Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yaralı PC12 Hücrelerini Tedavi Etmek için İki Bitki Kombinasyonu Stratejisini Keşfetmek

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/64721

⸱

18 Kasım 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Chengdu Medical College

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitkinin bir kombinasyon stratejisini sağlar. Protokol, geleneksel Çin tıbbının (TCM) en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sağlar.

Özet

Serebral iskemi tedavisinde geleneksel Çin tıbbı (TCM) kombinasyonunun avantajları göz önüne alındığında, yaralı PC12 hücrelerini tedavi etmek için iki bitki kombinasyonu stratejisini araştırmak için preparat kombinasyonu ve bileşen kombinasyonu arasındaki etkinlik ve mekanizmadaki farklılıkları inceledik. PC12 hücrelerinin oksidatif hasarını indüklemek için glikozsuz bir ortam ile kombine edilmiş kobalt klorür (CoCl 2) kullanılmıştır. Daha sonra, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri ) enjeksiyonunun optimal kombinasyonu seçildi ve PC12 hücreleri üzerindeki güvenli ve etkili konsantrasyonları tarandıktan sonra tek tip tasarım yöntemlerini takiben birleştirildi. Ayrıca, taranan bileşen kombinasyonu iki bitkide 10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit içerir. Daha sonra, MTT, Annexin V-FITC / PI, immünofloresan ve Western blot analizi, preparat kombinasyonunun ve hasarlı PC12 hücreleri üzerindeki bileşen kombinasyonunun etkinliğini ve mekanizmasını değerlendirmek için kullanıldı. Sonuçlar, hücre pro-sağkalımı için en uygun preparat kombinasyonunun Ast enjeksiyonu ve 6: 1.8 (μM) konsantrasyonlu Eri kapsülü olduğunu göstermiştir. Bileşen kombinasyonu (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit) preparat kombinasyonundan daha etkiliydi. Her iki kombinasyon da apoptotik hızı, kaspaz-3'ün floresan yoğunluğunu ve hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) seviyesini önemli ölçüde azalttı; Bu arada, p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax ve Nrf2'nin ifade seviyelerini yükselttiler. Bu etkiler bileşen kombinasyonunda daha belirgindi. Sonuç olarak, her iki kombinasyon da PC12 hücrelerinde glikozsuz bir ortam ile birlikte CoCl2 tarafından indüklenen yaralanmayı inhibe edebilir ve böylece hücre sağkalımını teşvik edebilir. Bununla birlikte, bileşen kombinasyonunun preparat kombinasyonu üzerindeki etkinliği, oksidatif stres ve apoptoz ile ilgili PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolunun daha güçlü düzenlenmesinden kaynaklanıyor olabilir.

Giriş

Serebral hipoperfüzyonun neden olduğu kronik serebral iskemi, orta yaşlı ve yaşlı insanlarda sık görülen bir hastalıktır1. Uzun süreli gizli iskemi hastalığı olarak ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açabilir. Başlıca patolojik mekanizmalar arasında ilerleyici veya kalıcı nörolojik disfonksiyona yol açan hücre apoptozu ve oksidatif hasar; Alzheimer hastalığının, vasküler demansın ve diğer hastalıkların patolojik temelidir ve hastaların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkiler. Bununla birlikte, modern tıpta kronik serebral iskemiyi tedavi etmek için hala ideal ilaçların eksikliği vardır2. Aynı zamanda, Astragalus mongholicus (Ast) ve Erigeron breviscapus (Eri) kombinasyonu, geleneksel Çin tıbbının (TCM) klinik uygulamalarında yaygın olarak kullanılmaktadır4. Kombinasyon stratejisi, tek bir ilaçtan daha iyi olan serebral iskemi sonrası sinir fonksiyonunun iyileşmesini teşvik etmede önemli ölçüde gelişmiştir; Bununla birlikte, iki ilacın kombinasyonundaki dozaj oranında büyük farklılıklar vardır4. Etkili bileşenler ve etki mekanizması iyi tanımlanmamıştır, bu da klinik uygulamasını kısıtlayan temel konudur.

Önceki çalışmalar, sıçanlarda serebral iskeminin tedavisinde Ast enjeksiyonu ve Eri enjeksiyonunun hazırlık kombinasyonunun sinerjik etkisini göstermiştir. P-Akt proteininin ekspresyonunu yukarı düzenleyebilir ve B-lenfoblastoma 2 (Bcl-2) ailesi proteinlerinden biri olan ve apoptozu teşvik etme etkisine sahip olan Bcl-2 ilişkili ölüm promotörü (BAD) proteini 5,6'nın ekspresyonunu aşağı regüle edebilir. Bununla birlikte, sinerjik etkisinin maddi temeli ve mekanizması açık değildir. Ayrıca, PC12 hücrelerinin yaralanma modeli CoCl2 kombine glukozsuz ortam ile oluşturulmuş ve Ast ve Eri'deki optimal bileşen kombinasyonu taranmış ve tanımlanmıştır7.

