Serbestçe hareket eden farelerde basit sürekli glikoz izleme

Diabetes mellitus (DM), yüksek kan şekeri düzeyleri ile karakterize yıkıcı bir hastalıktır. Tip 1 DM, pankreastaki insülin üreten beta hücrelerine otoimmün bir saldırının bir sonucu olabilir. Öte yandan, Tip 2 DM ve gestasyonel DM, beta hücrelerinin glukoz^{seviyelerindeki} 1 artışa yanıt olarak yeterli insülin salgılamaması ile karakterizedir. Fare, benzer fizyolojiye sahip olduğu için DM'yi incelemek için kullanılan yaygın bir model organizmadır ve normal glikoz seviyeleri insanlarınkine yakındır. Ayrıca, spesifik fare suşları, anahtar sinyal yolaklarındaki mutasyonlar nedeniyle veya hastalık modellemesini mümkün kılan spesifik diyetlere maruz kaldıktan sonra DM geliştirebilir ^2,3,4.

Kan şekeri genellikle farelerde, fare kuyruğunun ucundan küçük bir damla kan (1-2 μL) çıkarılarak hastalar için tasarlanmış glukometreler kullanılarak ölçülür. Bu yöntem strese neden olur ve glikoz seviyelerini etkileyen ve serbestçe davranan farelerde veya araştırmacı^5'e yakın olmadığında kan şekeri seviyelerinin ölçülmesini yasaklayan farenin kullanılmasını gerektirir. Farelerin kanaması, yakındaki farelerde, özellikle de glisemisi henüz ölçülmemiş aynı kafesteki farelerde strese neden olabilir ve böylece sonuçları etkileyebilir. Fareler, işleyiciye bağlı olarak farklı tepki verir ve glikozu ölçen kişi, farelerin glikoz seviyelerini etkileyebilir. Bu tuzaklar dikkatli deneysel tasarım gerektirir ve deneyler arasındaki bazı tutarsızlıkların altında yatmaktadır.

Kanama olmadan serbestçe hareket eden farelerde glikozu, son teknoloji ürünü telemetri⁶ kullanarak farelerin aort arkına glikoz sensörleri implante ederek ölçmek mümkündür. Elde edilen ölçümler çok iyidir ve uzun bir süre boyunca sürdürülebilir, ancak bu sensörleri implante etmek zordur ve telemetri sistemi pahalıdır, bu da bu metodolojinin ılımlı bir şekilde benimsenmesine ve uzman olmayan laboratuvarlarda benimsenmemesine neden olur. Farelerin boyutlarına ve fizyolojilerine göre uyarlanmış deri altı veya diğer glikoz sensörleri son yıllarda geliştirilmiştir, ancak bunlar yine çok yetenekli uzmanlar gerektirir ve bazı durumlarda^maliyetli 6,7,8,9,10'dur.

Başlangıçta DM hastalarının glikoz seviyelerini izlemek için geliştirilen ticari sürekli glikoz monitörleri (CGM'ler), implante edilmiş problardan daha düşük maliyet ve teknik uzmanlık gereksinimleri ile serbestçe hareket eden farelerde glikozu ölçmek için başka bir seçenek sunar. Bu tür sondalar, bu protokolü kullanan meslektaşlarımız da dahil olmak üzere 5,11,12,13,14,15 numaralı birkaç laboratuvar tarafından temel araştırmalarda kullanılmıştır ¹⁶. Bu cihazlar tipik olarak bir sensör, bir montaj cihazı, bir alıcı ve bir yazılım uygulaması içerir. Sensör, enzimatik glukosensörü yönlendiren bir kanüle, yapışkan banda, bir enerji kaynağına, kısa süreli belleğe ve verileri depolayan ve alıcıya gönderen bir kablosuz iletişim modülüne sahiptir. Alıcı mevcut glikoz seviyelerini gösterebilir ve verileri bir sunucuya gönderebilir; Bu alıcı bir cep telefonu olabilir. Yazılım uygulaması, hasta ve tıbbi bakım ekibi için hastanın glisemisi hakkında veri sağlar. Hastalarda, sensör montaj cihazı kullanılarak kolayca takılır. Kanül, montaj cihazı cilde bastırılarak deri altına yerleştirilir ve sensör yapışkan bant yardımıyla yerinde kalır.

