Yöntem makalesi

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/64750

⸱

20 Ekim 2023

 ,  , 
1Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay, 2Inserm U1280, 3Imagerie-Gif, Light Microscopy Facility, Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Université Paris-Saclay

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran temas bölgeleri (MCS'ler), membran füzyonunu içermeden yan yana getirilmiş organeller arasında çeşitli biyomoleküllerin (yani kalsiyum ve lipitler) dinamik değişimine izin veren ve düzenleyen yakın membran yakınlığı alanlarıdır. MCS'ler hücresel homeostaz için gereklidir ve işlevleri, genellikle multimerik protein kompleksleri olarak bulunan yerleşik bileşenler tarafından sağlanır. MCS'ler genellikle lipid sentezi ve hücresel kalsiyum depolamanın önemli bir bölgesi olan endoplazmik retikulumu (ER) içerir ve klasik veziküler taşıma yollarından dışlanan mitokondri gibi organeller için özellikle önemlidir. Son yıllarda, ER ve mitokondri arasındaki MCS'ler, işlevleri hücresel metabolizmayı/biyoenerjetik değerleri güçlü bir şekilde etkilediği için kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu temas bölgelerinde membran bağları, kalsiyum kanalları ve lipid transfer proteinleri dahil olmak üzere çeşitli proteinler tanımlanmaya başlanmıştır, bu nedenle bu MCS bileşenlerini incelemek için yeni metodolojilere ve teknik yaklaşımlara olan ihtiyacı artırmaktadır. Burada, birbirine fiziksel olarak yakın (>40 nm) olan ve ER-mitokondri MCS'lerinde aynı zarda bulunan proteinlerin saptanmasına izin veren, yakınlık ligasyon testi (PLA), mitokondri boyama ve 3D görüntüleme segmentasyonunu içeren birleşik teknik yaklaşımlardan oluşan bir protokolü açıklıyoruz. Örneğin, daha önce ER-mitokondri ve ER-plazma membranı MCS'lerinde etkileşime girdiği ve lokalize olduğu gösterilen iki ER'ye bağlı lipid transfer proteini, ORP5 ve ORP8 kullandık. ORP5-ORP8 PLA'yı hücre görüntüleme yazılımı analizi ile ilişkilendirerek, ORP5-ORP8 kompleksinin mitokondriyal yüzeyden uzaklığını tahmin etmek ve ORP5-ORP8 PLA etkileşiminin yaklaşık% 50'sinin mitokondriye yakın ER alt alanlarında meydana geldiğini belirlemek mümkün olmuştur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organeller arası iletişim, ökaryotik hücrelerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Organellerin iletişim kurmasının bir yolu, bağlar, lipid transfer proteinleri ve kalsiyum kanalları gibi yapısal ve fonksiyonel proteinler tarafından korunan iki organel arasındaki yakın zar karşıtlıkları olan zar temas bölgeleri (MCS'ler) oluşturmaktır1. MCS'ler benzer veya farklı organeller arasında kurulabilir ve hücresel homeostazı korumak için önemli olan hücresel bileşenlerin değişimine aracılık ederler. Bugüne kadar, endoplazmik retikulum (ER)-mitokondri, ER-plazma membranı (PM) ve ER-lipid damlacık (LD) kontakları1 dahil olmak üzere çeşitli MCS tanımlanmıştır. Bunlar arasında, ER ve mitokondri (MERCS'ler) arasında oluşanlar, lipid ve kalsiyum homeostazı2 dahil olmak üzere çeşitli hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde rol oynadıkları için en çok çalışılanlar arasındadır. Mitokondri, klasik veziküler taşıma yollarından büyük ölçüde dışlandığından, ER'den anahtar lipitleri veya lipid öncüllerini ithal etmek için MERCS'ye ve moleküler bileşenlerine güvenirler. Bu lipitlerin MERCS'ler arasında veziküler olmayan taşınması, uygun mitokondriyal lipid bileşiminin yanı sıra fonksiyonel ve yapısal bütünlüklerinin korunmasını sağlar3.

