyin.
    4. Her kuyudaki kolonileri numaralandırın.
    5. CFU-F verimliliğini hesaplayın: Koloni oluşumunun yüzde verimliliğini elde etmek için orijinal tohumlama numarası tarafından oluşturulan koloni sayısını bölün ve yüzde olarak ifade edin.
  3. Trilineage farklılaşma potansiyeli
    1. Üreticinin protokolüne göre 12 kuyucuklu plakalarda osteogenez ve adipogenez farklılaşma ortamına 5 x 103 hücre/cm2 tohumlayın. Kondrogenez için, 1.6 x 107 canlı hücre / mL hazırlayın ve üreticinin protokolüne göre, 96 delikli plakaların kuyucuklarının merkezlerinde hücre çözeltisinin 5 μL damlacıklarını tohumlayarak mikro kütle kültürleri oluşturun.
    2. Farklılaştırma sırasında, her 3-4 günde bir tam ortam değişiklikleri yapın.
    3. 14 gün sonra (adipogenez için) veya 21 gün sonra (osteogenez ve kondrogenez için), üreticinin protokolüne göre soya özgü biyolojik lekeler kullanarak kültürleri farklılaşma açısından izleyin. Adipojenik farklılaşma için, kültürleri% 0.5 Yağ Kırmızı O çözeltisi ile boyayın. Osteogenez için,% 2'lik bir Alizarin Red S çözeltisi kullanarak boyama yapın. Kondrojenik farklılaşma için, mikro kütle peletlerini% 1 Alcian Mavisi ile boyayın.
  4. Sitokin sekresyon profilleri
    1. Elle veya ters akışlı santrifüjleme sistemini kullanarak hasat edilen kriyokorunmuş hücreleri çözün ve SFM XF ortamına sahip bir T-175 şişesinde 5.000 hücre/cm2 tohumlayın.
    2. 4 gün sonra, harcanan kültür ortamını toplayın ve analize kadar -80 ° C'de saklayın.
    3. Bir multipleks okuyucu üzerinde bir sitokin ekspresyon profilleri 19-plex panel kiti kullanarak sitokinlerin ekspresyonunu sayısallaştırın.
    4. Multipleks immünotahlilleri üreticinin tavsiyelerine göre gerçekleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

WJ-hMSC ana hücre bankası (MCB) çözülme sonrası, deneyler için yeterli çalışan hücre bankası (WCB) üretmek için klasik serum içeren ortamda üç ardışık geçiş (p1-p4) için korunmuştur. P4 WCB'ler, T-175 şişelerinde üç geçiş daha (p4-p7) için hem serum içeren ortamda hem de SFM XF ortamında çözüldü ve genişletildi. WJ-MSC'ler SFM XF ortamında genleştirildiklerinde iyi adapte olmuşlar ve serum içeren ortamdakine benzer stabil proliferasyonu koruyabilmişlerdir (Şekil 2A). Bununla birlikte, SFM XF ortamında genişleyen hücreler, biraz daha uzun fibroblast benzeri iğ şeklindeki morfoloji sergiledi ve serum içeren ortamda ~15 μm'ye kıyasla ortalama ~17 μm'lik biraz daha büyük bir hücre boyutu (Şekil 2B) ile sonuçlandı. Üç pasaj boyunca her iki ortam koşulunda da, WJ-hMSC'ler sürekli olarak ~ 2.3 x 104 hücre /cm2'lik maksimum hücre yoğunluğuna ve ~ 34 saatlik bir popülasyon iki katına çıkma süresine ulaştı (Şekil 2C, D).