Bu çalışmada, Ast ve Eri'nin etkili dozları, yaralı PC12 hücre modeli kullanılarak taranmıştır. İki ilacın optimal kombinasyonu, homojen tasarım yöntemi ile birlikte bu model kullanılarak taranır. Hücre modeli, yaralı PC12 hücrelerinde preparat kombinasyonunun ve bileşen kombinasyonunun etkileri ve mekanizmalarındaki farkı daha fazla değerlendirmek için kullanılır. Bu strateji, en iyi kombinasyon modunu belirlemek için PI3K / Akt / Nrf2 sinyal yolu aracılığıyla yaralı PC12 hücreleri üzerindeki iki tip kombinasyonun koruyucu etkisini ve düzenleyici mekanizmasını araştırmayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, TCM'nin en iyi uygulama modunu optimize etmek için bir referans sunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Reaktifin hazırlanması

  1. 125 mL'lik steril bir kültür şişesine 90 mL DMEM yüksek şekerli ortam, 10 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mL penisilin-streptomisin çözeltisi ekleyerek tam ortamı hazırlayın. Tüm ortamı karıştırın ve kapalı koşullar altında 4 ° C'de saklayın.
  2. 8,4 mM'lik birstok çözeltisi elde etmek için 10 mL DMEM şekersiz ortama (tamamen çözülmüş) 0,02 g CoCl 2 tozu (doğru tartılmış) ekleyerek CoCl2 çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm bakteri filtresiyle süzün, kapatın ve ışıktan 4 ° C'de saklayın.
    NOT: CoCl2 kararsızdır ve ışıktan korunan hava geçirmez bir kapta saklanmalıdır; CoCl2 çözeltisinin geçerlilik süresi 7 gündür.
  3. Tris-Hcl tamponlu tuz çözeltisi (TBST) hazırlayın.
    1. 8 g sodyum klorür, 0,2 g potasyum klorür ve 3 g Tris-baz tartın. Onları 1 L'lik bir beherin içine ekleyin ve ardından karışımı çözmek için 1.000 mL RO suyu ekleyin.
    2. PH'ı 7,4'e ayarlayın, 1 mL Ara 20 ekleyin ve TBST çözeltisini elde etmek için iyice karıştırın.
      NOT: Ara 20, antikorların antijenlere spesifik olmayan bağlanmasını azaltmak için bir yüzey aktif madde görevi görür ve% 0.1 konsantrasyonda en iyi şekilde çalışır.
  4. 5 mg / mL'lik bir stok çözeltisi elde etmek için 20 mL PBS çözeltisinde 0.1 g MTT tozu tartarak MTT (3-(4,5-Dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazolyum bromür tuzu) çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi 0,22 μm bakteri filtresiyle filtreleyin, kapatın ve bekleme moduna yerleştirilmiş olarak ışıktan 4 °C uzakta saklayın.
    NOT: MTT tozu kararsızdır ve nemi kolayca emer, bu nedenle ışıktan uzak kapalı ve kuru bir yerde saklanmalıdır. MTT çözümünün süresi 7 gün sonra dolar. MTT kanserojen bir etkiye sahiptir, bu nedenle ciltle doğrudan temastan kaçının.
  5. Eri kapsül çözeltisini, kapsül kabuğunu çıkararak ve 100 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için (skutelarin konsantrasyonuna dayanarak) 10 mL DMEM şekersiz ortamda 0.18 g içeriği doğru bir şekilde tartarak hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm bakteri filtresiyle süzün, kapatın ve 4 ° C'de hava geçirmez bir kapta saklayın.
    NOT: Scutellarin, Erigeron breviscapus'un ana aktif bileşenidir. Kapsüllerdeki scutellarin konsantrasyonu HPLC-UV tarafından 2.56 mg / g, yani 5.54 μmol / g8 olarak belirlenmiştir. Preparatın konsantrasyonu, scutellarin konsantrasyonuna göre hesaplanır. Bu, preparatın ve bileşenin farmakolojik aktivitesini değerlendirmek için uygundur.
  6. 60 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 15 mL'lik steril bir santrifüj tüpüne 5 mL enjeksiyon ve 5 mL şekersiz DMEM ortamı ekleyerek Ast enjeksiyonunun çözeltisini hazırlayın (astragalosid A konsantrasyonuna dayanarak). Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir bakteri filtresinden süzün ve 4 ° C'de hava geçirmez bir kapta saklayın.
    NOT: Enjeksiyon hacmi her biri 10 mL'dir ve enjeksiyondaki astragalosid A konsantrasyonu HPLC-ELSD tarafından 0.094 mg / mL (yani, 120 μM)9 olarak belirlenmiştir. Hazırlık bir biyogüvenlik kabininde yapılmalı ve boyunca ışığa dayanıklı bir şekilde çalıştırılmalıdır. Enjeksiyon çözeltisinin ve şekersiz ortamın hacmi doğru bir şekilde ölçülmeli ve iyice karıştırılmalıdır.
  7. Astragaloside A çözeltisini 7.85 mg astragaloside A standardını doğru bir şekilde tartarak ve 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 2 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde tamamen çözerek bir çözelti hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
    NOT: Astragaloside Bir toz, şekersiz ortamda çözünmez. Çözeltiyi hazırlarken, sitotoksisite olmadığından emin olmak için DMSO'nun son deneysel konsantrasyonunu% 0.1'in altında tutmak için uygun miktarda DMSO ile çözün.
  8. 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için 11.56 mg scutellarin standardını doğru bir şekilde tartarak ve 5 mL şekersiz DMEM ortamı ile tamamen çözerek scutellarin çözeltisini hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
  9. 5.000 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlamak için klorojenik asit çözeltisini 8.86 mg klorojenik asit standardını doğru ve tamamen tartarak 5 mL şekersiz DMEM ortamı ile tamamen çözündürerek hazırlayın. 0,22 μm bakteri filtresi ile filtreleyin ve 4 ° C'de hava geçirmez bir şekilde saklayın.
    NOT: Klorojenik asit tozu kararsızdır ve suyu kolayca emer. Mühürlenmeli ve ışıktan 4 ° C'de saklanmalıdır; tartım sırasında maruz kalma süresi en aza indirilmelidir.