MCS'lerin çeşitli hücresel fonksiyonlara önemli katılımı göz önüne alındığında, moleküler bileşenlerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına olan ilgi son yıllarda büyük ölçüde artmıştır. MCS'ler hakkındaki bilgileri ilerletmek için çeşitli görüntüleme tabanlı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bunlar arasında, floresan prob tabanlı yakınlık ligasyon testi (PLA), endojen seviyelerdeorganeller arası protein-protein etkileşimlerini (40 nm'lik bir tespit aralığında) tespit ederek MCS'lerin bolluğunun bir göstergesi olarak yaygın olarak kullanılmıştır 4. Örneğin, MERCS'ler, VDAC1-IP3R, GRP75-IP3R, CypD-IP3 ve PTPIP51-VAPB 5,6,7,8 dahil olmak üzere çeşitli mitokondri-ER protein çiftleri arasında PLA kullanılarak görselleştirildi ve ölçüldü. Bu teknoloji, MCS 5,7,9,10,11'de bulunan organeller arası protein-protein etkileşimlerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılmış olsa da, çalışmaların çoğu PLA'yı organel boyama ile birleştirmemiştir. Sonuç olarak, PLA etkileşimleri ve ilişkili organeller arasındaki yakınlığın ölçülmesine izin veren nicel bir yöntem henüz geliştirilmemiştir. Bu nedenle, şimdiye kadar, ER proteinleri söz konusu olduğunda, diğer organellerle temas halinde olan zar alt alanları içindeki etkileşimleri, yaygın olarak dağılmış ER ağı içindeki etkileşimlerinden ayırt edilmemiştir.

Burada, aynı organelin zarında bulunan proteinler arasındaki PLA etkileşimlerini tespit etmek ve bunların MCS'deki ortak organelin zarına yakınlığını analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol iki öncül temelinde geliştirilmiştir: 1) aşırı ekspresyon koşullarında, ER lipid transfer proteinleri ORP5 ve ORP8'in ER-mitokondri ve ER-PM MCS'lerde 12,13,14,15 birlikte lokalize olduğunu ve etkileşime girdiğini ve ORP5'in ER-LD temaslarındalokalize olduğunu gösteren önceki çalışmalar 16,17; 2) PLA, konfokal mikroskopi, organel etiketleme ve 3D görüntüleme analizi dahil olmak üzere mevcut teknolojiler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mitokondriyal boyama ve yakınlık ligasyon testi (PLA)

