Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi

1.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64749

⸱

10 Şubat 2023

1Department of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Osaka University Graduate School of Dentistry

Bu makalede

Özet

Bu protokol, nöral krest hücrelerinin hyaluronan bakımından zengin hücre dışı matrise in vivo göçünde rol oynayan moleküllerin fonksiyonel analizi için uygun bir in vitro migrasyon deneyini özetlemektedir.

Özet

Nöral krest hücreleri (NCC'ler), nöral tüpün dorsal bölgesinden kaynaklanan yüksek oranda göçmen hücrelerdir. NCC'lerin nöral tüpten göçü, NCC üretimi ve ardından hedef bölgelere doğru göçleri için önemli bir süreçtir. Çevreleyen nöral tüp dokuları da dahil olmak üzere NCC'lerin göç yolu, hyaluronan (HA) bakımından zengin hücre dışı matriksi içerir. Bu çalışmada, nöral tüpten HA bakımından zengin bu çevre dokulara NCC migrasyonunu modellemek için, HA (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) ve kollajen tip I'den (Col1) oluşan karışık bir substrat migrasyon testi yapılmıştır. Bu migrasyon testi, NCC hücre hattının, O9-1 hücrelerinin, karışık substrat üzerinde yüksek oranda göçmen olduğunu ve HA kaplamasının göç sırasında fokal adezyonlar bölgesinde bozulduğunu göstermektedir. Bu in vitro model, NCC göçünde yer alan mekanik temelin daha fazla araştırılması için yararlı olabilir. Bu protokol, NCC göçünü incelemek için farklı substratları iskele olarak değerlendirmek için de geçerlidir.

Giriş

Nöral krest hücreleri (NCC'ler), gelişmekte olan embriyolarda bulunan multipotent bir hücre popülasyonudur ve nörülasyon sırasında nöral plak sınırından köken alırlar. Periferik sinir sistemi, kardiyovasküler sistem, kraniyofasiyal dokular ve iskelet1 dahil olmak üzere çeşitli dokuların oluşumuna katkıda bulunurlar. Nöral plak sınırında indüksiyon ve NCC spesifikasyonundan sonra, NCC'ler nöroepitelden göç eder ve NCC kaynaklı doku bölgelerine doğru göç eder1.

Hyaluronan (HA), hücre dışı matriksin (ECM) bir bileşeni olarak çeşitli dokulara dağılmış sülfatlanmamış bir glikozaminoglikandır. HA'nın embriyo gelişimindeki önemi, hyaluronan metabolizmasından sorumlu genlerin ablasyonu yoluyla model sistemlerde gösterilmiştir. Örneğin, Xenopus'taki hyaluronan sentaz genlerindeki (Has1 ve Has2) mutasyonların NCC migrasyon kusurlarına ve kraniyofasiyal malformasyon2'ye yol açtığı bulunmuştur. Ek olarak, HA bağlayıcı proteoglikanlar, agrekan ve versikanın, NCC migrasyonu3 üzerinde inhibitör etkiler gösterdiği bildirilmiştir. Farelerde, Has2 ablasyonu endokardiyal yastık oluşumunda ciddi kusurlara yol açarak gebeliğin ortasında (E9.5-10) öldürücülük 4,5,6 ile sonuçlanır.

Bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan transmembran protein 2'nin (Tmem2), yakın zamanda, yapışma bölgelerinde matriksle ilişkili HA'yı çıkararak integrin aracılı kanser hücresi yapışmasını ve göçünü teşvik etmede kritik bir rol oynadığı gösterilmiştir 7,8. Daha yakın zamanlarda, Inubushi ve ark.9, Tmem2'deki bir eksikliğin, NCC göçü / göçü ve sağkalımındaki anormallikler nedeniyle ciddi kraniyofasiyal defektlere yol açtığını göstermiştir. Önceki çalışmada9, NCC oluşumu ve migrasyonu sırasında Tmem2 ekspresyonu analiz edilmiştir. Tmem2 ekspresyonu, NCC delaminasyon bölgesinde ve Sox9-pozitif NCC'lerin göç etmesinde gözlendi (Şekil 1). Ek olarak, Tmem2-tükenmiş fare O9-1 nöral krest hücrelerini kullanarak, çalışma, Tmem2'nin in vitro ekspresyonunun, O9-1 hücrelerinin fokal adezyonlar oluşturması ve HA içeren substratlara göçleri için gerekli olduğunu göstermiştir (Şekil 2 ve Şekil 3)9.