2. Hücre canlılığı testi

  1. PC12 hücrelerini elde edin ve% 10 FBS, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültürleyin.
    NOT: Bu çalışmada, hücreler Çin Bilimler Akademisi'nden elde edilmiştir. PC12 hücreleri, nöroendokrin hücrelerin genel özelliklerine sahip olan ve nörofizyoloji ve nörofarmakolojide yaygın olarak kullanılan yapışkan hücrelerdir.
  2. Hücreleri% 5 CO 2 ile desteklenmiş bir inkübatörde 37 ° C'de kültürleyin ve her2-3 günde bir alt kültüre alın. Tüm deneyler için 4-8 pasajlarındaki hücreleri kullanın.
  3. Hücre kültürü
    1. Logaritmik büyüme fazındaki PC12 hücrelerini (% 70-% 80 hücre akıtı) 1 mL tripsin (% 0.25) ile tedavi edin ve hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. Hücreler yuvarlaklaştığında, tam ortamın 3 mL'sini ekleyerek tripsin sindirimini durdurun.
    2. Hücreleri steril bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın ve hücreleri 5 dakika boyunca 840 x g'de santrifüj edin. Süpernatanı atın, tam ortamla yeniden askıya alın ve hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ardından bir akış sitometresi kullanarak hücre sayısını sayın.
      1. Akış sitometrisi yazılımını başlatın, sayım ayarında hücre çözeltisinin karşılık gelen seyreltme katını seçin ve hücre örneğini 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünden yükledikten sonra Yoğunluk Grafiği'ne tıklayın.
      2. Hücre popülasyonunu X ekseni ve Y ekseninden uzağa daire içine alın, şeklin altındaki veri tablosunu sağ tıklatın ve X, Y, Count ve Abs Count'u seçin. Veri tablosundaki Abs Count altındaki veriler, hücre sayımı sonucunu verir.
    3. Hücre konsantrasyonunu 1 x 10 5 hücre / mL'ye ayarlayın, 96 delikli plakalarda 100 μL / kuyucuk aşılayın ve 24 saat boyunca bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de kültür yapın.
  4. Normal PC12 hücrelerinde iki ilacın güvenli konsantrasyonlarının taranması
    1. Hücreleri adım 2.1-2.2'de açıklandığı gibi kültürleyin. Süpernatanı atın ve normal hücreleri Ast enjeksiyonu (4, 8, 12, 16, 20 ve 24 μM) ve Eri kapsülünün (0.625, 1.25, 2.5, 5, 10 ve 20 μM) farklı son konsantrasyonlarıyla tedavi edin. Her grubun altı replikasyon kuyusunu 24 saat boyunca tedavi edin.
      NOT: İlaçlar, ilacın nihai konsantrasyonunu elde etmek için ortama eklenir (adım 2.4.1'de belirtilmiştir) ve daha sonra her bir kuyucuğa eşit miktarda ortam eklenir. Süper nantantı aspire ederken, kuyunun altındaki hücrelerle temas etmesini önlemek için pipet ucu kuyu duvarına hafifçe yerleştirilmelidir. Farklı çözeltiler eklerken, bunları kuyucukların kenarları boyunca nazikçe ve hızlı bir şekilde ekleyin ve deneysel sonuçları etkilememek için pipet tabancası kafasını değiştirirken dikkat edin.
    2. Süpernatanı atın, her bir oyuğa 120 μL MTT çözeltisi (1 mg / mL) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 4 saat boyunca inkübe edin.
    3. Kuluçkadan sonra, süpernatantı tekrar atın ve her bir kuyucuğa 150 μL DMSO ekleyin. Bir vorteks osilatör kullanarak plakayı 240 kez / dak hızında (dakikada yatay titreşim sayısı) 10 dakika boyunca sallayın.
    4. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak her numunenin emiciliğini 490 nm'de ölçün. Tedavi edilen grubun absorbansı / normal grubun absorbansı (kontrol) x 100 olan hücre canlılığını hesaplayın (%).
      NOT: MTT çözümünün geçerlilik süresi içinde olduğundan emin olun; renk değiştiyse (koyu yeşile), kullanılamaz. Hücrelerin emilimini test ederken, diğer reaktiflerin girişimini ortadan kaldırmak için boş bir kuyu (kültür ortamı ve MTT, hücre veya ilaç olmadan) ayarlanmalıdır. Her bir oyuğa 150 μL DMSO hacmi eklenir ve mavi-mor kristalleri daha iyi çözmek için 10 dakika çalkalanır. Sonuçların doğruluğunu sağlamak için absorbans mümkün olan en kısa sürede tespit edilmelidir.
  5. Yaralı PC12 hücreleri üzerinde iki ilacın etkili konsantrasyonlarının taranması
    1. Hücreleri 2.1-2.2 adımlarında belirtildiği gibi 24 saat boyunca kültürleyin, süpernatanı atın ve daha sonra hücreleri şekersiz ortamla birlikte 20 μL / CoCl2 (0.4 mM) kuyucuğu ile tedavi edin.
    2. Aynı anda hücreleri 100 μL / kuyucuk Ast enjeksiyonu (son konsantrasyonlar 2, 6, 8, 10 ve 12 μM) veya 100 μL Eri kapsülü (son konsantrasyonlar 1, 2, 3, 4 ve 5 μM) ile 37 ° C'de 24 saat daha tedavi edin. Kontrol grubuna 120 μL/kuyucuk dolusu komple ortam ekleyin.
      NOT: CoCl2 , hücrelerde hipoksik koşulları indükler.
    3. MTT yöntemiyle her numunenin emiciliğini ölçün ve daha önce adım 2.4.2 ve 2.4.3'te açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.
  6. Homojen tasarım yöntemine dayalı iki ilacın optimal kombinasyonunun taranması
    NOT: Astragalus enjeksiyonu ve breviscapus kapsülünün etkili konsantrasyon aralığı elde edildikten sonra, iki ilacın altı farklı kombinasyonunu elde etmek için tek tip tasarımyöntemi U 7 (74) tablosu kullanılmıştır. Ast enjeksiyonu: Eri kapsül: 1) 2: 2.6 μM, 2) 4: 5 μM, 3) 6: 1.8 μM, 4) 8: 4.2 μM, 5) 10: 1 μM ve 6) 12: 3.4 μM.
    1. Hücreleri yukarıda adım 2.3.1'de açıklandığı gibi kültürleyin ve yaralı PC12 hücrelerine yukarıda belirtildiği gibi Ast enjeksiyonunun altı orantılı konsantrasyonu: Eri kapsülü ile tedavi edin.
    2. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin ve daha önce 2.4.2 ve 2.4.3 numaralı adımlarda açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.
  7. İki optimal kombinasyonun yaralı PC12 hücreleri üzerindeki koruyucu etkisinin değerlendirilmesi
    NOT: Optimal preparat kombinasyonunu (Ast enjeksiyonu: 6:1.8 μM'lik Eri kapsülü) ve optimal bileşen kombinasyonu7'yi (10 μM astragaloside A, 40 μM scutellarin ve 75 μM klorojenik asit) elde ettikten sonra, yaralı PC12 hücreleri üzerindeki koruyucu etkilerini kontrol etmek için daha fazla değerlendirme yapılır.
    1. Hücreleri yukarıda adım 2.3.1'de açıklandığı gibi kültürleyin ve yaralı PC12 hücrelerini, yukarıdaki NOT'ta tartışıldığı gibi iki tip ilaç kombinasyonu ile tedavi edin.
    2. Hücreleri 24 saat boyunca tedavi edin ve daha önce 2.4.2 ve 2.4.3 numaralı adımlarda açıklandığı gibi hücre canlılığını hesaplayın.

