Burada sunulan protokol, güçlü bir yapışkan hidrojel jelatin o-nitrosobenzaldehitin (jelatin-NB) sentezini göstermektedir. Jelatin-NB, yara yüzeylerini korumak için güçlü bir fiziksel bariyer oluşturabilen hızlı ve etkili doku yapışma yeteneğine sahiptir, bu nedenle yaralanma onarımı biyoteknolojisi alanına uygulanması beklenmektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Güçlü yapışkan hidrojel, jelatin o-nitrosobenzaldehit sentezi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Yapışkan malzemeler, biyomedikal ve doku mühendisliği alanında popüler biyomalzemeler haline gelmiştir. Önceki çalışmamızda, esas olarak doku rejenerasyonu için kullanılan ve kornea hasarı ve enflamatuar bağırsak hastalığının hayvan modellerinde doğrulanan yeni bir materyal - jelatin o-nitrosobenzaldehit (jelatin-NB) - sunduk. Bu, biyolojik jelatinin o-nitrosobenzaldehit (NB) ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojeldir. Jelatin-NB, NB-COOH'un karboksil grubunu aktive ederek ve jelatin ile 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodiimid hidroklorür (EDC) ve N-hidroksisüksinimid (NHS) yoluyla reaksiyona girerek sentezlendi. Elde edilen bileşik, en az 18 ay boyunca istikrarlı bir şekilde saklanabilen nihai ürünü üretmek için saflaştırıldı. NB, doku üzerinde -NH2'ye güçlü bir yapışmaya sahiptir, bu da birçok C = N bağı oluşturabilir, böylece jelatin-NB'nin doku arayüzüne yapışmasını arttırır. Hazırlama süreci, NB-COOH grubunun sentezi, grubun modifikasyonu, jelatin-NB sentezi ve bileşiğin saflaştırılması için adımları içerir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez sürecini ayrıntılı olarak tanımlamak ve jelatin-NB'nin hasar onarımına uygulanmasını göstermektir. Ayrıca, protokol, daha uygulanabilir senaryolar için bilimsel topluluk tarafından üretilen malzemenin doğasını daha da güçlendirmek ve genişletmek için sunulmaktadır.
Giriş
Hidrojel, suyun şişmesiyle oluşan üç boyutlu bir polimer türüdür. Özellikle, hücre dışı bir matristen elde edilen hidrojel, mükemmel biyouyumluluğu ve terapötik etkinliği nedeniyle biyosentez ve rejeneratif tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır1. Gastrik ülser, nevrit, miyokard enfarktüsü 2,3,4 ve diğer hastalıkların tedavisi için hidrojeller bildirilmiştir. Ayrıca, jelatin-NB'nin inflamasyon ininflamatuar bağırsak hastalığının (IBD) sonucunu destekleyebileceği kanıtlanmıştır5. Geleneksel hidrojeller arasında jellan zamkı, jelatin, hyaluronik asit, polietilen glikol (PEG), katmanlı, hidrofobik / hidrofilik, aljinat / poliakrilamid , çift ağ ve poliamfoterik hidrojeller6 bulunur ve bunların hepsi iyi histouyumluluk ve mekanik özelliklere sahiptir. Bununla birlikte, bu geleneksel hidrojeller ortamdaki neme ve havaya karşı savunmasızdır. Uzun süre havaya maruz kalırlarsa, su kaybederler ve kururlar; suya uzun süre daldırılırlarsa, suyu emer ve7'yi genişletir, böylece esnekliklerini ve mekanik işlevlerini azaltırlar. Ek olarak, geleneksel hidrojellerin doku yapışmasını sağlamak büyük bir zorluktur8.