Bu, farelerde glikoz seviyelerini ölçmek için ticari bir CGM cihazını uyarlamak için ayrıntılı bir protokoldür. Bu protokol, glikoz sensörünün cerrahi olarak nasıl yerleştirileceğini ve fareye nasıl takılacağını açıklar. Temel veri analizi ve veri görselleştirme için komut dosyaları sağlanır. Olası tuzaklar, sorun giderme ve standart sonuç örnekleri verilmiştir. Aşağıdaki protokol belirli bir CGM için spesifiktir, ancak kullanıma sunuldukça diğer ticari CGM türlerine kolayca uyarlanabilir.

Deneyler, İbrani Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

NOT: Tüm aletler sterilize edilmeli ve kanülün taşınması steril bir teknik kullanılarak yapılmalıdır. Aşağıdaki protokol belirli bir CGM'ye göre ince ayarlıdır. Protokol diğer CGM'lere uyarlanabilir.

1. İşlemden önce analjezik uygulama

1. Deri altından 5 mg / kg vücut ağırlığında meloksikam ile% 5 dekstroz ve% 0.45 salin uygulayın.

2. Anestezi uygulaması

1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve kapağı sıkıca kapatın. İndüksiyon odasındaki anestezi indüksiyonunu 500 mL/dak akış hızında %3 izofluran olarak ayarlayın.
2. Fare yanıt vermediğinde, fareyi odadan çıkarın ve burun konisini fareye takın. Anestezi seviyesini interdigital bir tutam ile onaylayın. 30 g ağırlığındaki bir farede konsantrasyonu %1-%1,5 izofluran ve akış hızını 100 mL/dak olarak ayarlayın.
3. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.

3. Sensör hazırlama

1. Sensörün bandını ve kanül tarafını ortaya çıkarmak için sensörü sensör montaj cihazına monte edin (Şekil 1A). İğne kanülün içine sokulduğundan ve açığa çıktığından dikkatli olun.
2. Kanülün her iki tarafındaki banda iki adet 5-0 konik nokta dikiş dikin (Şekil 1A).

4. Epilasyon ve dezenfeksiyon

1. Farenin arka kısmının orta çizgisinde yaklaşık 4 cm x 4 cm'lik bir alanı tıraş edin.
2. Tamamen epilasyon sağlamak için tıraş edilen bölgeye tüy dökücü bir krem uygulayın.
3. Cildi silin ve% 2 klorheksidin glukonat ve% 70 izopropil alkol içeren antiseptik bir çözelti kullanarak dezenfekte edin.

5. Dorsal cilt hazırlığı

1. Tıraş edilen bölgenin ortasında, omurganın üstünde, keskin makas kullanarak 2 mm'lik bir kesi yapın (Şekil 1B).
2. Kısaca, küçük bir deri altı cebi oluşturmak için derinin altına künt kenarlı küçük forseps yerleştirin, böylece kanül deri altı cebe kolayca yerleştirilebilir (Şekil 1B).
3. Adım 3.2'den itibaren bir sütürü insizyonun her iki tarafındaki deriden geçirin (Şekil 1C).

6. Sensör yerleştirme

1. Sensörü sensör montaj cihazından tamamen çıkarın (kanül iğneden boştur) ve çevreleyen bandın kendisine yapışmasını önlemek için sensörü forseps ile tutun.
2. Kanülü dikkatlice deri altı cebine yerleştirin.
3. Dikişleri her iki tarafa da çekin ve sensörü sıkıca yerine oturtmak için sıkın ve bağlayın, böylece yapışkan bant zamanla gevşediğinde kanülün deri altı cebinden kaymasını önleyin.