3. Apoptoz oranı için Ek V-FITC/PI testi

  1. PC12 hücrelerini 12 delikli bir plakada 1.3 x 105 hücre/kuyu konsantrasyonunda tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C'de kültürleyin.
  2. Hücreleri gruplandırın: kontrol grubu, model grubu ve iki ilaç kombinasyonu. Kontrol grubuna 1,2 mL/kuyucuk dolusu tam ortam ekleyin, model grubuna 0,4 mM CoCl2 içeren 1,2 mL/kutucuk ortam ekleyin ve 0,4 mM CoCl 2 içeren iki kombinasyonun her birinin1,2 mL/kuyucuğu ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 24 saat daha inkübe edin.
  3. İlaç tedavisini takiben, hücreleri 250 μL / iyi tripsin ile tedavi edin, hücreleri 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 840 xg'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti bağlayıcı tamponun 500 μL'sinde yeniden askıya alın.
    1. RT'de 15 dakika boyunca karanlıktaki hücreleri 5 μL Ek V-FITC ve 10 μL propidium iyodür (PI) ile inkübe edin ve ardından akış sitometrisi ile apoptozu kontrol edin. Her grupta üç çoğaltma kuyusu ayarlayın.
      NOT: Bu testte kullanılan tripsin EDTA içeremez, çünkü EDTA, kalsiyum iyonlarını bağlamak için ek V ile rekabet eden ve PI için ek afinitesini etkileyen bir metal iyonu şelatlama ajanıdır. Apoptoz meydana geldiğinde, başlangıçta hücre zarının iç tarafında bulunan fosfoserin, hücre yüzeyine dışa doğru döner ve Annexin V-FITC, yeşil floresan göstermek için membranın dışındaki fosfoserine seçici olarak bağlanır.
    2. Başlat menüsünde Otomatik Ücretlendirme'ye tıklayın, Seç kanalında FITC, PE, PerCP ve APC'yi seçin ve Ücretlendirme: Yükseklik'i seçin. İstatistiksel Öğe: Medyan'da Tamam'ı tıklatın. Adım 2.3.2'de belirtilen aynı hücre sayma yöntemiyle, hücre örneklerini toplayın, Yoğunluk Haritası'nı tıklatın ve etkili hücre popülasyonunu daire içine alın.
    3. X ekseni parametresi olarak FITC floresan ve Y ekseni parametresi olarak diğer floresan parametreleri ile bir yoğunluk haritası oluşturun. Başlat menüsündeki Ücret Matrisi'ne ve taşma matrisindeki Katsayı'ya tıklayın. Apoptoz oranının analizi için yoğunluk haritası bilgileri görüntülenir.