Bu sonuçlar, Tmem2'nin NCC yapışması ve HA bakımından zengin ECM yoluyla migrasyon için de önemli olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir. Bununla birlikte, HA bakımından zengin ECM içindeki NCC yapışması ve göçünün moleküler mekanizması hala belirsizdir. Bu nedenle, HA bakımından zengin ECM içinde NCC yapışmasını ve göçünü tam olarak araştırmak için bir in vitro kültür deneysel sistemi kurmak gereklidir.

Hücre göçünü test etmede kullanılan sayısız yaklaşımdan, hücre yarası kapatma temelli tahlil, fizyoloji ve onkoloji alanlarında sıklıkla kullanılan basit bir yöntemdir10. Bu yaklaşım, in vivo fenotiple ilgisi nedeniyle yararlıdır ve hücre göçü sırasında ilaçların ve kemoattractanların rollerinin belirlenmesinde etkilidir11. Hem tüm hücre kütlelerinin hem de tek tek hücrelerin migrasyon kabiliyetini, zaman içindeki hücre boşluk mesafelerini ölçerek değerlendirmek mümkündür11. Bu makalede, nöral tüpü çevreleyen HA bakımından zengin dokulara NCC migrasyonunu modellemek için modifiye edilmiş in vitro yara kapatma temelli bir tahlil tanıtılmıştır. Bu prosedür, ECM iskelesinin NCC göçündeki rolünü analiz etmek için farklı ECM bileşenlerini (yani, kollajenler, fibronektin ve laminin) incelemek için de geçerlidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm prosedürler Osaka Üniversitesi Diş Hekimliği Enstitüsü Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. Fare kranial nöral krest hücrelerinin kültürü

NOT: Bu çalışmada kullanılan nöral krest hücre hattı, başlangıçta Wnt1-Cre'den türetilen O9-1 hücrelerini içerir; E8.5 fare embriyolarından izole edilen R26R-GFP eksprese eden hücreler12 (tartışmaya bakınız). O9-1 hücrelerini kültürlemek için burada açıklanan yöntem, daha önce belirlenmiş bir protokol13'ü izler.

  1. Bazal membran matris kaplı plakayı hazırlayın.
    1. Bazal membran matrisini (bakınız Malzeme Tablosu) buz üzerinde çözün. Matrisi 1:50 soğutulmuş 1x PBS ile seyreltin ve buzda tutun.
    2. 10 cm'lik bir kültür plakasını 10 mL seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi ile kaplayın. Plakayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve kullanmadan önce matrisi aspire edin.
    3. Plakayı 2 mL PBS ile 3x yıkayın.
  2. Kültür O9-1 hücreleri bazal membran matris kaplı plaka üzerinde.
    1. Tüm embriyonik kök (ES) hücre ortamını (bakınız Malzeme Tablosu) 37 ° C'de bir su banyosunda ısıtın.
    2. O9-1 hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayısını sayın (bkz. Tam ES hücre ortamı ile hücre konsantrasyonunu 1.1 × 106 / mL'ye ayarlayın.
    3. Matris kaplı 10 cm'lik kültür plakasına 8 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve O9-1 hücrelerini 1.1 x 106 hücre / plakada tohumlayın. %5 CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 °C'de inkübe edin.
    4. Ertesi gün, ortamı taze tam ES hücre ortamı ile değiştirin (önceden 37 ° C'ye ısıtılmış). Bundan sonra her 2-3 günde bir taze ortamla değiştirin.
      NOT: Hücreler yaklaşık% 80 akışkan olduğunda (kaplamadan 3-4 gün sonra), % 0.25 tripsin-EDTA ile ayrıştırılabilir ve daha sonra kullanılmak üzere daha fazla geçirilebilir veya dondurulabilir. O9-1 hücrelerinin temsili görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir.
    5. Tripsinizasyondan önce kültür plakasını 2 mL 1x PBS ile yıkayın. 2 mL önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Tam hücre ayrılmasını kontrol edin; gerekirse plakanın yan tarafına birkaç kez hafifçe dokunun.
    6. Kültür plakasına 2 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve ayrışmış hücreleri 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Tüpü 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
    7. Hücre topağını rahatsız etmeden süpernatantı atın. Ardından, tüpe 2 mL önceden ısıtılmış tam ES hücre ortamı ekleyin ve pipetleme ile hücreleri iyice askıya alın. Hücreleri istenen hücre yoğunluğunda yeni bir kültür plakasına tohumlayın.
    8. Alternatif olarak, tam ES hücre ortamı yerine tüpe %10 dimetil sülfoksit (DMSO) içeren 1 mL hücre dondurma ortamı ekleyerek ve hücreleri iyice askıya alarak dondurulmuş bir hücre stoğu hazırlayın. Hücre süspansiyonunu kriyo tüplerine aktarın ve -80 ° C'de saklayın.