  1. Plaka 0.5 x 10 5-2 x 10 5 HeLa hücreleri, Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerinde (DMEM) %10 FBS, %1 penisilin / streptomisin ve %1 esansiyel olmayan amino asitler ile desteklenmiş 37 ° C'de% 5 CO2 ile,% 75 -% 90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede1.5 içinde 24 oyuklu plakalarda, işlem gününde% 75-90 hücre birleşmesine izin veren bir seyreltmede.
    NOT: HeLa hücreleri, mitokondriyal boyama ve PLA'dan önce siRNA tedavisi ve/veya DNA plazmit transfeksiyonu gibi ek tedavilere tabi tutulabilir.
  2. Mitokondriyal boyama
    1. Hücreleri bir kez 37 °C'de önceden ısıtılmış serumsuz ortamda yıkayın. Hücreleri önceden ısıtılmış serumsuz besiyeri ile 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
    2. Önceden ısıtılmış serumsuz ortamda 1 μM kırmızı mitokondriyal işaretleyici hazırlayın.
    3. Hücreleri 500 μL mitokondriyal marker çözeltisi ile 37 ° C'de% 5 CO2 ile 30 dakika inkübe edin. Mitokondriyal belirteç tedavisi ve protokolün sonraki adımları sırasında, hücreleri mümkün olduğunca ışıktan koruyarak lameller üzerinde tutun.
    4. İnkübasyonun ardından, hücreleri önceden ısıtılmış serum serbest ortamda 1x ve 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2x yıkayın. Fiksasyondan önceki uzun yıkama adımları mitokondriyal morfolojiyi etkileyebileceğinden, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin.
    5. 1x PBS'yi lamellerden çıkarın ve hücreleri, kimyasal kaputun altında oda sıcaklığında (karanlıkta) 30 dakika boyunca taze hazırlanmış %4 PFA'da (1x PBS'de) inkübe ederek sabitleyin. 3x'i 500 μL 1x PBS'de 2 dakika yıkayın (tek kullanımlık pipetler veya pompaya bağlı bir vakum sistemi kullanarak).
    6. 1x PBS'yi çıkarın ve lamelleri 500 μL 50mM NH4Cl ile oda sıcaklığında (karanlıkta) 15 dakika inkübe edin. Bir vakum sistemi kullanarak 500 μL 1x PSB'de 1x'i 2 dakika boyunca yıkayın.
    7. ORP5-ORP8 PLA için 500 μL bloke edici tampon 1'de (BB1, %1 BSA, 1x PBS'de %0.1 saponin) veya ORP8-PTPIP51 PLA için bloke edici tampon 2'de (BB2, %2 BSA, %0.1 normal keçi serumu, 1x PBS'de 0.1 saponin) 3x'i 2 dakika yıkayın.
    8. Lamelleri 24 oyuklu plakadan bir nem odasına aktarın. Lamelleri hazneye aktardıktan sonra, kuruluğu önlemek için 100 μL BB (kullanılan antikor çiftlerine göre BB1 veya BB2) ekleyin.
      NOT: Işıktan korunan bir nem odası, bir Petri kabını (plastik veya cam) alüminyum folyoya sararak ve Petri kabının çevresine birkaç parça ıslak kağıt havlu ekleyerek kolay ve hızlı bir şekilde elde edilebilir.
  3. Yakınlık ligasyon testi (PLA)
    NOT: PLA protokolü, küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarını takip eder.
    1. Primer antikor inkübasyonu
      1. Birincil antikor çalışma solüsyonunu hazırlayın. BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-ORP8 (1:200), BB2'de fare anti-ORP8 (1:200) artı tavşan anti-PTPIP51 (1:200) ve BB1'de tavşan anti-ORP5 (1:150) artı fare anti-PTPIP51 (1:200) seyreltin. Lamel başına (en az) 40 μL primer antikor çözeltisi hazırlayın (ör., 0.27 μL tavşan anti-ORP5, 0.2 μL fare anti-ORP8, 39.53 μL BB1).
      2. BB'yi bir vakum sistemi kullanarak önceki yıkamadan (adım 1.2.8) çıkarın ve lamellere 40 μL primer antikor solüsyonu ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    2. Vakum sistemini kullanarak lamelleri 3x 5 dakika boyunca 100 μL karşılık gelen BB ile yıkayın.
    3. PLA prob inkübasyonu
      1. PLA probları çalışma çözümünü hazırlayın. Tavşan ARTI (1:5) ve fare EKSİ (1:5) PLA problarını BB'de seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL PLA prob solüsyonu hazırlayın (örneğin, 8 μL tavşan ARTI PLA probu, 8 μL fare EKSİ PLA probu, 24 μL BB). Kullanmadan önce PLA prob solüsyonunun oda sıcaklığında 20 dakika bekletin.
      2. Bir vakum sistemi kullanarak BB'yi lamellerden çıkarın (adım 1.3.2'den itibaren) ve lamellere 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin. Işıktan korunan bir nem odasında 37°C'de 1 saat inkübe edin.
    4. Lamelleri oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu A'da 2x 5 dakika yıkayın.
    5. Ligasyon
      1. 5x ligasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL ligasyon solüsyonu hazırlayın (8 μL 5x ligasyon tamponu, 31 μL ultra saf su).
      2. Ligaz'ı (PLA kitinde verilen 1 U/μL) önceki adımda 1:40 seyreltmede hazırlanan 1x ligasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
      3. Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.4'ten itibaren), lamellere 40 μL ligaz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    6. Lamelleri 2x 2 dakika boyunca 100 μL 1x yıkama tamponu A'da oda sıcaklığında vakum sistemini kullanarak yıkayın.
    7. Polimerizasyon
      1. 5x amplifikasyon tamponunu ultra saf suyla 1:5 oranında seyreltin ve karıştırın. Her lamel için (en az) 40 μL amplifikasyon solüsyonu (8 μL 5x amplifikasyon tamponu, 31.5 μL ultra saf su) hazırlayın.
      2. Polimerazı (PLA kitinde verilen 10 U/μL) önceki adımda 1:80 seyreltmede hazırlanan 1x polimerizasyon tamponuna ekleyin ve karıştırın.
      3. Bir vakum sistemi kullanarak lamellerden 1x yıkama tamponu A'yı çıkarın (adım 1.3.6'dan itibaren), lamellere 40 μL polimeraz çözeltisi ekleyin ve ışıktan korunan bir nem odasında 37 °C'de 1 saat 40 dakika inkübe edin.
    8. Polimeraz çözeltisini lamellerden çıkarın ve ışıktan korunan bir nem odasında oda sıcaklığında 100 μL 1x yıkama tamponu B'de 2x 10 dakika yıkayın.
    9. Lamelleri 1 x 1 dakika boyunca 100 μL 0.001x yıkama tamponu B içinde oda sıcaklığında ışıktan korunan bir nem odasında yıkayın.
    10. Lamelleri DAPI'li montaj ortamı (1.6-0.4 μg/mL arasındaki konsantrasyon) kullanarak mikroskopi için cam slaytlara monte edin. Oje ile kapatın.