4. Kaspaz-3 jenerasyonunun immünofloresan tespiti

  1. PC12 hücrelerini 8 x 104 hücre/kapak kayması yoğunluğunda kapaklara tohumlayın ve 24 saat boyunca 37 °C'de 24 delikli plakalara yerleştirin. Hücreleri yukarıda adım 3.2'de belirtildiği gibi gruplandırın; her grup için üç adet çoğaltılmış coverslip ayarlayın.
  2. İlaç tedavisini takiben, kapak kapaklarını her biri 5 dakika boyunca PBS (37 ° C) ile iki kez durulayın, 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve RT'de 20 dakika boyunca% 0.5 Triton X-100 ile geçirgenleştirin.
  3. Hücreleri tekrar durulayın ve RT'de 1 saat boyunca% 10 keçi serumu ile bloke edin.
  4. Her bir örtü kaymasını, 1x TBST'de 1:250 konsantrasyonda seyreltilmiş 200 μL primer antikor kaspaz-3 (apoptozun anahtar yürütücü proteini) ile inkübe edin, gece boyunca 4 ° C'de. 1x TBST ile yıkayın (her biri 3 dakika boyunca üç kez) ve karanlıkta RT'de 1 saat boyunca 200 μL ikincil antikor (1x TBST'de 1:300 seyreltme) ile inkübe edin.
    NOT: Floresan kolayca söndürülür; Bu nedenle, ikincil antikorun inkübasyonundan sonra, slaytlar ışıktan uzak tutulmalıdır. Birincil ve ikincil antikorlar ışıktan 4 °C uzakta saklanmalıdır.
  5. 10 dakika boyunca kapak kapaklarına (çekirdekleri tespit etmek için) 300 μL DAPI (0,5 μg / mL) ekleyin ve hücreleri her biri 5 dakika boyunca 1x TBST ile üç kez yıkayın.
  6. Floresan mikroskobun altındaki kapak kapaklarını gözlemleyin ve görüntüleri yakalayın10. Görüntüleme yazılımını kullanarak floresan yoğunluğunun istatistiksel analizini yapın.
    NOT: Kullanılan kızaklar ve kapak kapakları temiz ve steril olmalıdır. Boyama yaparken, boyama çözeltisinin pH'ına, konsantrasyonuna ve sıcaklığına dikkat edin ve floresan söndürme işleminden kaçının. Floresan mikroskop, cıva lambasını önceden ısıtmak için en az 15 dakika önceden açılmalı ve tekrar açılmadan önce 30 dakika boyunca kapatılmalıdır. Görüntü elde ederken, aynı boya aynı deney grubundaki pozlama parametreleri, sonuçların doğruluğunu sağlamak için tutarlı olmalıdır.

5. ROS seviyesinin immünofloresan testi

  1. Hücreleri adım 4.1'de tartışıldığı gibi kültürleyin ve tedavi edin.
  2. İlaç tedavisini takiben, her bir kapak kaymasını 3 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve 20 dakika boyunca 37 ° C'de 400 μL DCFH-DA (10 μM) ile inkübe edin.
    NOT: DCFH-DA, oksidatif stresin evrensel bir göstergesidir. Hücre zarı geçirgenliğine sahiptir ve floresan yoktur. Hücreye girdikten sonra, 2',7'-diklorodihidrofloresein (DCFH) üretmek için esteraz tarafından hidrolize edilir ve daha sonra güçlü bir floresan ürünü üretmek için hızla oksitlenir.
  3. Hücreleri serumsuz DMEM ile tekrar yıkayın (her biri 3 dakika boyunca iki kez) ve floresan söndürme maddesini floresan mikroskobu altına ekledikten sonra hemen kapak kaymasını gözlemleyin. Görüntüleme yazılımı ile göreceli floresan yoğunluğunu hesaplayın.
    NOT: DCFH-DA probunu yükledikten sonra, hücreye girmeyen artık probu temizlediğinizden emin olun, aksi takdirde arka plan yükselecektir.