2. HA/Col1 kaplı tabağın hazırlanması

NOT: HA / Col1'i cam tabanlı tabaklara kaplamanın orijinal yöntemi Irie ve ark.7 tarafından önerilmiştir.

  1. 3,5 cm'lik cam tabanlı bir kaba dikkatlice 50 μL seyreltilmemiş trietoksisilan ekleyin ( bkz. Oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin ve ışıktan koruyun.
    NOT: Trietoksisilan ile inkübasyon 5 dakikayı geçmemelidir. Bu, kaplama verimliliğini etkileyebilir ve istenmeyen ürünler üretebilir.
  2. Kabı 2 mL damıtılmış su ile 3 kat hızlı bir şekilde yıkayın. Çanak başına PBS'de 100x seyreltilmiş 50 μL% 0.25 glutaraldehit ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  3. 2 mL PBS ile hızlı bir şekilde 4 kat yıkayın. Daha sonra, bulaşıkları RT'de 1 saat boyunca 0.2 N asetik asit içinde 300 μL kollajen tip I ile kaplayın.
  4. 2 mL PBS ile 3 kat hızlı bir şekilde yıkayın. Her bir yemeğe 300 μL 200 μg / mL floresenamin etiketli sodyum hyaluronat-H2 (FAHA-H2) (PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve RT'de gece boyunca inkübe edin. PBS'yi aspire ettikten sonra, plakayı temiz bir tezgahta 5 dakika boyunca hava ile kurutun.
    NOT: FAHA-H2, ortalama moleküler ağırlığı 1.200-1.600 KDa arasında değişen floreseinamin etiketli bir sodyum hyaluronattır. Araştırma tasarımına göre uygun bir moleküler ağırlıkta HA kullanılabilir.

3. HA/Col1 kaplı çanak üzerinde migrasyon testi

NOT: Col1/HA substratlarında tanımlanmış 500 μm hücresiz boşluklar kullanılarak yara kapatma bazlı bir tahlil, 2 kuyucuklu kültür ekleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bkz. O9-1 hücreleri, HA'nın hücredışı boşlukta yapışması ve bozulması için gerekli olan Tmem2'yi eksprese eder 9 (Şekil 2 ve Şekil 3).

