Burada, fare plasentasındaki kritik gelişim yollarını in vivo olarak etkili bir şekilde manipüle etmek için zamana özgü bir yöntem açıklıyoruz. Bu, embriyonik gün 12.5'te CRISPR plazmidlerinin hamile barajların plasentalarına enjeksiyonu ve elektroporasyonu yoluyla gerçekleştirilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare In Vivo Plasental Hedefli CRISPR Manipülasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Plasenta, uterodaki memeli gelişimini düzenleyen ve sürdüren önemli bir organdır. Plasenta, anne ve fetüs arasındaki besin maddelerinin ve atıkların transferinden ve büyüme faktörlerinin ve hormonların üretiminden ve verilmesinden sorumludur. Farelerde plasental genetik manipülasyonlar, plasentanın doğum öncesi gelişimdeki spesifik rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Plasental spesifik Cre eksprese eden transgenik fareler farklı etkinliklere sahiptir ve plasental gen manipülasyonu için diğer yöntemler yararlı alternatifler olabilir. Bu makalede, hedeflenen genlerin ekspresyonunu değiştirmek için kullanılabilecek CRISPR gen manipülasyonunu kullanarak plasental gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için bir teknik açıklanmaktadır. Nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak, hamile barajlar embriyonik gün 12.5'te (E12.5) bir laparotomiye tabi tutulur ve bir CRISPR plazmidi bir cam mikropipet tarafından bireysel plasentalara verilir. Plazmid her enjeksiyondan sonra hemen elektropone edilir. Baraj iyileşmesinden sonra, plasentalar ve embriyolar daha sonraki bir zaman noktasında değerlendirilene kadar gelişime devam edebilir. Bu tekniğin kullanımından sonra plasenta ve yavruların değerlendirilmesi, zamana özgü plasenta fonksiyonunun gelişimdeki rolünü belirleyebilir. Bu tür bir manipülasyon, plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun çoklu hastalık bağlamlarında fetal büyüme ve gelişimi nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Giriş
Plasenta, fetüsün gelişiminde rol oynayan önemli bir organdır. Plasentanın ana rolü, temel faktörleri sağlamak ve besinlerin ve atıkların fetüse ve fetüsten transferini düzenlemektir. Memeli plasentaları, fetal-maternal arayüzü oluşturan hem fetal hem de maternal dokudan oluşur ve bu nedenle hem anne hem de fetüsün genetiği fonksiyon1'i etkiler. Plasentanın genetik anomalileri veya bozulmuş fonksiyonu fetal gelişimi büyük ölçüde değiştirebilir. Önceki çalışmalar, plasenta genetiği ve gelişiminin fetüste spesifik organ sistemlerinin değişmiş gelişimi ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle, plasentadaki anormallikler fetal beyin, kalp ve vasküler sistemdeki değişikliklerle bağlantılıdır 2,3,4,5.
Hormonların, büyüme faktörlerinin ve diğer moleküllerin plasentadan fetüse taşınması fetal gelişimde önemli bir rol oynar6. Spesifik moleküllerin plasenta üretimini değiştirmenin nörogelişimi değiştirebileceği gösterilmiştir. Maternal inflamasyon, plasentadaki triptofan (TRP) metabolik gen ekspresyonunu değiştirerek serotonin üretimini artırabilir, bu da daha sonra fetal beyinde serotonin birikimi yaratır7. Diğer çalışmalar, kalp kusurlarının yanı sıra plasenta anormallikleri de bulmuştur. Plasentada anormalliklerin, insanlarda en sık görülen doğum kusuru olan konjenital kalp kusurlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir8. Son zamanlarda yapılan bir çalışma, hem plasentada hem de kalpte benzer hücresel yollara sahip birkaç gen tanımlamıştır. Bozulursa, bu yollar her iki organda da kusurlara neden olabilir9. Plasentadaki kusurlar konjenital kalp kusurlarını şiddetlendirebilir. Plasenta genetiğinin ve fonksiyonunun spesifik fetal organ sistemi gelişimi üzerindeki rolü yeni ortaya çıkan bir çalışma alanıdır.