2. Görüntü edinme

  1. PLA sonuçlarını gözlemleyin ve beraberindeki yazılımı kullanarak 63x yağa daldırma objektifi ile floresan konfokal mikroskopi kullanarak görüntüler elde edin.
  2. 405 nm lazer diyot veya beyaz ışık lazeri kullanarak floresan uyarımını ayarlayın ve GaAsP PMT'ler veya hibrit dedektörlerle spektral pencereleri toplayın. Her odak düzleminde (300 nm'yi kapsayan), PLA (λex = 488 nm, λem = 505-560 nm) ve mitokondri (λex = 543 nm, λem = 606-670 nm) için floresan sinyallerini alın.

3. Mitokondri ile ilişkili PLA noktalarının görüntü işleme ve değerlendirilmesi

  1. Hücresel bileşenler arasında mesafe haritaları oluşturan görüntü analizi için bir yazılım kullanarak konfokal görüntüleri işleyin. PLA noktalarının ve mitokondriyal ağın 3D sulandırmalarını oluşturmak ve hücre görüntüleme yazılımını kullanarak aralarındaki mesafeye erişmek için aşağıdaki adımları izleyin (Şekil 1).
  2. 3D mesafe haritası uzantısının kurulumu
    1. Hem XT seçeneğiyle hem de MATLAB yazılımıyla hücre analizi yazılım paketini veya yalnızca web sitesinden ücretsiz olarak indirilebilen bir MATLAB derleyici çalışma zamanını (MRC) kurun.
    2. Hücre çözümleme yazılımını, bir XTension başlatıldığında MATLAB'ı başlatacak şekilde aşağıdaki gibi ayarlayın: Imaris (Mac OS X) veya Düzen menüsünden (Windows) Tercihler'i seçin, Özel Araçlar paneline geçin ve ardından yolu ayarlayın:
      Windows için C:\Program Files\MATLAB\R201Xa_x64\bin\win64\MATLAB.exe veya/Applications/MATLAB_R201Xa.app/bin/matlab Mac OS X için.
  3. Görüntüleri yazılıma aktarın
    1. Konfokal yığın görüntülerini bir . IMS dosyasını, doğrudan Arena bölümü aracılığıyla veya toplu dönüştürmeye izin veren bağımsız Dosya Dönüştürücüyü kullanarak.
    2. İçe aktarma işleminden sonra, görüntülerin uygun şekilde kalibre edilip edilmediğini kontrol edin. Görüntü Geometrisi > Görüntü Özelliklerini Düzenle > tıklayın ve voksel boyutunun X ve Y cinsinden gerçek görüntü için beklenen piksel boyutuna karşılık gelip gelmediğini kontrol edin (edinme yazılımındaki görüntü kalibrasyonuna bakın) ve Z'deki voksel boyutunun Z yığınını oluşturmak için mikroskop tarafından uygulanan adıma karşılık geldiğini kontrol edin. Değerler doğru değilse, aşağıdaki adımlarda mesafelerin doğru bir şekilde tahmin edilmesini sağlamak için bunları değiştirin.
    3. Ekran Ayarı menüsündeki farklı kanalların kontrastını Düzenle > Ekran Ayarını Göster'e tıklayarak ayarlayın. Her rengin görüntüsünü optimize etmek için her kanalı bağımsız olarak ayarlayın. Bu adım, görüntü değerlerini doğrudan etkilemez, ancak kesin eşikler ayarlamak veya zayıf nesneleri tespit etmek için gereklidir.
    4. Düzenle > 3B Kırp seçeneklerini kullanarak görüntüyü kırparak analizi tek bir hücreyle sınırlayın. Aynı görüş alanındaki başka bir hücreyi analiz etmek için, aynı görüntüyü bir kez daha açın ve farklı şekilde kırpın.
  4. ORP5-ORP8 nokta algılama
    1. ORP5 ve ORP8 etkileşiminin bulunduğu yerde üretilen PLA sinyallerini, yeni bir nesne kümesi oluşturan ve nokta algılama sihirbazını açan Yeni Noktalar Ekle seçeneğine tıklayarak tespit edin.
    2. Nokta algılamanın gerçekleştirileceği kanalı seçin.