Kapalı bir sistemde büyük ölçekli WJ-hMSC genişletmesi için, WJ-hMSC'lerin tohum treni genişletmesini önce 4 katmanlı bir şişede ve daha sonra 10 katmanlı çok katmanlı bir şişede gerçekleştirdik. 4 günlük kültürden sonra% 80 -% 90 akıcılıkta, 4 katmanlı ve 10 katmanlı yığınlar için sırasıyla 9.6 x 10 7 ± 0.9 x 107 ve 2.3 x 10 8 ± 0.2 x 108 hücre hasat ettik. T-175 şişelerine kıyasla 3.6 x 10 4-3.8 x 104 hücre /cm2'lik daha yüksek bir hücre yoğunluğuna ulaşıldı, yani yığınlar yedi kata kadar daha iyi hücre genişlemesine izin verdi.

Ayrıca, 10 katmanlı kültür kaplarında genişleyen WJ-hMSC'ler, karşı akış santrifüjleme kullanılarak doğrudan hasat edildi. Cihazın peristaltik pompası kullanılarak maksimum 165 mL/dak akış hızında doğrudan sıvı transferi için tek kullanımlık kit ile steril bağlantı kurmak kolaydı. Yarı otomatik hücre toplama işlemi, önce enzimatik ayrışma kullanarak hücrelerin toplanması, hücrelerin hacim azaltma ve konsantre etme için karşı akış odasına yüklenmesi ve daha sonra karşı akış santrifüjleme odasının hacminin yaklaşık 3 katı olan yıkama tamponu ile yıkanmasıyla elde edildi. Ayrıca, yıkanan hücreler daha sonra konsantre edildi ve protokolde önceden ayarlanmış istenen hasat hacmine hasat edildi. Yarı otomatik hücre işleme için kullanılan işleme adımları, manuel hasat iş akışını taklit etmek için tasarlanmıştır. 10 kat hacim azalması elde ettik, bu da 5.3 milyon hücre / mL'ye kadar yüksek hücre konsantrasyonlarının üretilmesiyle sonuçlandı. Protokol, her üç bağımsız çalışma için tutarlı bir şekilde ~% 98'de yüksek hücre geri kazanımı ve ~% 99'da yüksek hücre canlılığı elde edebildi (Şekil 3A-C).

Manuel santrifüjlemeye kıyasla ters akışlı santrifüjleme kullanarak hücre hasadının kritik kalite özelliklerini belirlemek için kapsamlı hücre karakterizasyon testleri gerçekleştirdik. WJ-hMSC'lerin kimliğini test etmek için, hücre yüzey belirteçleri akış sitometrisi ile analiz edildi. Şekil 4A'da gösterildiği gibi, her iki yöntem kullanılarak hasat edilen WJ-hMSC'ler, ISCT düzenlemelerine göre karakteristik yüzey işaretleyici profilleri, CD73, CD90 ve CD105'in pozitif ifadesinin yanı sıra CD34 ve CD45'in negatif ekspresyonunu göstermiştir. Daha sonra, WJ-hMSC'lerin klonojenik potansiyelini değerlendirmek için CFU-F testleri yapıldı. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, karşı akışlı santrifüjlemeden toplanan hücreler, manuel santrifüjleme ile toplanan hücrelere kıyasla benzer bir CFU-F potansiyeli göstermiştir (sırasıyla% 21 ±% 1'e karşı% 20 ±% 1). Ayrıca, Şekil 4C'de gösterildiği gibi, karşı akış sonrası santrifüjleme ile hasat edilen hücreler, manuel santrifüjleme yöntemindeki hücrelere benzer adipositlere, osteoblastlara ve kondrositlere farklılaşma yeteneğini korumuştur. Son olarak, multipleks immünoassayler kullanarak hücrelerin 18 farklı sitokin sekresyon profilini araştırdık. Şekil 4D'de gösterildiği gibi, karşı akış sonrası santrifüjleme kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, sitokin sekresyon profillerini korudu ve profiller, hücreleri yıkamadan / konsantre etmeden önce alınan numuneninkilerle karşılaştırılabilir (karşı akış öncesi santrifüjleme).