6. Nrf2, p-Akt, Akt, Bcl-2 ve Bax 11,12'nin protein ekspresyonunun batı lekesi tespiti

  1. PC12 hücrelerini 6 delikli plakalarda 1 x 106 hücre / kuyu konsantrasyonunda ve kültürü 24 saat boyunca 37 ° C'de aşılayın. Hücreleri adım 4.1'de yukarıda belirtildiği gibi gruplandırın ve tedavi edin ve her grupta üç çoğaltma kuyusu ayarlayın.
  2. 24 saat boyunca ilaç tedavisinden sonra, hücreleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın ve hazırlanan lizis tamponunda 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Lizisten sonra, hücreleri 16.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları toplayın.
  3. Protein konsantrasyonunu tespit edin ve Bradford testi ile talimatlara göre ayarlayın. Numuneleri seyreltin ve 10 dakika boyunca 100 ° C'de denatüre edin.
    NOT: Lizis tamponu, fosfataz inhibitörü, proteaz inhibitörü ve RIPA lizatından 1:1:50 hacim oranında oluşur. Kontrol grubunda 200 μL/kuyucuk lizis tamponu, diğer gruplarda ise 100 μL/kuyucuk lizis tamponu gereklidir. Genel olarak, kontrol, model ve iki tip kombinasyon grubunun protein konsantrasyonları sırasıyla 0.45 mg / mL, 0.25 mg / mL ve 0.32-0.39 mg / mL'dir; yükleme tamponu ile seyreltildikten sonra protein konsantrasyonları sırasıyla 0.36, 0.2 ve 0.256-0.312 mg / mL'dir.
  4. Farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit etmek için, her şeride 25 μg protein yükleyin,% 12'lik bir SDS-PAGE elektroforezi çalıştırın ve jeli PVDF membranlarına aktarın.
    NOT: SDS jelin hazırlanması sırasında, kabarcıklar veya çözünmeyen parçacıklar olmadan tamamen karıştırılmalıdır; aksi takdirde düzensiz veya düzensiz bantlar oluşabilir. Membranları aktarırken, PVDF membranı ile jel arasında kabarcık olmadığından emin olun; aksi takdirde, şeritte beyaz lekeler görünecektir. Ek olarak, bu adım düşük sıcaklıklarda yapılmalı ve buz torbası her 30 dakikada bir değiştirilmelidir.
  5. RT'de 1.5 saat boyunca membranları %5 yağsız süt ile bloke edin ve karşılık gelen birincil antikorların 5 mL'si (Nrf2 1:1.000, Akt 1:2.000, p-Akt 1:2.000, Bcl-2 1:5.000 ve Bax 1:1.000) ile 4 °C'de 24 saat boyunca inkübe edin. İç kontrol olarak β-aktin (1:5.000) antikoru kullanın.
  6. Membranları TBST ile yıkayın (her biri 10 dakika boyunca üç kez), ardından RT'de 2 saat boyunca 5 mL ikincil HPR konjuge antikorları (1:5.000) ile inkübe edin.
    NOT: Antikorların seyreltme oranı keyfi olarak değiştirilmemeli ve membranlar, bandın arka plan renginin çok siyah olmasını önlemek için gereksinimlere tam olarak uygun olarak TBST ile yeterince yıkanmalıdır.
  7. Son olarak, membranı tekrar TBST ile yıkayın ve protein bandı tespiti için kemilüminesan HRP substratı (üreticinin talimatlarına göre) ile muamele edin. Kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleri yakalayın ve karşılaştırmalı iç kontrol olarak β-aktin ile görüntüleme yazılımını kullanarak proteinlerin gri değerlerini ölçün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ast enjeksiyonu ve Eri kapsülünün optimal kombinasyonunun taranması Şekil 1'de gösterilmiştir. Ast enjeksiyonu ve Eri kapsülünün normal PC12 hücreleri üzerindeki hücre sağkalım hızı Şekil 1A'da gösterilmiştir. Hücre canlılığı, 12 μM'den (Şekil 1A) daha yüksek konsantrasyonlarda Ast enjeksiyonu ve 5 μM'den büyük konsantrasyonlarda Eri kapsülü ile% 95'ten düşüktü (Şekil 1A), maksimum toksik olmayan konsan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Modern klinik pratikte serebral iskemi tedavisi için hala ideal ilaç eksikliği vardır2. Qi'nin takviyesi ve kan dolaşımı yönteminin aktive edilmesi rehberliğinde, Ast, Eri ve diğer preparatlar TCM'nin klinik uygulamasında kombinasyon halinde kullanılmış ve iyi kapsamlı avantajlar elde etmişlerdir13,14,15. Çok sayıda çalışma, Ast'ın kan-beyin bariyerinin geçirgenliğini artırabileceğini, serebral kan akışın...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu araştırma, Sichuan İl Bilim ve Teknoloji Departmanı'nın (2020YFS0325) kilit Ar-Ge projeleri tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1300 serisi sınıf II biyogüvenlik kabiniThermo Fisher Bilimsel Aletler Şirketi1374