Fareler hemokoryal plasentalara ve insan plasentalarının diğer özelliklerine sahiptir, bu da onları insan hastalıklarını incelemek için oldukça yararlı modeller haline getirir1. Plasentanın önemine rağmen, şu anda hedefli in vivo genetik manipülasyonların eksikliği vardır. Ayrıca, şu anda nakavtlar veya nakavtlar için plasenta10'daki aşırı ekspresyon veya fonksiyon kazancı manipülasyonlarından daha fazla seçenek bulunmaktadır. Plasentaya özgü manipülasyon için, her biri farklı zaman noktalarında farklı trofoblast soylarında bulunan birkaç transgenik Cre eksprese eden çizgi vardır. Bunlar arasında Cyp19-Cre, Ada / Tpbpa-Cre, PDGFRα-CreER ve Gcm1-Cre11,12,13,14 bulunur. Bu Cre transgenleri verimli olsa da, belirli zaman noktalarında bazı genleri manipüle edemeyebilirler. Plasental gen ekspresyonunu nakavt etmek veya aşırı eksprese etmek için yaygın olarak kullanılan bir diğer yöntem, lentiviral vektörlerin blastosist kültürüne yerleştirilmesidir ve bu da trofoblasta özgü bir genetik manipülasyona neden olur15,16. Bu teknik, gelişimin erken dönemlerinde plasental gen ekspresyonunda sağlam bir değişiklik sağlar. RNA girişiminin in vivo kullanımı plasentada seyrek olarak kullanılmıştır. ShRNA plazmidlerinin yerleştirilmesi, bu makalede açıklanan CRIPSR tekniğine benzer şekilde gerçekleştirilebilir. Bu, plasentadaki PlGF ekspresyonunu başarılı bir şekilde azaltmak için E13.5'te yapılmıştır ve yavru beyin vaskülatürü17 üzerindeki etkileri vardır.
Öncelikle nakavt veya nakavt için kullanılan tekniklere ek olarak, aşırı ekspresyonu indüklemek yaygın olarak adenovirüslerle veya eksojen bir proteinin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Aşırı ekspresyon için kullanılan teknikler değişen başarı oranlarına sahiptir ve çoğunlukla gebeliğin ilerleyen dönemlerinde uygulanmıştır. İnsülin benzeri büyüme faktörü 1'in (IGF-1) plasenta fonksiyonundaki rolünü araştırmak için, IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu indüklemek için adenoviral aracılı plasental gen transferi yapıldı18,19. Bu, E18.5'te fare gebeliğinin geç dönemlerinde direkt plasenta enjeksiyonu ile gerçekleştirildi. Ek seçenekler sağlamak ve Cre-Lox kombinasyon başarısızlıkları, adenovirüslerin olası toksisitesi ve shRNA'nın hedef dışı etkileri gibi yerleşik plasental genetik manipülasyonların olası başarısızlıklarını atlatmak için, plasentanın in vivo doğrudan CRISPR manipülasyonu kullanılabilir20,21,22. Bu model, aşırı ifade modellerinin eksikliğini gidermek ve esnekliğe sahip bir model oluşturmak için geliştirilmiştir.
Bu teknik, shRNA ve CRISPR plazmidlerinin PlGF ekspresyonunu değiştirmek için doğrudan in vivo fare plasentalarına hedeflendiği Lecuyer ve ark.'nın çalışmalarına dayanmaktadır17. Bu teknik, birden fazla zaman noktasında CRISPR manipülasyonu kullanarak plasenta gen ekspresyonunu doğrudan değiştirmek için kullanılabilir; Bu çalışma için E12.5 seçildi. Plasenta bu noktaya kadar olgunlaşmıştır ve manipüle edilebilecek kadar büyüktür, bu da E12.5 üzerine spesifik bir CRISPR plazmidinin yerleştirilmesine izin verir, bu da gebeliğin ortasından sonuna kadar fetal gelişim üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir23,24. Transgenik yaklaşımlardan farklı olarak, ancak viral indüksiyonlara veya RNA girişimine benzer şekilde, bu teknik, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak belirli zaman noktalarında aşırı ekspresyon veya nakavta izin verir, böylece daha önceki değişikliklerden kaynaklanan olası bozulmuş plasentasyon veya embriyonik ölümcüllükten kaçınır. Sadece birkaç plasenta bir çöp içindeki deneysel veya kontrol plazmidini aldığından, yaklaşım iki tür iç kontrole izin verir. Bu kontroller, uygun kontrol plazmidi ile enjekte edilen ve elektropoize edilen ve doğrudan manipülasyon almayan kontrollerdir. Bu teknik, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM) CRISPR plazmidi aracılığıyla fare plasentasındaki IGF-1 geninin aşırı ekspresyonunu oluşturmak için optimize edilmiştir. IGF-1 geni seçildi, çünkü IGF-1, doğumdan önce plasentada öncelikle üretilen fetüse verilen önemli bir büyüme hormonudur25,26. Bu yeni plasenta hedefli CRISPR tekniği, plasenta fonksiyonu ile fetal gelişim arasındaki bağlantıyı tanımlamaya yardımcı olmak için doğrudan manipülasyona izin verecektir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler federal düzenlemelere ve Iowa Üniversitesi politikasına uygun ve uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar ve hayvancılık
- Hayvanları yiyecek ve su ad libitum ile 12 saatlik bir gün ışığı döngüsünde tutun.