Genel olarak, bir SFM XF kültür sisteminde etkili hMSC genişlemesi gösterdik ve kapalı, otomatik karşı akışlı santrifüj sistemi kullanılarak yıkanan ve konsantre edilen hücreler, yıkama sonrası yüksek hücre geri kazanımı ve canlılığı sağladı ve fenotiplerini ve işlevlerini koruyabildi. Bu çalışmada geliştirilen kapalı yarı otomatik süreç, üç bağımsız çalışmadan kanıtlandığı gibi, nihai WJ-MSC geri kazanımı açısından ürün kalitesi tutarlılığı sağlayabilir.

figure-results-1
Şekil 1: hMSC'lerin toplanması, yıkanması ve konsantrasyonu için yüksek akışlı tek kullanımlık kit konfigürasyonu ve montajı . (A) Torbalar ilgili boruya uygun olarak bağlandıktan sonra kit diyagramı. (B) Özel boru tertibatı ile yüksek akışlı tek kullanımlık kite bağlı 10 katmanlı çok katmanlı şişe. (C) Karşı akış santrifüj yazılımının grafik kullanıcı arayüzünde etkinleştirilen kamera fonksiyonu aracılığıyla karşı akış odasında oluşan kararlı akışkan hücre yatağının görselleştirilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Serum içeren besiyeri ve SFM XF besiyerinde hMSC'lerin hücre morfolojisi ve genişlemesinin karşılaştırılması. (A) Klasik serum besiyerinde ve SFM XF besiyerinde hMSC'lerin temsili hücre morfolojisi. SFM XF genişlemiş hücreler daha uzun, iğ şeklinde, karakteristik fibroblast benzeri bir morfoloji sergilerken, serum içeren ortamda yetiştirilen hücreler daha düzleştirilmiş bir morfoloji sergiledi. (B) Serum içeren ortam ile SFM XF ortamı arasındaki ortalama MSC boyutu, otomatik bir hücre sayacı ile ölçülür (n = 3). SFM XF ile genişlemiş hücrelerin genellikle farklı pasajlarda serum ile genişlemiş hücrelerden daha büyük olduğu açıktır. Farklı pasajlardaki toplam hücre verimi (n = 3) (C) kültür yüzey alanı başına düşen hücre cinsinden ve (D) popülasyon iki katına çıkan seviyeler açısından. SFM XF ortamı ile serum içeren ortam arasında farklı pasajlarda benzer hücre verimi seviyeleri elde edildi. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Karşı akışlı santrifüjleme sistemi kullanılarak işlenen hücrelerin karakterizasyonu . (A) Yıkama ve konsantrasyondan önce ve sonra toplam canlı hücreler. (B) Karşı akış santrifüjleme işleminden sonra 10 kat hacim azalması sağlanmıştır. (C) Hücrelerin toplam iyileşmesi ve yaşayabilirliği. Veriler, yıkama ve konsantrasyon işlemlerinin üç biyolojik replikası (n = 3) üzerinden ortalamalandırılır. Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kritik kalite öznitelikleri analizi . (A) Akış sitometrisinden elde edilen temsili veriler. (B) Toplam CFU'yu gösteren temsili resimler. (C) Trilineage farklılaşmasının temsili mikroskobik görüntüleri. (D) Sitokin ekspresyon analizi, karşı akış santrifüjleme sistemindeki hücrelerin işlenmesinden önce ve sonra sonuçlanır (n = 3). Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: İlk astarlama adımları da dahil olmak üzere karşı akış santrifüjleme sisteminde tripsinizasyon, yıkama ve konsantrasyon protokolü ile hMSC hasadının sırası. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, hMSC ayrışmasını kapatma ve yarı otomatik hale getirme ve bir ters akış santrifüj cihazı kullanarak tezgahta yıkama ve hasat etme yeteneğini gösterdik. Tüm iş akışındaki kritik adımlardan biri, boruların karşı akış santrifüj sistemi protokol oluşturucusunda tanımlanan önceden ayarlanmış protokole göre bağlandığından emin olmaktır. Kurulum ve kullanım basittir ve kit montajından hücre hasadına kadar 10 katmanlı bir şişeden yaklaşık 2 L kültürün işlenmesi için geçen süre yaklaşık 60 dakikaydı. Bu iş akışındaki sınırlayıcı adımlardan biri, çok katmanlı şişeden karşı akışlı santrifüj cihazına bağlı transfer torbalarına sıvı transferidir. Yüksek akışlı tek kullanımlık kit yalnızca maksimum 165 mL/dak akış hızında çalıştırılabilir ve bu, örneğin 40 katmanlı bir şişenin işlenmesi için zor olabilir. Sıvı transferi işlemini hızlandırmak için, tripsinize edilmiş içerikleri önce bir transfer torbasına aktarmak için harici yüksek akış hızlı pompalar kullanılabilir, ardından karşı akışlı santrifüjleme sistemi kullanılarak hücrelerin transfer torbasından yıkanması/konsantre edilmesi ve toplanması yapılabilir. Ayrıca, bu protokol 4 katmanlı ila 10 katmanlı çok katmanlı şişelerden geçen hücreler için de uygulanabilir. Daha da yukarı akışta, karşı akışlı santrifüjleme sistemi, çözülmüş hMSC'lerin yıkanması ve tohum trenini başlatmak için çok katmanlı şişelere doğrudan hasat ve orta formülasyon için optimize edilebilir. Karşı akışlı santrifüjleme odasındaki akışkan yatağı oluşturmak için gereken minimum hücre sayısının yaklaşık 30 milyon hücre olduğu ve parti başına işlenmesi önerilen maksimum hacmin 20 L olduğu belirtilmelidir.

Şu anda, özel boru tertibatının biyogüvenlik kabinindeki çok katmanlı şişeye tutturulması ve bileşenlerin parçalarının otoklavlanması bir cGMP ayarında arzu edilmemektedir. Alternatif olarak, özel bir gama sterilize boru tertibatı tedarikçilere dış kaynak olarak sağlanabilir. Çok katmanlı şişeler sağlayan tedarikçiler ayrıca, şişeleri 0,2 μm filtre ve tüm kıyafetin gama sterilizasyonu dahil olmak üzere istenen boru tertibatlarıyla önceden takma seçeneği de sunar. Bu, çok katmanlı şişelerin ve ekli boruların gerçekten kapalı olmasını sağlayacaktır, bu da işlemin C Sınıfı temiz oda ortamında tezgahta tamamlanabileceği anlamına gelir.

Karşı akışlı santrifüjleme sistemini kullanan bu işlem, çok katmanlı bir kaptaki yapışkan bazlı kültürlü hücrelerle sınırlı değildir ve dinamik (karıştırılmış tank veya dalga biyoreaktörleri) ve statik (gaz geçirgen) süspansiyon bazlı hücre genleşme platformlarına uyarlanabilir. Spesifik olarak, 3D mikrotaşıyıcı kültürlerde genişletilmiş hMSC'ler için, mikrotaşıyıcılardan ayrışmış hMSC'leri toplamak, yıkamak ve formüle etmek için karşı akış santrifüj sisteminde protokoller optimize edilebilir.

Genel olarak, gelişmiş proses sağlamlığı ve güvenilirliği ile translasyonel hücresel tedavilerin geliştirilmesine olan ilginin artması, kapalı, otomatik hücre işleme platformlarının geliştirilmesine yol açmıştır. Bu sistemler, elleçleme adımlarının sayısını azalttıkları, steril bağlantılarla olası kontaminasyonu önledikleri ve işçiliği azaltarak ve temiz oda alanının etkin kullanımını artırarak üretim maliyetlerini düşürdükleri için zorunludur21. Buna paralel olarak, tedavilerini tercüme etmek için düzenleyici onay arayan hücre terapisi ürün geliştiricilerinin çoğu, süreci kapatmanın ve süreç geliştirme aşaması 14,31,32 kadar erken bir zamanda tam otomasyon veya yarı otomasyon uygulamanın öneminin farkındadır.

