Deneysel Olarak Evrimleşmiş Popülasyonlarda Yapısal Varyantların Dinamiklerini Takip Etmek

Summary

Deneysel evrim dondurulmuş arşivlerine kolayca uyarlanabilen tek nükleotid olmayan polimorfizm alel dinamiklerini takip etmek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirdik. Üçlü PCR tekniği, deneysel evrim boyunca bir yerleştirme alelinin göreceli frekansını ölçmek için otomatik paralel kılcal elektroforez ile birleştirildi.

Abstract

Yapısal varyantların (SV'ler) (yani, silmeler, eklemeler, duplikasyonlar ve inversiyonlar) artık fenotipik varyasyonda ve dolayısıyla hastalık belirleme veya yeni bir ortama adaptasyon gibi süreçlerde önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. Bununla birlikte, tek nükleotid varyantları SV'lerden çok daha fazla dikkat çekmektedir, çünkü muhtemelen tespit edilmeleri daha kolaydır ve fenotipik etkilerinin tahmin edilmesi daha kolaydır. Kısa ve uzun okunan derin dizileme teknolojilerinin geliştirilmesi, SV'lerin algılanmasını güçlü bir şekilde geliştirmiştir, ancak havuzlanmış sıralama (poolseq) verilerinden frekanslarının ölçülmesi hala teknik olarak karmaşık ve pahalıdır.

Burada, araştırmacıların SV alel frekansının dinamiklerini takip etmelerini sağlayan oldukça basit ve ucuz bir yöntem sunuyoruz. Bir uygulama örneği olarak, bakterilerin deneysel evrim popülasyonlarında bir ekleme dizisi (IS) ekleme sıklığını takip ediyoruz. Bu yöntem, yapısal varyant sınırlarının etrafındaki primer üçlülerinin tasarımına dayanır, böylece vahşi tip (WT) ve türetilmiş alellerin amplifikasyonu ile üretilen amplikonların boyut olarak en az% 5 oranında farklılık göstermesi ve amplifikasyon verimliliklerinin benzer olması gerekir. Her amplikonun miktarı daha sonra paralel kılcal elektroforez ile belirlenir ve bir kalibrasyon eğrisine normalleştirilir. Bu yöntem, diğer yapısal varyantların (delesyonlar, duplikasyonlar ve inversiyonlar) sıklığının nicelleştirilmesine ve hasta içi patojen popülasyonları da dahil olmak üzere doğal popülasyonların havuz-seq yaklaşımlarına kolayca genişletilebilir.

Introduction

Yapısal varyantlar (SV'ler), genellikle 50 bp veya daha fazlasını etkileyen genomik sekansın değişiklikleridir. Açıklanan SV'lerin dört kategorisi büyük eklemeler, büyük silmeler, ters çevirmeler ve çoğaltmalardır. Yakın zamana kadar, tek nükleotid varyantlarına (SNV'ler), fenotipik etkileri ve hastalığın genetik belirleyicileri olarak rolleri veya adaptasyona katkıları açısından yapısal varyantlardan daha fazla dikkat çekilmiştir. Bunun nedeni muhtemelen SNV'leri tespit etmenin ve fenotipik etkilerini tahmin etmenin daha kolay olmasıdır. Bununla birlikte, kısa ve uzun okunan derin dizileme teknolojileri, en azından tek bir bireyde veya klonal genomlarda

Protocol

Bu protokolün kurulması, atasal dizi içindeki ekleme, silme, ters çevirme veya çoğaltma noktası hakkında kesin bilgi gerektirir. Bu bilgi genellikle uç veya ara nokta örneklerinin tüm genom dizilimi (WGS) ile elde edilir. Aşağıdaki protokolde, her adım için bir yerleştirme mutasyonu vakası için genel prensip, deneysel bir E. coli popülasyonunda mutS genindeki bir IS10 yerleştirme sıklığının izlendiği temsili bir vaka ile birlikte verilmiştir. Bu popülasyonda, uç nokta popülasyonunun WGS'si, 2.463 ve 2.471 pozisyonları arasına 1.329 bp IS10'un yerleştirilmesini tanımladı ve bu ekleme bölgesinin çoğaltılmasıyla sonuçlandı. Bu yöntem diğer üç SV tipi iç....