7. Sensör bağlantısı ve dikiş

1. İç dikişleri bağlayarak ve sensörü çevreleyen yapışkan bandı kullanarak sensörü arkaya sıkıca takın.
2. Sensörün etrafında sekiz adet süreksiz dikiş yaparak sensör bandının kenarlığını cilde yapıştırın (Şekil 1D).

8. Okuyucunun etkinleştirilmesi

1. Sensör takıldıktan sonra, okuyucuyu açarak, Yeni Sensör Başlat'a basarak ve sensörü üreticinin talimatlarına göre kaydırarak okuyucuyu etkinleştirin.
2. İlk okuma, CGM'yi kurduktan sonra sadece birkaç dakika alınabilir. Bu CGM durumunda, ilk okuma 60 dakika sonra alınabilir.

9. Sonuçları okuma

1. Okuyucuyu farenin yakınına yerleştirin (dokunmaya gerek yoktur). Sensörde depolanan tüm veriler okuyucuya iletilir.
   NOT: Farklı CGM cihazları, geçmiş veri tasarrufu kapasitesi döneminde farklılık gösterebilir. Bu CGM durumunda, iki okuma arasında maksimum 8 saat saklanabilir.

10. Sensörün çıkarılması

1. Fareyi uyuşturun (bkz. bölüm 2).
2. Sensörü farenin arkasına bağlayan dikişleri keskin makas kullanarak kesin.
3. Sensörü nazikçe çıkararak kesideki dikişleri çıkarın ve kesin.
4. Gerekirse, farenin arkasındaki kesiyi kapatmak için tek bir dikiş kullanın.

11. Veri analizi

1. Veri indirme: CGM üreticisi tarafından sağlanan talimatlara göre verileri indirin.
   NOT: Her CGM'nin, kullanıcı tarafından kolayca erişilebilen veya erişilemeyen farklı bir biçimi vardır. Bu, CGM'nin seçiminde önemli bir husustur.
2. Sağlanan yazılımla analiz için, verileri Github'daki (https://github.com/mika-littor/CGM-in-Mice-Analysis.git) benioku dosyasındaki talimatlara göre biçimlendirin.

Şekil 1: Sensörün fareye bağlanması . (A) Kırmızı oklarla işaretlenmiş iki dikiş, CGM sensörünün alt tarafındaki kanülün her iki tarafındaki sensör bandından beyaz bir okla işaretlenmiş olarak geçirilir. (B) Omurga boyunca tıraş edilen alanın merkezinde keskin makas kullanılarak 2 mm'lik küçük bir kesi yapılır. Künt kenarlı küçük forsepsler, küçük bir deri altı cep oluşturmak için cildin altına kısaca yerleştirilir, böylece kanül deri altına yerleştirilebilir. (C) A'dan aynı dikişler insizyonun her iki tarafında deri altından geçirilir. Kırmızı oklar sensöre tutturulmuş dikişleri A'da olduğu gibi işaretler, mavi oklar dikişlerin farenin arkasındaki cilde geçtiği yeri işaretler ve siyah ok kesiyi gösterir. (D) Kanül yerleştirildikten sonra, iç dikişler sıkılır ve CGM'yi sabitlemek için insizyona yakın bir yere bağlanır. Sensör daha sonra cilde dikilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Cerrahi sonuç
18 hafta boyunca yüksek yağlı yüksek sakkaroz diyeti (HFHS) ile beslenen sekiz HSD: ICR faresinden (8 haftalık) ve beş yağsız HSD: ICR faresinden (12 haftalık) elde edilen sonuçlar gösterilmiştir. Kullandığımız cihaz 8 saate kadar veri saklıyor. Yerel hayvan tesisine erişim 07:00-19:00 ile sınırlandırıldı, böylece farelerin aktif olduğu geç saatlerde veri toplanması yasaklandı. Bu nedenle fareler, cerrahi işlemden 7 gün önce, 8: 30 ile 20: 30 arasında karanlık saatlerle ters aydınlatmalı bir odaya yerleştirildi. Bu, tüm cihazlar veya hayvan tesisleri için gerekli değildir ve 12 saatten fazla bilgi depolayabilen cihazlar kullanmanızı öneririz.