  1. Kaplanmış cam tabanlı kabı kuruttuktan sonra, 2 kuyucuklu kültür eklerini bulaşıklara takın ve uçları harici olarak 1 mL PBS ile doldurun.
  2. O9-1 hücrelerini, uç başına %2 fetal sığır serumu (FBS) içeren 100 μL Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyeri (DMEM) içindeki 1 x 104 hücredeki kuyucuklara tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'de 2 gün boyunca% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde kültürleyin.
  3. Uçları cımbızla kaplanmış cam tabanlı tabaklardan dikkatlice çıkarın. Hücreleri ve hücre kalıntılarını temizlemek için kaplanmış cam tabanlı bulaşıkları 2 mL 1x PBS ile nazikçe yıkayın. Kültür yemeklerine %2 FBS içeren 2 mL taze DMEM ekleyin.
  4. Yüksek çözünürlüklü ayarlara sahip tek renkli modda hepsi bir arada floresan mikroskobu kullanarak şimdi başlangıç zamanı noktası olarak faz kontrastlı görüntüler yakalayın (6 dB'de kazanç, gruplama yok). Bu çalışmada görüntüleme için 4x ila 20x büyütmeli objektif lensler kullanılmıştır (bakınız Malzeme Tablosu).
    NOT: Faz kontrastlı görüntüleri karşılık gelen ölçek çubuklarıyla yakalayın ve TIFF biçiminde kaydedin.
  5. Hücreleri 37 ° C'de ve% 5 CO2'de ek bir 48 saat boyunca kültürleyin. Hepsi bir arada floresan mikroskobunu kullanarak kültürde 24 saat ve 48 saatte faz kontrastlı görüntüler yakalayın.
  6. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca veya gece boyunca 4 ° C'de 1 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile 48 saatte sabitleyin. Ardından, bulaşıkları her biri 1 mL taze PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  7. Daha fazla morfolojik gözlem için montaj ortamına sahip bir kapak fişi yerleştirin (bkz.
    NOT: Tabaklar hemen görüntülenebilir veya 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.
  8. İsteğe bağlı: İlgilenilen proteinler için hücreleri immüno-etiketleyin.
    NOT: Fare kaynaklı monoklonal anti-vinkülin antikoru kullanarak fokal adezyon (FA) kompleksini tespit etmek için bir protokol (bkz.
    1. Bulaşıkları (adım 3.6'dan itibaren) 0.5 mL bloke edici tamponla (PBS'de% 5 normal keçi serumu) 60 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Birincil antikor için uygun bir bloke edici tampon seçin. Tipik bir bloke edici tampon, kullanılan ikincil antikor ile aynı türden% 5 normal serum olacaktır.
    2. Seyreltilmiş primer antikoru antikor seyreltme tamponunda hazırlayın (PBS'de %1 normal keçi serumu). Bulaşıkları gece boyunca 4 ° C'de 0.5 mL seyreltilmiş birincil antikor ile inkübe edin.
      NOT: Uygun antikor seyreltme tamponunu seçin. Tipik olarak, antikor 1:50-1:200 seyreltmede kullanılır.
    3. Her biri 2 mL PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez durulayın. Seyreltilmiş keçi kaynaklı anti-fare sekonder antikorunu antikor seyreltme tamponunda hazırlayın (PBS'de %1 normal keçi serumu). Bulaşıkları oda sıcaklığında 1-3 saat boyunca 0.5 mL seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin.
      NOT: Tipik olarak, ikincil antikor 1:500-1:1.000 seyreltmede kullanılır. DAPI, çekirdekleri boyamak için kullanılabilir.
    4. Her seferinde 5 dakika boyunca 2 mL PBS ile 3 kat durulayın. Kapak kapağını 50 μL montaj ortamına yerleştirin.
      NOT: Çanaklar, GFP filtreli hepsi bir arada floresan mikroskobu (uyarma: 470/40, emisyon: 525/50) ve TexasRed filtreli (uyarım: 560/40, emisyon: 630/75) tek renkli modda yüksek çözünürlüklü ayarlarla (6 dB'de kazanç, ciltleme yok) görüntülenebilir. Bu çalışmada görüntüleme için büyütmeleri 4x-20x arasında olan objektif lensler kullanılmıştır.
      NOT: Slayt, 4 °C'de 2 aya kadar saklanabilir.