Results

Bir atasal klondan ekstrakte edilen DNA'yı ve 1000. nesildeki S2.11 popülasyonundan izole edilen bir hipermutatör klonu kullanarak, Şekil 2'de gösterilen kalibrasyon eğrisini belirledik. Laboratuvarda hazırlanan DNA karışımlarından elde edilen ve paralel kılcal elektroforez cihazı ile ölçülen gerçek mutant oranlar, 0.9705'lik bir R² ile 1.0706 eğiminin doğrusal bir ilişkisi ile bağlandı. Ek olarak, biyolojik replikalar arasında iyi bir anlaşma vardı; Standart sapma, standart eğrin.......

Discussion

Burada, deneysel evrim popülasyonlarında ortaya çıkan adaptif SV alellerinin dinamiklerinin izlenmesini sağlayan uygun maliyetli bir yöntem önerdik. Bu yöntem, klasik PCR tekniklerini ve otomatik paralel kılcal elektroforezi birleştirerek, iki alelin göreceli miktarlarının belirlenmesini sağlar. Bir kez kurulduktan sonra, birçok numunedeki alel oranlarının paralel olarak ölçülmesine izin verir ve WGS'den çok daha ucuzdur. Bu yöntem, SNP dışı mutasyonlar için amplikon dizilemesine eşdeğer ve büyük SV'lerin amplikon dizile.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 İyi Etekli PCR Plakası	4titude 4Ti	- 0740	PCR
Agaroz moleküler biyoloji sınıfı	Eurogentec	EP-0010-05	Agaroz jel elektroforezi ve nbsp;
Agilent DNF-474 HS NGS Parça Kiti Parça Analiz Sistemleri için Hızlı Kılavuz	Agilent		PDF talimat kılavuzu
Tampon TBE	Panreac appliChem	A4228,5000Pc	Agaroz jel elektroforezi ve nbsp;
Kalibre Edilmiş Tek Kullanımlık Aşılama Döngüleri ve İğneleri	LABELIANS	8175CSR40H	Bakteri kültürü
Dneasy Kan ve Doku Kiti	Qiagen	69506	DNA ekstraksiyonu
Elektroforez güç kaynağı	Amilabo	ST606T	Agaroz jel elektroforezi ve nbsp;
Parça Analiz Cihazı Otomatik CE Sistemi	Agilent		Paralel kılcal elektroforez
Parça DNA Merdiveni	Agilent	DNF-396, aralık 1-6000bp	Paralel kılcal elektroforez
GENTAMISİN SÜLFAT TUZU BİYOREAKTİF	Sigma-Aldrich	G1264-1G	Bakteri kültürü
Yüksek Hassasiyetli seyreltici işaretleyici	Agilent	DNF-373	Paralel kılcal damar elektroforez
Yüksek Hassasiyetli NGS kantitatif analiz kiti	Agilent	DNF-474	Paralel kılcal elektroforez
Merdiven hızlı yükleme 1 kb artı DNA merdiveni	NEB	N0469S	Agaroz jel elektroforezi ve nbsp;
LB Et Suyu, VegitoneNutriSelect Plus	Millipore	28713	Bakteri kültürü
Master Mix PCR Yüksek Sadakatli Pusion Flash	Thermo Fisher Scientific	F548L	PCR
Primerler	Eurogentec		PCR
Prosize veri analiz yazılımı v.4	Agilent	V.4	Paralel kapiler elektroforez
Kübit tahlilleri	Invitrogen	MAN0010876	DNA miktar tayini
Qubit dsDNA HS Test Kiti	YAŞAM TEKNOLOJİLERİ SAS	Q32854	DNA miktar tayini
Thermocycler	Eppendorf	Ep gradyanları	PCR
UVbox, eBOX VX5	Vilber Lourmat		Agaroz jel elektroforez görselleştirme
Enjekte edilebilir preparat için su	Aguettant	PROAMP	PCR