Düzenleyici dostu SFM XF ortamının kullanımı ve 21 CFR GMP Bölüm 11 ve uluslararası kalite yönergelerine uygun yardımcı reaktiflerle birlikte, bu yarı otomatik süreç klinik üretim için kolayca uygun olacaktır. Çok katmanlı şişelerde yapışkan bazlı hücrelerin kültürlenmesinin verimliliğini ve güvenliğini artırmak, sadece hMSC tedavi alanına değil, aynı zamanda hücre hattı bankacılığı ve yapışkan virüs üretimindeki şirketlere de fayda sağlayacaktır.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P.J., A.B., R.L. ve J.N. Thermo Fisher Scientific'in çalışanlarıdır. A.L. ve S.O.'nun çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, Singapur'un A * STAR kentinden Endüstri Uyum Fonu Ön Konumlandırma (IAF-PP) fonundan (H18/01/a0/021 ve H18/AH / a0/001) gelen desteği kabul etmek ister.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2L PVC transfer torbasıTerumoBCTBB*B200TM
Alcian mavisi çözeltisi, pH 2.5Merck101647
Alizarin-Kırmızı Boyama ÇözeltisiMerckTMS-008-C
APC anti-insan CD73 AntikorBiyoefsanesi344015
APC Fare IgG1, & kappa; İzotip Ctrl (FC) AntikorBiolegend400121
Bio-Plex MAGPIX Multipleks OkuyucuBio-Rad
Ters Akışlı Santrifüj SistemiThermo Fisher ScientificA47679Gibco CTS Rotea Ters Akışlı Santrifüj Sistemi
Kristal MenekşeSigma-aldrichC0775
CTS (L-alanil-L-glutamin) GlutaMAX takviyesiTermo Fisher ScientificA1286001
CTS Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)Thermo Fisher ScientificA1285601kalsiyum yok, magnezyum yok
CTS Rekombinant İnsan Vitronektini (VTN-N)Thermo Fisher ScientificA27940
CTS TrypLE Enzim SeçThermo Fisher ScientificA1285901
Özel boru montajıSaint-Gobain ve Soğuk Ürün Şirketi (CPC)/AGama ile sterilize edilmiş 3/32" Steril bir erkek MPC (1/8 "diken) ile donatılmış ve diğer ucunda sızdırmaz hale getirilmiş ID PVC hattı. Otoklav: Bir ucunda steril bir Hücre Fabrikası bağlantı noktası konektörü ve diğer ucunda bir dişi MPC (3/8" diken) ile donatılmış kısa bir C-Flex hattı. PVC ve C-Flex hatlarını bir biyogüvenlik kabinine bağlayın
Emflon II kapsül (0.2um filtre)PallKM5V002P2G100
Fetal Sığır Serumu (FBS)Thermo Fisher Scientific12662029Mezenkimal kök hücre nitelikli, USDA onaylı bölgeler
FGF-basicThermo Fisher ScientificPHG0024
FITC anti-insan CD105 AntikorBiyoefsane323203
FITC anti-insan CD45 AntikorBiyoefsanesi304005
FITC anti-insan CD90 (Thy1) AntikorBiolegend328107
FITC Fare IgG1, κ İzotip Ctrl (FC) AntikorBiolegend400109
Hi-Flow Tek Kullanımlık KitThermo Fisher ScientificA46575Gibco CTS Rotea Hi-flow tek kullanımlık kit, akış hızı 30 – 165 mL/dk
Çok katmanlı sistemler Thermo Fisher Scientific140360 (4 katmanlı); 140410 (10 katmanlı)Nunc Standart Hücre Fabrikası Sistemleri
NucleoCounter NC-3000ChemometecNC-3000
Yağ kırmızısı O boyama solüsyonuMerck102419
PDGF-BBThermo Fisher ScientificPHG0045
Penisilin-StreptomisinThermo Fisher Scientific15140122
PerCP anti-insan CD34 AntikorBiolegend343519
PerCP Fare IgG1, κ İzotip Ctrl AntikorBiolegend400147