4. Veri analizi

  1. ImageJ 1.51s yazılımını açın. ImageJ penceresinde, kaydedilen görüntü dosyasını açmak için menü çubuğundan Dosya > Aç'ı seçin.
  2. Ölçüm ölçeğini ayarlamak için, ölçek çubuğuyla aynı mesafede bir çizgi çizin. Ölçeği Analiz Et > Ayarla'ya gidin ve çizginin bilinen mesafesini ve birimlerini Ölçek ayarla penceresinin uygun kutularına yazın.
  3. Hücre boşluğu arasına düz bir çizgi çizin ve değerleri bir veri penceresine aktarmak için Analyze > Measure (Ölçüm) düğmesine basın. Her örnekte en az beş farklı konum ölçün ve temsili örnek verilerini elde etmek için mesafelerin ortalamasını alın. İstatistiksel analizleri uygun yazılımları kullanarak gerçekleştirin (bkz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol kullanılarak Col1 ve yüksek moleküler ağırlıklı HA'dan (ortalama moleküler ağırlık: 1.200-1.400 kDa) oluşan karışık substratlar üzerinde bir migrasyon testi yapıldı. Boşluğun sınırındaki O9-1 hücrelerinin HA bakımından zengin boşluğa kolayca göç ettiği bulunmuştur (Şekil 4). Bir FA belirteci olan vinkülin14 için immün boyama, O9-1 hücrelerinin HA yıkımı bölgelerinde fokal adezyonlar (FA'lar) oluşturduğunu doğruladı (Şekil...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çeşitli ECM bileşenleri NCC göçünü/göçünü düzenler. Örneğin, HA, NCC göçünü 2,15 pozitif olarak düzenler. İlginç bir şekilde, bir hücre yüzeyi hyaluronidaz olan Tmem2'nin genetik fare modellerine dayanan bir çalışma, NCC migrasyonunda HA bozunmasının gerekliliğini aydınlatmıştır9. Kollajenler ayrıca nöral tüp16'yı çevreleyen ECM'de de bol miktarda bulunur. Küçük bir lösin bakımından zengin proteoglikan olan Decorin'...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar, hiçbir rakip çıkar olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Fumitoshi Irie ve Yu Yamaguchi'ye bu yöntemin oluşturulmasındaki teşvikleri ve nazik önerileri için büyük teşekkürlerimi sunuyorum. Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği'nden (#19KK0232 T.I.'a, #20H03896 T.I.'a) bilimsel araştırma programları için hibe yardımı ile desteklenmiştir. HA'nın cam substratlar üzerine kaplanması ve substratlar üzerindeki in situ HA bozunma tahlilleri için orijinal yöntem Yamamoto et al. (2017) 8'de tarif edilirken, HA / Col1 karışık substratlarının hazırlanması için yöntem Irie et al. (2021) 7'de açıklanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10cm hücre kültürü kabıCORNINGCat. 353003
1X PBSMillipore Kedi. Hayır. BSS-1005-B
2 oyuklu kültür ekleriibidiCat. 80209
Alexa 555 etiketli keçi anti-fare IgGInvitrogenCat. A21422Keçi türevi anti-fare ikincil antikoru
otomatik hücre sayacıBio-RadCat. Hayır. TC20
CELLBANKERZENOGEN PHARMACat. 11910Hücre dondurma ortamı
kollajen tip ISigma Cat. No. 08-115
Komple ES Hücre OrtaKırlangıç Kedisi. Hayır. ES-101-B
DAPIInvitrogenCat. 10184322
Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium GibcoCat. 11971025
Fetal Sığır serumuGibcoCat. 10270106
floresan mikroskobuKeyenceCat. Hayır. BZ-X700
Floresan etiketli HAPG AraştırmaFAHA-H2
Glas alt çanakIwakiCat. 11-0602
glutaldehitSigmaCat. Hayır. G5882
MatrigelBalıkçı Kedisi. Hayır. CB-40234Bazal membran matris
monoklonal anti-vinkülin antikoruSigmaCat. Hayır. V9264
montaj ortamıDakoS3023
Normal keçi serumuFisherCat., 50062Z
O9-1 hücreleriMilliporeKedi. Hayır. SCC049
ParaformaldehitSigma Kat. 158127
trietoksisilanSigma Kedisi. 390143
tripsin-EDTAMillipore Kedisi. Hayır. SM-2003-C
, numaralı

