Yöntem makalesi

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/64750

⸱

20 Ekim 2023

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran temas bölgeleri (MCS'ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS'ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS'ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS'ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS'lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS'lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER'ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA'yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50'sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS'ler) oluşturmaktır1. MCS'ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları1 dahil olmak üzere çeşi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mitokondriyal boyama ve yakınlık ligasyon testi (PLA)

  1. Plaka 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 ile,% 75 -% 90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede1.5 içinde 24 oyuklu plakalarda, işlem gününde% 75-90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede.
    NOT: HeLa hücreleri, mitokondriyal boyama ve PLA'dan önce siRNA tedavisi ve/veya DNA plazmit transfeksiyonu gibi ek tedavilere tabi tutulabilir.
  2. Mitokondriyal boyama
    1. Hücreleri bir ....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, iki ER'ye bağlı lipid transfer proteininin, ORP5 ve ORP8'in etkileşim bölgelerini tespit ettik ve bunların diğer organellerle, özellikle mitokondri ile temas halinde olan ER membran alt alanlarındaki oluşumlarını değerlendirdik. Bunun için, HeLa hücrelerindeki mitokondriyal ağ kırmızı bir mitokondriyal işaretleyici ile boyandı ve özgüllüğü daha önce immünofloresan15 ile test edilen primer antikorlar anti-ORP5 ve anti-ORP8 kullanılarak fiksasyondan sonra ORP.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, MCS'lerde, özellikle MERCS'lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA'yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD'ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS'lerde ve aynı zamanda diğer MCS'lerde potansiyel olarak lokalize o.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir Programı, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) ve Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Bitki Bilimleri).

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (1X DPBS)Gibco14190-094
Amonyum klorür (NH4Cl)VWR21236.291
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA7906
Dairesel cam lameller 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos kırmızı MitoTrackerInvitrogenM7512kırmızı mitokondriyal işaretleyici
Konfokal ters mikroskop SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC ile İşlenmiş 24 Kuyulu PlakalarMerckCLS3526
Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Yeşil SigmaDUO92002
Duolink DAPI ile Yerinde Montaj Ortamı SigmaDUO82040
Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Fare EKSİ SigmaDUO92004
Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Tavşan PLUSSigmaDUO92014
Duolink Yerinde Yıkama Tamponları, Floresan &SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, GlutaMAX Takviyesi Gibco51985026serum içermeyen ortam
Imaris yazılımı v 9.3BitplaneN/Ahücre görüntüleme yazılımı
İnkübatör UINCU-line IL10VWR390-0384
Mikroskop lamı StarFrost (3" x 1") Knittel Cam
fare anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148
tavşan anti-ORP5  SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Saf Damıtılmış Su, DNase / RNase içermeyenInvitrogen10977-035

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Bi....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yak nl k Ligasyon DeneyiMembran Temas B lgeleriProtein Etkile imi KantifikasyonuOrganel Boyama3 Boyutlu G r nt leme SegmentasyonuMitokondri ile li kili MembranlarKonfokal G r nt lemeORP5 ORP8 Etkile imiH cre i leti im

İlgili makaleler