3- (4,5-Dimetiltiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromürGuangzhou saiguo biyoteknoloji şirketi1334GR001MTT
ACEA NovoExpress ve nbsp; 1.4.0ACEA Biosciences,Inc-Akt
Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc10176-2-AP
Analitik akış sitometrisiThermo Fisher Scientific Instruments Company62-2-1810-1027-0
Annexin V-FITC apoptoz tespit kitiBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiC1062L
Astragalus enjeksiyonuHeilongjiang Zhenbao Ada İlaç ŞirketiA03190612144Ast enjeksiyonu
Astragaloside AChongqing Gao Ren Biyoteknoloji Şirketi84687-43-4
BaxWuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, Inc60267-1-Ig
BCA protein miktar tayin kitiBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP0012
Bcl-2Wuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, Inc26593-1-AP
Karbondioksit inkübatörleriThermo Fisher Scientific Instruments Company0816-2014
Kaspaz-3Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc19677-1-AP
Klorojenik asitChongqing Gao Ren Biyoteknoloji Şirketi327-97-9
Kobalt klorür heksahidratMerck Biotechnology, Inc.7791-13-1CoCl2
Dimetil sülfoksitGuangzhou saiguo biyoteknoloji şirketi2020112701DMSO
Disodyum hidrojen fosfat dodekahidratChengdu Kolon Kimya Şirketi2020090101
DMEM yüksek şekerli ortaTermo bilimsel Hyclone2110050
DMEM şekersiz ortamPekin Solarbio yaşam bilimleri şirketi
ECL ışıklı sıvıLianshuo Biyoloji ŞirketiWBKLS0500
Elektronik dengeHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Şangay, ÇinFA1204
Elektroforez cihazıBio-Rad Laboratuvarları (Şangay) Co., Ltd1658026
Erigeron breviscapus kapsülüYunnan Biogu İlaç ŞirketiZ53021671Eri kapsülü
Fetal sığır serumuDört Mevsim Biyoloji Mühendisliği Enstitüsü20210402FBS
Floresan mikroskobuOlympms ŞirketiIX71-F32PH
Jel görüntüleyiciBio-Rad Laboratuvarları (Şangay) Co., Ltd1708265
Keçi anti-fare ikincil antikoruWuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, IncSA00001-1
Keçi anti-tavşan ikincil antikoruWuhan Three Eagles Proteintech Group, IncSA00001- 2
IBM SPSS Statistics sürüm 26.0International Business Machines Corporation, USA-ImageJ
1.8.0National Institutes of Health, USA-görüntülemeyazılımı
Immunol  floresan & nbsp; boyama kitiBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP0196
KClChengdu Kolon Kimya Şirketi2021070901
MarkerThermo Fisher Bilimsel Aletler Şirketi26616
Mikroplaka okuyucuPerkin Elmer Kurumsal Yönetim (Şangay) Co.
Motic Ters mikroskopNanda Scientific Instruments Co.
NaClChengdu Kolon Kimya Şirketi2014081301
Yağsız sütBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP0216
Nrf2Wuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, Inc16396-1-AP
P-AktWuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, Inc66444-1-IG
PC12 hücreleriÇin Bilimler Akademisi
Penisilin-Streptomisin çözeltisiTermo bilimsel HycloneSV30010
Fosfataz proteaz inhibitörü karışımıBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP1045
Potasyum dihidrojen fosfatChengdu Kolon Kimya Şirketi2015082901
Reaktif oksijen türleri test kitiBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiS0033S
RI-PA lizis çözeltisiBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP0013B
ScutellarinChongqing Gao Ren Biyoteknoloji Şirketi27740-01-8
SDS-PAGE numune yükleme tamponu, 5xBeyotime Biyoteknoloji ŞirketiP0015L
Steril filtre uçları (0.22 ve mikro; m)Merck Biyoteknoloji A.Ş.
Tris-baseGuangzhou saiguo biyoteknoloji şirketi1115GR500 Tbs
Tween-20Chengdu
Vorteks osilatörüOHAUS International Co., Ltd., Şangay, ÇinVXMNAL
β-actinWuhan Üç Kartal Proteintech Grubu, Inc66009-1-IG
2029548HH35L2018296AE2000LEDCBP60430SLGP033RB J190013 Kolon Kimya Şirketi 2021051301