Buna dayanarak, biyolojik jelatinin NB ile modifiye edilmesiyle oluşan yeni bir hidrojel olan nano ölçekli bir hidrojel jelatin-NB tasarladık ve sentezledik (Şekil 1). NB, doku üzerinde -NH2'ye güçlü bir yapışma kabiliyetine sahiptir, bu da çok sayıda C = N bağı oluşturabilir, böylece hidrojel-doku arayüzünün yapışkanlığını arttırır. Bu güçlü yapışma, hidrojelin doku yüzeyine sıkıca yapışmasını sağlayabilir, böylece nano düzeyde bir moleküler kaplama oluşturabilir. Ekibin önceki çalışmalarında, bu tür modifiye hidrojel kaplamanın doku yapışmasını iyileştirdiği doğrulanmıştır9; kornea ve bağırsak organlarına ve dokularına stabil bir şekilde yapışabilir ve anti-inflamasyon, bariyer izolasyonu ve rejenerasyon teşvik rolleri oynayabilir. Amaç, jelatin-NB'nin spesifik sentez işlemini burada ayrıntılı olarak tanıtmaktır, böylece jelatin-NB daha fazla hasar onarımı senaryosunda uygulanabilir. Ayrıca, diğer araştırmacıları bu malzemenin doğasını daha fazla uygulama senaryosuna uyacak şekilde daha da güçlendirmeye ve genişletmeye teşvik ediyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
C57BL / 6 fareleri, Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi'nden satın alındı. Yeni Zelanda tavşanları Zhejiang Üniversitesi'nden satın alındı. Hayvanlar doğal ışık-karanlık döngü koşullarında tutuldu ve serbestçe yiyecek ve içme suyu verildi. Tüm deneysel prosedürler, Zhejiang Üniversitesi Etik Komitesi standart kılavuzlarının (ZJU20200156) ve Zhejiang Üniversitesi Tıp Fakültesi Sir Run Run Shaw Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin kurumsal kılavuzları tarafından etik olarak onaylanmıştır.
1. NB-COOH sentezi
- Önceki çalışmada önerilen protokole dayanarak 4-hidroksi-3-(metoksi-D3) benzaldehit (8.90 g, 58.5 mM, 1.06 eşdeğeri [eq.]), potasyum karbonat (10.2 g, 73.8 mM, 1.34 eq.) ve metil 4-bromobutirat (9.89 g, 55.0 mM, 1.0 eq.) hazırlayın10. Bileşikleri 40 mL N, N-dimetilformamid (DMF) içinde çözün ve ortam sıcaklığında 16 saat karıştırın.
- Karışıma 200 mL 0 °C su ekleyin ve ham bir ürün elde etmek için karışımı çökeltin.
- Ham ürünü DMF'de tekrar tekrar çözün ve ardından beş döngü boyunca çökeltin. Ham ürünü çökeltin ve erken ürünü elde etmek için 80 ° C'de 2 saat kurutun.
2. Kimyasal modifikasyon ve işleme
- Aşağıda açıklandığı gibi metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksifenil) butanoik asit metil esterin ipso ikamesini gerçekleştirin.
- % 70 nitrik asit (140 mL) önceden soğutulmuş (-2 °C) çözeltisine yavaşça 9.4 g metil 4-(4-formil-2-metoksifenoksi) butanoat (37.3 mM, 1 eq.) ekleyin ve 3 saat boyunca -2 °C'de karıştırın.
NOT: Nitrasyon reaksiyonunun sıcaklığına bağlı olarak, formil moiety'nin ipso ikamesi gerçekleşecektir. - Karışımı (~ 9.0 g) 200 mL 0 °C su ile süzün, ardından katı bir ürünü çökeltmek için DMF'de saflaştırın.
- Katı ürünü trifloroasetik asit (TFA)/H2O, 1:10 v/v (100 mL) içinde 90 °C'de hidrolize edin ve kurutun. Son ara ürün, kuru soluk sarı bir toz elde etmek için çözücüyü 80 kPa'nın altında çıkarın.