    3. Nokta algılama algoritmasının ilgilenilen nesneleri bulmasına yardımcı olmak için Tahmini XY Çapını ayarlayın (nesne boyutu farklıysa aralık uyarlanmalıdır). Seçilen değer çok yüksekse, yakındaki nesnelerin kaynaşacağını unutmayın. Değer çok küçükse, bir sinyal birden fazla nesne olarak kabul edilebilir veya anormal sinyaller algılanabilir.
    4. İlgilenilen nesnelerin etrafındaki yerel kontrastı artırmak için nokta algılamadan önce görüntü arka planını kaldırmak için Arka Plan Çıkarma'ya tıklayın.
    5. Kaliteyi (nesne merkezindeki yoğunluk) eşik parametresi ve yazılım otomatik eşiği olarak tutarak nokta algılama eşiğini ayarlayın veya tüm nesneleri algılamak için bu değeri biraz değiştirin. Nokta algılama bittiğinde, algılama parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
  5. Mitokondriyal ağ tespiti
    1. Yeni bir nesne oluşturmak için Yeni Yüzeyler Ekle'ye tıklayarak bir yüzey oluşturma oluşturmak için mitokondriyal ağı tespit edin ve yüzey algılama sihirbazını açın.
    2. Yüzey oluşturma işleminin gerçekleştirileceği kanalı seçin.
    3. Daha pürüzsüz bir yüzey elde etmek için Düzgünleştir onay kutusunu tıklatarak ve yüzeyde gözlemlenebilen en küçük ayrıntıları gösteren bir eşik ayarlayarak bir Gauss filtresi uygulayın.
    4. Yerel kontrastları geliştirmek ve eşik adımına yardımcı olmak için bir arka plan çıkarma işlemi gerçekleştirin.
    5. Sinyalin yoğunluğuna göre mitokondriyal ağı tespit etmek için eşiği ayarlayın. Eşiği doğru bir şekilde ayarlamak zorsa, düzgünlük derecesini ve arka plan çıkarma derecesini ayarlamak için önceki adıma geri dönmeniz önerilir.
    6. Gerekirse, eşikten kaynaklanan küçük kalıntıları gidermek için yüzeye bir filtre uygulayın. Bunu yapmak için, yüzey sınıflandırma penceresinde Voksel Sayısı filtresini seçin ve yalnızca ilgilenilen nesneleri tutmak için üst ve alt eşiklerle oynayın. Yüzey oluşturma işlemi sona erdiğinde, oluşturma parametrelerini kaydedin ve diğer görüntüleri işlemek için bunları yeniden kullanın.
  6. Mitokondri etrafında 3 boyutlu mesafe haritasının oluşturulması
    1. Daha önce aşağıdaki gibi oluşturulan mitokondriyal yüzeyin dışında bir mesafe haritası oluşturun. Sahne ağacı kutusunda mitokondri yüzeyini seçin. Görüntü işleme > yüzeyler işlevi > mesafe dönüşümü üzerine tıklayın. Bu, kullanıcıdan haritanın nesne yüzeyinin dışında mı yoksa içinde mi hesaplanacağını seçmesini isteyen bir Matlab XTension'ı çağırır.
    2. PLA noktaları ile mitokondri yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için Dış Yüzey Nesnesi'ni seçin. Mesafe haritası oluşturulduktan sonra, ekran ayarlama panelinde yeni bir kanal olarak görünür. Bu kanalda, her pikselin en yakın mitokondriye olan mesafeye karşılık gelen bir değeri vardır.
  7. Nesnelerin en yakın mitokondriden uzaklıklarının çıkarılması
    1. Her noktadan en yakın mitokondriye olan mesafeyi ölçmek ve en yakın olanları belirlemek ve görselleştirmek için, sahne ağacı kutusunda daha önce oluşturulmuş noktaları seçin.
    2. İstatistiklerde ve ayrıntılı günlükte, Belirli Değerler'i seçin (her nokta için bir ölçüm elde etmek için). Merkez Yoğunluğu Ch=X'i seçin (X, mesafe haritası kanalının numarasına karşılık gelir). Bu, mesafe haritasında en yakın mitokondriye olan mesafesine karşılık gelen her bir nokta merkezinin değerini ölçecektir.
    3. Pencerenin sol alt kısmındaki Disket simgesine tıklayarak verileri .csv dosyası olarak dışa aktarın.