Ameliyat sonrası mortalite görülmedi. Ameliyat, deney sırasında yaklaşık% 10'luk bir kilo kaybına yol açtı (Şekil 2A). Bu nedenle ameliyattan sonraki ilk birkaç gün içinde, kilo kaybı sırasında alınan ölçümler dikkatle yorumlanmalıdır. Kilo kaybı, farelerin yiyecek ve suya ulaşamamasından kaynaklanmıyordu. CGM ölçümleri ile kuyruk ucu kan şekeri ölçümlerinin karşılaştırılması, açlık ve açlık tutmama durumlarında iyi bir uyum göstermiştir (Şekil 2B). CGM ortalama 11 gün boyunca aktifti (Şekil 2C). Bu tür cihazlar için maksimum gün sayısı 14 gündür. Cihaz daha önce devre dışı kaldığında, CGM'nin düşmesinden kaynaklanmıyordu.

Şekil 2: CGM'nin uygulanmasının genel sonuçları . (A) CGM'nin aktif olduğu süre boyunca ortalama ağırlık azalması. n = 8 fare. (B) El tipi glukometre ve CGM cihazı tarafından yapılan glikoz okumaları arasındaki ortalama fark. Aradaki fark 0 mg/dL'den anlamlı olarak farklı değildi. n = altı farede 10 okuma. (C) CGM'nin n = 8 farelerde aktif olduğu ortalama süre. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ham çıktı
Tek bir günün glikoz seviyeleri, CGM yazılımı tarafından üretilen bir grafikte gösterilmektedir (Şekil 3A). Birkaç güne ait veriler sağlanan kod kullanılarak görüntülenebilir (Şekil 3B). Netlik için 3 güne ait verileri gösteririz.

Şekil 3: Veri analizi . (A) Ticari çıktı. Veriler 18:00 ile gece yarısı arasında toplanmamıştır. Gölgeli alan 70-100 mg/dL arasında olan hastalarda normoglisemi değerleri gösterir. (B) Sağlanan kodu kullanarak tek bir fareden 3 günlük ham çıktı verileri. A ve B arasındaki y eksenindeki ölçek farkına dikkat edin. Eksen parametreleri ve diğer tüm parametreler kodda modüle edilebilir. Netlik için 3 günlük veriler gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Analiz
Veriler çıkarıldıktan sonra, sağlanan kod veya başka bir özel yapım yazılım kullanılarak analiz yapılabilir. Aşağıda, tek bir fare için her zaman noktasındaki ortalama (Şekil 4A, C) ve medyan (Şekil 4B, D) glikoz seviyeleri verilmiştir. Grafiği düzeltmek için sürgülü bir pencere kullanılabilir. Netlik için sadece iki fare gösterilmiştir.

Şekil 4: Sağlanan komut dosyalarını kullanarak veri analizi çıktısı . (A) Ortalama ve (B) belirli bir faredeki her zaman noktasındaki medyan glikoz seviyeleri. Gölgeli alan, glikoz seviyelerindeki standart sapmayı gösterir. (C) İki fareden ortalama ve (D) medyan glikoz seviyeleri. Netlik için sadece iki fare gösterilmiştir. Kesikli bir çizgi, ışıktan (20:30-08:30) karanlığa (8:30-20:30) geçişi gösterir. Eğriyi düzeltmek için 20 dakikalık sürgülü bir pencere kullanıldı. Pencerenin boyutu ve tüm parametreler kodda değiştirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.