ProcartaPlex Multipleks İmmünoanalizlerThermo Fisher ScientificCustom 19-Plex paneli: FGF-2, HGF, IDO, IL-10, IL-1RA, IL-6, IL-8, IP-10, MCP-1, MCP-2, MIP-1 ve alfa;, MIP-1 ve beta;, MIP-3 ve alfa;, PDGF-BB, RANTES, SDF-1 ve alfa;, TGF ve alfa;, TNF-alfa, VEGF-A ve nbsp;
Numune portuThermo Fisher ScientificA50111Gama ile sterilize edilmiş leur numune portu, 2 PVC hattı takılı
StemPro Adipogenesis Farklılaşma KitiThermo Fisher ScientificA10070-01
StemPro Kondrosit FarklılaşmasıThermo Fisher ScientificA10071-01
StemPro Özel MSC SF XF Orta Kiti (SFM XF orta)Thermo Fisher ScientificME20236L1StemPro MSC SFM Bazal Orta ve Özel MSC SF XF Takviyesi (100x) StemPro
Osteogenez Farklılaşma KitiThermo Fisher ScientificA10072-01
T175 Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific159910
T75 Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific156472
TGF & beta içerir; 1Thermo Fisher BilimselPHG9204
WJ MSC'leri PromoCell(#C12971; Almanya)İnsan mezenkimal kök hücreleri
ve alfa; Nükleositli MEM mediaThermo Fisher Scientific12571063
N

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhou, T., et al. Challenges and advances in clinical applications of mesenchymal stromal cells. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 24(2021).
  2. García-Bernal, D., et al. The current status of mesenchymal stromal cells: Controversies, unresolved issues and some promising solutions to improve their therapeutic efficacy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 650664(2021).
  3. Mastrolia, I., et al. Challenges in clinical development of mesenchymal stromal/stem cells: Concise review. Stem Cells Translational Medicine. 8 (11), 1135-1148 (2019).
  4. Jovic, D., et al. A brief overview of global trends in MSC-based cell therapy. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (5), 1525-1545 (2022).
  5. Lechanteur, C., Briquet, A., Bettonville, V., Baudoux, E., Beguin, Y. MSC manufacturing for academic clinical trials: From a clinical-grade to a full GMP-compliant process. Cells. 10, 1320(2021).
  6. Fernández-Santos, M. E., et al. Optimization of mesenchymal stromal cell (MSC) manufacturing processes for a better therapeutic outcome. Frontiers in Immunology. 13, 918565(2022).
  7. Jossen, V., vanden Bos, C., Eibl, R., Eibl, D. Manufacturing human mesenchymal stem cells at clinical scale: Process and regulatory challenges. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 3981-3994 (2018).
  8. Jayaraman, P., Lim, R., Ng, J., Vemuri, M. C. Acceleration of translational mesenchymal stromal cell therapy through consistent quality GMP manufacturing. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 648472(2021).
  9. Levy, O., et al. Shattering barriers toward clinically meaningful MSC therapies. Science Advances. 6 (30), (2020).
  10. Fričová, D., Korchak, J. A., Zubair, A. C. Challenges and translational considerations of mesenchymal stem/stromal cell therapy for Parkinson's disease. npj Regenerative Medicine. 5 (1), 20(2020).
  11. Childs, P. G., Reid, S., Salmeron-Sanchez, M., Dalby, M. J. Hurdles to uptake of mesenchymal stem cells and their progenitors in therapeutic products. Biochemical Journal. 477 (17), 3349-3366 (2020).