- Ara ürünü (7,4 g, 23,8 mM, 1,0 eq.) tetrahidrofuran (THF)/etanol, 1:1 v/v (100 mL) içinde çözün. Daha sonra 0 °C'de yavaşça1,43 g NaBH 4 (35,7 mM, 1,5 eq.) ekleyin. 3 saat sonra, tüm çözücüleri bir vakum altında çıkarın ve kalıntıyı 1: 1 su ve diklorometan çözeltisinde (her biri 50 mL) askıya alın.
- Ürünü sulu tabakadan çıkarmak için diklorometan hazırlayın. Organik tabakayı çıkarın ve magnezyum sülfat üzerinde kurutun.
- Ham ürünü, DCM / MeOH kullanarak 10: 1 oranında (% 1 TEA) silika jel kolon kromatografisi ile saflaştırın. Son olarak, 5.31 g (18.6 mM, 78.3%) nispeten saf sarımsı toz NB-COOH elde edin.
3. Jelatin-NB sentezi
- Bir parti modifikasyon için 5 g jelatin hazırlayın. 5 g jelatini 100 mL deiyonize suda eriterek homojen bir jelatin çözeltisi hazırlayın ve 37 °C'de saklayın.
NOT: Burada, orijinal 33 x 10-5 mol ε-amino grupları/g jelatin11 tanımlanmıştır. - Besleme oranını (FR), jelatindeki NB grupları ve primer amino grupları arasındaki molar oran olarak tanımlayın. Bu çalışmada 1 g jelatin içeren 53 mg NB FRNB = 1 olarak tanımlanmıştır.
- NB-COOH'un karboksil gruplarını aktive etmek için 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 1.060 mg NB-COOH çözün. NB grubu çözelti halindeyken ultraviyole (UV) ışığa duyarlı olduğundan, daima ışıktan uzak tutun.
- NB-COOH DMSO çözeltisine 746 mg 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilkarbodimid hidroklorür (EDC) ekleyin ve 5 dakika karıştırın. EDC çözüldükten sonra, 448 mg N-hidroksisüksinamid (NHS) ekleyin ve 5 dakika karıştırın.
- Karışımı 0,5 mL/dak hızında, 4 saat boyunca 45 °C'de reaksiyona girmek üzere kuvvetli bir karıştırma ile çözünmüş jelatin çözeltisine yavaşça düşürmek için bir damlama hunisi kullanın.
4. Ürünün saflaştırılması ve depolanması
- Jelatin-NB çözeltisini aşırı deiyonize suya karşı en az 3 gün boyunca diyalize edin, daha sonra jelatin-NB köpüklerini elde etmek için toplayın, dondurun ve liyofilize edin. Daha fazla kullanım için köpükleri karanlıkta bir kurutucuda tutun.
- Dondurularak kurutulmuş jelatin-NB köpükleri, kullanımdan hemen önce, 37 °C'de deiyonize suda çözün.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2A , NB gruplarını jelatin üzerine aşılayarak doku entegrasyonunu teşvik eden jelatin-NB sentezinde yer alan ana kimyasal reaksiyonların bir şemasını göstermektedir. Şekil 2B, jelatin-NB hidrojelinin O-nitrobenzenin, UV ışınlamasından hemen sonra bir NB grubuna dönüştüğünü ve daha sonra aktif aldehit grubunun bir Schiff tabanı oluşturmak için bir amino grubuyla çapraz bağlanabileceğini göstermektedir. Şekil 2C, NB gruplarının ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yapışkan malzemeler yeni bir malzeme sınıfıdır. Giderek daha fazla araştırmacı, çeşitli yapışkan malzemelerin sentezine kendini adamıştır ve biyoteknoloji, doku mühendisliği, rejeneratif tıp ve son yıllarda güçlü bir gelişmeye yol açan diğer alanlarda uygulamalarını bulmaya çalışmaktadır. Yapışkan malzemelerin güçlü yapışmasına odaklanmanın yanı sıra, araştırmacılar ayrıca enjekte edilebilirlik, kendi kendini iyileştirme, hemostatik, antibakteriyel, kontrollü çıkarma ve benzeri gibi diğer özelliklere de daha fazla dikkat...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Teşekkürler
Hiç kimse.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1- (3Dimetilaminopropil) -3-etilkarbodimid hidroklorür (EDC) | Aladdin | L287553 | |