Kaynaklar

  1. Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
  2. Gao, L. Expert consensus on the diagnosis and treatment of chronic cerebral ischemia with integrated traditional Chinese and western medicine. Chinese Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 38 (10), 1161-1167 (2018).
  3. Luyu, S., Heng, L., Dengke, L. Combined treatment of 45 cases of cerebral infarction with Astragalus and Dengzhan Xixin injection. Jilin Journal of Traditional Chinese Medicine. 27 (4), 23-24 (2007).
  4. Bei, N., et al. Clinical study of Dengzhanxixin injection combined with Astragalus injection in the treatment of acute ischemic stroke. Journal of Basic Chinese Medicine. 21 (9), 1123-1127 (2015).
  5. Tian, F., et al. Optimal ratio of Astragalus injection combined with Dengzhan Xixin injection against cerebral ischemia-reperfusion injury in rats by baseline equal-ratio increase-decrease design method. China Pharmacy. 30 (14), 1885-1889 (2019).
  6. Li, J., et al. Protective effect and mechanism of Astragalus combined with Erigeron breviscapusin the best proportion on cerebral ischemia rats. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 35 (2), 104-108 (2019).
  7. Yan, Y., et al. Study on the oxidative damage of PC12 cells with hypoxia and hypoglycemia based on the combination of Astragalus and Dengzhan Asarum based on the Nrf2/HO-1 pathway. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (2), 159-164 (2022).
  8. Chinese Pharmacopoeia, Dengzhan Asarum Granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=f27dcefa69 924(2020).
  9. Chinese Pharmacopoeia, Astragalus granules. Volume I. , Available from: https://db.ouryao.com/yd2020/view.php?id=fbcd0a8bf8 1592(2020).
  10. Liu, X., et al. N-linoleyltyrosine protects PC12 cells against oxidative damage via autophagy: Possible involvement of CB1 receptor regulation. International Journal of Molecular Medicine. 46 (5), 1827-1837 (2020).
  11. Fan, Y., et al. Gab1 regulates SDF-1-induced progression via inhibition of apoptosis pathway induced by PI3K/AKT/Bcl-2/BAX pathway in human chondrosarcoma. Tumor Biology. 37 (1), 1141-1149 (2016).
  12. Meng, M., Zhang, L., Ai, D., Wu, H., Peng, W. β-Asarone ameliorates β-Amyloid-induced neurotoxicity in PC12 cells by activating P13K/Akt/Nrf2 signaling pathway. Frontiers in Pharmacology. 12, 659955(2021).
  13. Li, J., Chen, H. Advances in the treatment of chronic cerebral ischemia with traditional Chinese and western medicine. Xinjiang Journal of Traditional Chinese Medicine. 39 (3), 115-118 (2021).
  14. Yu, M., Zhan, Q., Xu, X. Discussion on the therapeutic value of traditional Chinese medicine on cognitive dysfunction caused by chronic cerebral ischemia. Chinese Medicine Modern Distance Education of China. 11 (19), 155-157 (2013).
  15. Wang, M., Liu, J., Yao, M., Ren, J. Advances in research on pharmacological and neuroprotective effects of traditional Chinese medicine after cerebral ischemia. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (3), 513-517 (2020).
  16. Wang, N., Sun, H., Ma, X. Effects of different doses of astragalus injection on neurological rehabilitation of stroke patients. Chinese Journal of Clinical Rational Drug Use. 9 (13), 67-69 (2016).
  17. Sun, Y. Q. Effects of astragalus injection on apoptosis after cerebral ischemia-reperfusion in rats. Hebei Medicine. 22 (7), 1147-1149 (2016).
  18. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapusameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988(2022).
  19. Liao, Y., Ni, X., Zhan, C., Cai, Y. Clinical research progress of Dengzhanhua preparation in prevention and treatment of ischemic stroke and transient ischemic attack. Guangdong Medical Journal. 41 (9), 963-967 (2020).
  20. Li, C., Li, J., Xu, G., Sun, H. Influence of chronic ethanol consumption on apoptosis and autophagy following transient focal cerebral ischemia in male mice. Scientific Reports. 10 (1), 6164(2020).
  21. El Khashab, I. H., Abdelsalam, R. M., Elbrairy, A. I., Attia, A. S. Chrysin attenuates global cerebral ischemic reperfusion injury via suppression of oxidative stress, inflammation and apoptosis. Biomedicine Pharmacotherapy. 112, 108619(2019).
  22. Su, X., He, S., Chen, Z., Xie, X. Effect of breviscapine aglycone on PI 3 K/Akt conduction pathway in neonatal rats with hypoxic-ischemic brain injury. Journal of Armed Police Logistics College (Medical Edition). 27 (2), 93-96 (2018).
  23. Wang, X., Shi, C., Pan, H., Meng, X., Ji, F. MicroRNA-22 exerts its neuroprotective and angiogenic functions via regulating PI3K/Akt signaling pathway in cerebral ischemia-reperfusion rats). Journal of Neural Transmission. 127 (1), 35-44 (2020).
  24. Luca, M., Luca, A., Calandra, C. The role of oxidative damage in the pathogenesis and progression of alzheimer's disease and vascular dementia. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 504678(2015).
  25. Wang, Z., et al. Lupeol alleviates cerebral ischemia-reperfusion injury in correlation with modulation of PI3K/Akt pathway. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 16 (8), 1381-1390 (2020).
  26. Li, H., et al. Neuroprotective effect of phosphocreatine on oxidative stress and mitochondrial dysfunction induced apoptosis in vitro and in vivo: Involvement of dual PI3K/Akt and Nrf2/HO-1 pathways. Free Radical Biology and Medicine. 120, 228-238 (2018).
  27. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. Journal of Applied Toxicology. 39 (4), 556-570 (2019).
  28. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912 (10), 174617(2021).
  29. Yin, L., et al. Neuroprotective potency of Tofu bio-processed using Actinomucor elegans against hypoxic injury induced by cobalt chloride in PC12 cells. Molecules. 26 (10), 2983(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Oksidatif HasarAstragalus MongholicusErigeron BreviscapusBile en KombinasyonuAk SitometrisiWestern BlotApoptoz AnaliziPI3K Akt Nrf2 Yola
Yaralı PC12 Hücrelerini Tedavi Etmek için İki Bitki Kombinasyonu Stratejisini Keşfetmek
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.