  12. James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
  13. Ochs, J., Barry, F., Schmitt, R., Murphy, M. Advances in automation for the production of clinical-grade mesenchymal stromal cells: The AUTOSTEM robotic platform. Cell & Gene Therapy Insights. 3 (8), 739-748 (2017).
  14. Doulgkeroglou, M. N., et al. Automation, monitoring, and standardization of cell product manufacturing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 811(2020).
  15. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnology Advances. 31 (7), 1032-1046 (2013).
  16. Couto, P. S., Bersenev, A., Rafiq, Q. A. Engineering Strategies for Regenerative Medicine. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. , Academic Press. Cambridge, MA. 33-71 (2020).
  17. Tsai, A. -C., Pacak, C. A. Bioprocessing of human mesenchymal stem cells: From planar culture to microcarrier-based bioreactors. Bioengineering. 8 (7), 96(2021).
  18. Cherian, D. S., Bhuvan, T., Meagher, L., Heng, T. S. P. Biological considerations in scaling up therapeutic cell manufacturing. Frontiers in Pharmacology. 11, 654(2020).
  19. Mizukami, A., Swiech, K. Mesenchymal stromal cells: From discovery to manufacturing and commercialization. Stem Cells International. 2018, 4083921(2018).
  20. Hassan, M., et al. Large-scale expansion of human mesenchymal stem cells. Stem Cells International. 2020, 9529465(2020).
  21. Li, A., et al. Advances in automated cell washing and concentration. Cytotherapy. 23 (9), 774-786 (2021).
  22. Mehta, S. Single-use centrifugation solution for volume reduction and cell washing process in cell therapy manufacturing. Cytotherapy. 16, Supplement 101(2014).
  23. Giancola, R., Bonfini, T., Iacone, A. Cell therapy: cGMP facilities and manufacturing. Muscles Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 243-247 (2012).
  24. Moutsatsou, P., Ochs, J., Schmitt, R. H., Hewitt, C. J., Hanga, M. P. Automation in cell and gene therapy manufacturing: From past to future. Biotechnology Letters. 41 (11), 1245-1253 (2019).
  25. Iancu, E. M., Kandalaft, L. E. Challenges and advantages of cell therapy manufacturing under Good Manufacturing Practices within the hospital setting. Current Opinion in Biotechnology. 65, 233-241 (2020).
  26. Li, A., James, D., Lim, R. The Gibco™ CTS™ Rotea™ system story-A case study of industry-academia collaboration. Gene Therapy. , (2021).
  27. Li, A., et al. Improving cell viability using counterflow centrifugal elutriation. Cytotherapy. 24 (6), 650-658 (2022).
  28. Li, A., et al. Automated counterflow centrifugal system for small-scale cell processing. Journal of Visualized Experiments. (154), e60423(2019).
  29. Shah, D., Naciri, M., Clee, P., Al-Rubeai, M. NucleoCounter-An efficient technique for the determination of cell number and viability in animal cell culture processes. Cytotechnology. 51 (1), 39-44 (2006).
  30. Chan, A. K. C., Heathman, T. R. J., Coopman, K., Hewitt, C. J. Multiparameter flow cytometry for the characterisation of extracellular markers on human mesenchymal stem cells. Biotechnology Letters. 36 (4), 731-741 (2014).
  31. Smith, D., et al. Towards automated manufacturing for cell therapies. Current Hematologic Malignancy Reports. 14 (4), 278-285 (2019).
  32. Stroncek, D. F., Somerville, R. P. T., Highfill, S. L. Point-of-care cell therapy manufacturing; it's not for everyone. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 34(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsStem Cell ProcessingClosed Automated WorkflowCounterflow CentrifugationWharton s Jelly MSCsSerum Free MediumCell HarvestingColony Forming UnitsTrilineage DifferentiationSurface Marker Expression

Related Articles