Kaynaklar

  1. Bhatt, S., Diaz, R., Trainor, P. A. Signals and switches in mammalian neural crest cell differentiation. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (2), 008326(2013).
  2. Casini, P., Nardi, I., Ori, M. Hyaluronan is required for cranial neural crest cells migration and craniofacial development. Developmental Dynamics. 241 (2), 294-302 (2012).
  3. Landolt, R. M., Vaughan, L., Winterhalter, K. H., Zimmermann, D. R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 121 (8), 2303-2312 (1995).
  4. Camenisch, T. D., et al. Disruption of hyaluronan synthase-2 abrogates normal cardiac morphogenesis and hyaluronan-mediated transformation of epithelium to mesenchyme. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 349-360 (2000).
  5. Camenisch, T. D., Schroeder, J. A., Bradley, J., Klewer, S. E., McDonald, J. A. Heart-valve mesenchyme formation is dependent on hyaluronan-augmented activation of ErbB2-ErbB3 receptors. Nature Medicine. 8 (8), 850-855 (2002).
  6. Lan, Y., Qin, C., Jiang, R. Requirement of hyaluronan synthase-2 in craniofacial and palate development. Journal of Dental Research. 98 (12), 1367-1375 (2019).
  7. Irie, F., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 regulates cell adhesion and migration via degradation of hyaluronan at focal adhesion sites. Journal of Biological Chemistry. 296, 100481(2021).
  8. Yamamoto, H., et al. A mammalian homolog of the zebrafish transmembrane protein 2 (TMEM2) is the long-sought-after cell-surface hyaluronidase. Journal of Biological Chemistry. 292 (18), 7304-7313 (2017).
  9. Inubushi, T., et al. The cell surface hyaluronidase TMEM2 plays an essential role in mouse neural crest cell development and survival. PLoS Genetics. 18 (7), 1009765(2022).
  10. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046(2014).
  11. Pijuan, J., et al. Cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  12. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  13. Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346(2018).
  14. Humphries, J. D., et al. Vinculin controls focal adhesion formation by direct interactions with talin and actin. Journal of Cell Biology. 179 (5), 1043-1057 (2007).
  15. Perris, R., Perissinotto, D. Role of the extracellular matrix during neural crest cell migration. Mechanisms of Development. 95 (1-22), 3-21 (2000).
  16. Perris, R., et al. Spatial and temporal changes in the distribution of proteoglycans during avian neural crest development. Development. 111 (2), 583-599 (1991).
  17. Zagris, N., Gilipathi, K., Soulintzi, N., Konstantopoulos, K. Decorin developmental expression and function in the early avian embryo. The International Journal of Developmental Biology. 55 (6), 633-639 (2011).
  18. Perris, R., Paulsson, M., Bronner-Fraser, M. Molecular mechanisms of avian neural crest cell migration on fibronectin and laminin. Developmental Biology. 136 (1), 222-238 (1989).
  19. Chevalier, N. R., et al. How tissue mechanical properties affect enteric neural crest cell migration. Scientific Reports. 6, 20927(2016).
  20. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  21. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  22. Jonkman, J. E., et al. An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy. Cell Adhesion and Migration. 8 (5), 440-451 (2014).
  23. Davis, P. K., Ho, A., Dowdy, S. F. Biological methods for cell-cycle synchronization of mammalian cells. Biotechniques. 30 (6), 1322-1331 (2001).
  24. Wayner, E. A., Garcia-Pardo, A., Humphries, M. J., McDonald, J. A., Carter, W. G. Identification and characterization of the T lymphocyte adhesion receptor for an alternative cell attachment domain (CS-1) in plasma fibronectin. Journal of Cell Biology. 109 (3), 1321-1330 (1989).
  25. Robert, G. A., et al. Molecular structure of 3-aminopropyltriethoxysilane layers formed on silanol-terminated silicon surfaces. The Journal of Physical Chemistry. 116 (10), 6289-6297 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

N ral Krista H creleriHyaluronan MatrisiIn Vitro ModelTip I KolajenFokal AdhezyonlarHyaluronan DegradasyonuKarma Substrat AnaliziO9 1 H creleri
In Vitro Hyaluronan Bakımından Zengin Hücre Dışı Matriksin Nöral Kret Hücre Migrasyonu Üzerine Etkilerinin İncelenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.