    4. Mitokondriye olan mesafelerine göre bir nokta alt popülasyonu çıkarmak için sahne ağacındaki noktaları seçin ve Filtreler sekmesine tıklayın.
    5. Bu pencerede, bir kez daha Merkez Yoğunluğu Ch=X'e dayalı yeni bir filtre ekleyin ve alt eşiği 0 μm'ye ve üst eşiği 0,380 μm'ye ayarlayarak mitokondriden 380 nm'den daha az uzaklıktaki noktaları çıkarın.
      NOT: 380 nm'lik eşik, birincil ve ikincil antikorlar (30 nm) artı PLA amplifikasyon sinyallerinin (350 nm) yarısı maksimumda (FWHM) tam genişliğin yarısı arasındaki ilişkiyi içeren bir PLA reaksiyonuna dayalı olarak tahmin edilmiştir.
    6. Seçili noktalara odaklanmak ve örneğin onlara farklı bir renk vermek için, Seçimi Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine basarak bir çoğaltma adımı gerçekleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, iki ER'ye bağlı lipid transfer proteininin, ORP5 ve ORP8'in etkileşim bölgelerini tespit ettik ve bunların diğer organellerle, özellikle mitokondri ile temas halinde olan ER membran alt alanlarındaki oluşumlarını değerlendirdik. Bunun için, HeLa hücrelerindeki mitokondriyal ağ kırmızı bir mitokondriyal işaretleyici ile boyandı ve özgüllüğü daha önce immünofloresan15 ile test edilen primer antikorlar anti-ORP5 ve anti-ORP8 kullanılarak fiksasyondan sonra ORP...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, MCS'lerde, özellikle MERCS'lerde organeller arası protein PLA etkileşimlerini tanımlamak ve ölçmek için tasarlanmıştır. Protokolün yeniliği, aynı zarda bulunan iki protein arasındaki PLA etkileşimlerini lokalize etmek ve ölçmek için PLA'yı çoklu organellerin etiketlenmesi, konfokal mikroskopi ve 3D görüntü analizi ile birleştirmesidir, bu durumda ER zarı içinde mitokondri zarı (MAM) veya MAM ve LD'ler ile aynı anda. Bu protokol, belirli MERCS'lerde ve aynı zamanda diğer MCS'lerde potansiyel olarak lokalize o...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ANR Jeune Chercheur (ANR0015TD), ATIP-Avenir Programı, Fondation pour la Recherche Medicale (n°206548) ve Fondation Vaincre Alzheimer (eOTP:669122 LS 212527), I'Agence Nationale de la Recherche (ANR-11-EQPX-0029/Morphoscope, ANR-10-INBS-04/FranceBioImaging; ANR-11-IDEX-0003-02 / Saclay Bitki Bilimleri).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (1X DPBS)Gibco14190-094
Amonyum klorür (NH4Cl)VWR21236.291
Sığır serum albümini (BSA)SigmaA7906
Dairesel cam lameller 13mm no. 1.5Agar ScientificL46R13-15
CMXRos kırmızı MitoTrackerInvitrogenM7512kırmızı mitokondriyal işaretleyici
Konfokal ters mikroskop SP8-XLeicaDMI 6000
Corning Costar TC ile İşlenmiş 24 Kuyulu PlakalarMerckCLS3526
Duolink Yerinde Tespit Reaktifleri Yeşil SigmaDUO92002
Duolink DAPI ile Yerinde Montaj Ortamı SigmaDUO82040
Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Fare EKSİ SigmaDUO92004
Duolink Yerinde PLA Probu Anti-Tavşan PLUSSigmaDUO92014
Duolink Yerinde Yıkama Tamponları, Floresan &SigmaDUO82049
Gibco Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı, GlutaMAX Takviyesi Gibco51985026serum içermeyen ortam
Imaris yazılımı v 9.3BitplaneN/Ahücre görüntüleme yazılımı
İnkübatör UINCU-line IL10VWR390-0384
Mikroskop lamı StarFrost (3" x 1") Knittel Cam
fare anti-ORP8 Santa Cruz134409
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148
tavşan anti-ORP5  SigmaHAP038712
SaponinSigma84510
Ultra Saf Damıtılmış Su, DNase / RNase içermeyenInvitrogen10977-035