| 4-Hidroksi-3- (metoksi-D3) benzaldehit | Shanghai Acmec Biochemical Co., Ltd | H946072 | |
| DCM | Aladdin | D154840 | |
| Diklorometan | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma-Aldrich | 20-139 | |
| dimetilformamid (DMF) | Sigma-Aldrich | PHR1553 | |
| jelatin | Sigma-Aldrich | 1288485 | |
| magnezyum sülfat | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| MeOH | Sigma-Aldrich | 1424109 | |
| metil 4- (4-formil-2-metoksifenoksi metoksifenil) butanoik asit metil ester | chemsrc | 141333-27-9 | |
| metil 4-bromobutirat | Aladdin | M158832 | |
| NaBH4 | Sigma-Aldrich | 215511 | |
| N-hidroksisüksinamid (NHS) | Aladdin | D342712 | |
| nitrik asit | Sigma-Aldrich | 225711 | |
| potasyum karbonat | Sigma-Aldrich | 209619 | |
| SEM (Nova Nano 450) | Thermo FEI | 17024560 | |
| THF/EtOH | Aladdin | D380010 | |
| trifloroasetik asit (TFA) | Sigma-Aldrich | 8.0826 |
Kaynaklar
- Tam, R. Y., Smith, L. J., Shoichet, M. S. Engineering cellular microenvironments with photo- and enzymatically responsive hydrogels: toward biomimetic 3D cell culture models. Accounts of Chemical Research. 50 (4), 703-713 (2017).
- Xu, X., et al. Bioadhesive hydrogels demonstrating pH-independent and ultrafast gelation promote gastric ulcer healing in pigs. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Zheng, J., et al. Directed self-assembly of herbal small molecules into sustained release hydrogels for treating neural inflammation. Nature Communications. 10 (1), 1604(2019).
- Seif-Naraghi, S. B., et al. Safety and efficacy of an injectable extracellular matrix hydrogel for treating myocardial infarction. Science Translational Medicine. 5 (173), (2013).
- Mao, Q., et al. GelNB molecular coating as a biophysical barrier to isolate intestinal irritating metabolites and regulate intestinal microbial homeostasis in the treatment of inflammatory bowel disease. Bioactive Materials. 19, 251-267 (2022).
- Nan, J., et al. A highly elastic and fatigue-resistant natural protein-reinforced hydrogel electrolyte for reversible-compressible quasi-solid-state supercapacitors. Advanced Science. 7 (14), 2000587(2020).
- Matsumoto, K., Sakikawa, N., Miyata, T. Thermo-responsive gels that absorb moisture and ooze water. Nature Communications. 9 (1), 2315(2018).
- Liu, R., et al. resilient, adhesive, and anti-freezing hydrogels cross-linked with a macromolecular cross-linker for wearable strain sensors. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (35), 42052-42062 (2021).
- Hong, Y., et al. A strongly adhesive hemostatic hydrogel for the repair of arterial and heart bleeds. Nature Communications. 10 (1), 2060(2019).
- Yang, Y., et al. Tissue-integratable and biocompatible photogelation by the imine crosslinking reaction. Advanced Materials. 28 (14), 2724-2730 (2016).
- Ofner, C. M., Bubnis, W. A. Chemical and swelling evaluations of amino group crosslinking in gelatin and modified gelatin matrices. Pharmaceutical Research. 13 (12), 1821-1827 (1996).
- Zhang, Y., et al. A long-term retaining molecular coating for corneal regeneration. Bioactive Materials. 6 (12), 4447-4454 (2021).
- Liang, Y., Li, Z., Huang, Y., Yu, R., Guo, B. Dual-dynamic-bond cross-linked antibacterial adhesive hydrogel sealants with on-demand removability for post-wound-closure and infected wound healing. ACS Nano. 15 (4), 7078-7093 (2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