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scorrano, L., et al. Coming together to define membrane contact sites. Nature Communications. 10, 1287(2019).
  2. Vance, J. E. MAM (mitochondria-associated membranes) in mammalian cells: Lipids and beyond. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (4), 595-609 (2014).
  3. Giordano, F. Non-vesicular lipid trafficking at the endoplasmic reticulum-mitochondria interface. Biochemical Society Transactions. 46 (2), 437-452 (2018).
  4. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
  5. Gomez-Suaga, P., et al. The ER-mitochondria tethering complex VAPB-PTPIP51 regulates autophagy. Current Biology. 27 (3), 371-385 (2017).
  6. Han, S., et al. The role of Mfn2 in the structure and function of endoplasmic reticulum-mitochondrial tethering in vivo. Journal of Cell Science. 134 (13), jcs253443(2021).
  7. Stoica, R., et al. ALS/FTD-associated FUS activates GSK-3β to disrupt the VAPB-PTPIP51 interaction and ER-mitochondria associations. EMBO reports. 17 (9), 1326-1342 (2016).
  8. Tubbs, E., Rieusset, J. Study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells. Journal of Visualized Experiments. (118), e54899(2016).
  9. Cuello, F., et al. Impairment of the ER/mitochondria compartment in human cardiomyocytes with PLN p.Arg14del mutation. EMBO Molecular Medicine. 13 (6), e13074(2021).
  10. Paillusson, S., et al. α-Synuclein binds to the ER-mitochondria tethering protein VAPB to disrupt Ca2+ homeostasis and mitochondrial ATP production. Acta Neuropathologica. 134 (1), 129-149 (2017).
  11. Tubbs, E., et al. Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance. Diabetes. 63 (10), 3279-3294 (2014).
  12. Chung, J., et al. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  13. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO Reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  14. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8, 757(2017).
  15. Monteiro-Cardoso, V. F., et al. ORP5/8 and MIB/MICOS link ER-mitochondria and intra-mitochondrial contacts for non-vesicular transport of phosphatidylserine. Cell Reports. 40 (12), 111364(2022).
  16. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. Journal of Cell Biology. 219 (1), e201905162(2020).
  17. Guyard, V., et al. ORP5 and ORP8 orchestrate lipid droplet biogenesis and maintenance at ER-mitochondria contact sites. The Journal of Cell Biology. 221 (9), e202112107(2022).
  18. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Yak nl k Ligasyon DeneyiMembran Temas B lgeleriProtein Etkile imi KantifikasyonuOrganel Boyama3 Boyutlu G r nt leme SegmentasyonuMitokondri ile li kili MembranlarKonfokal G r nt lemeORP5 ORP8 Etkile imiH cre i leti im

İlgili makaleler