- 8-15 haftalık CD-1 dişi fareleri kullanın. E0.5'i tanımlamak için bir çiftleşme fişinin varlığını kullanın.
- E0.5'te, hamile barajları tek başına barındırın.
2. Mikropipetin kalibrasyonu
NOT: Mikropipetin kalibrasyonu mümkünse ameliyattan önce yapılmalıdır.
- Mikropipeti yapmadan ve kalibre etmeden önce, tüm plazmidleri DNaz içermeyen suda önerilen konsantrasyona (0,1 μg/μL) kadar seyreltin. Plazmidi uygun şekilde seyreltilmiş Hızlı Yeşil boya (PBS'de 1 μg / μL) ile karıştırın (nihai plazmid konsantrasyonu: 0.06 μg / μL).
- Dış çapı 1,5 mm ve iç çapı 0,86 mm olan 10 cm'lik cam kılcal damarları kullanarak mikropipetleri mikropipet çektirme makinesi ile çekin.
- Bir mikropipetin ucunu (2-3 mm) steril forseps ile dikkatlice kırın.
- Mikropipeti bir mikroenjektöre bağlı bir mikro kılcal uca yükleyin. Mikroenjektörün mikroenjeksiyon makinesine takılı olduğundan ve mikropipeti kalibre etmek için yeterli azot seviyeleri olduğundan emin olun.
- Mikropipet mikro enjektöre bağlandıktan sonra, kalibrasyonu gerçekleştirmek için Hızlı Yeşil boya çözeltisi ile yükleyin (PBS'de 1 μg / μL). Mikropipeti, yaklaşık 3,5 μL'lik bir hacim enjekte edecek şekilde kalibre edin.
NOT: Her mikropipet biraz farklı olacaktır. Enjeksiyon sırasında plasentaya zarar vermemek için, enjeksiyon süresi 0.5-1.5 s arasında ayarlanmalıdır. Basınç 1-8.5 psi arasında ayarlanmalıdır. Her mikropipeti ayrı ayrı kalibre edin; Mikropipet bu parametreler dahilinde kalibre edilemiyorsa, kullanılmamalıdır.
3. Cerrahi (Şekil 1A)
NOT: Hazırlamak için, hem preparat hem de cerrahi alanların yüzeylerini% 70 etanol ile temizleyin. Hazırlık alanına emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyat alanında, bir ısıtma yastığı yerleştirin ve ardından bunun üzerine emici bir alt ped yerleştirin. Ameliyattan önce tüm aletleri sterilize edin. Barajın anestezi altında kaldığı süre 1 saatin altında olmalıdır.
- Anestezi
- Ameliyattan 30 dakika ila 1 saat önce gebe barajına 5 mg / kg NSAID (meloksikam) veya başka bir onaylanmış analjezik uygulayın.
- Hamile barajı bir izofluran buharlaştırıcısına bağlı bir indüksiyon odasına yerleştirin.
- Buharlaştırıcıyı %4 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene ayarlayın.
- Anestezi, bir ayak parmağı sıkışmasına yanıt verilmemesi ve solunum hızının azalması ile doğrulandıktan sonra, barajı indüksiyon odasından hazırlık alanına çıkarın.
- Ameliyat hazırlığı
- Hazırlık alanında, barajı sırtüstü bir burun konisi ile yerleştirin.
- Baraj burun konisindeyken buharlaştırıcıyı %2 izofluran ve 3,5 L/dak oksijene düşürün.
- Barajın karnını iyice tıraş edin ve fazla kürkü çıkarın. Tıraş edilmiş karın bölgesini povidon çözeltisi ve% 70 etanol ile steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak üç kez alternatif olarak kaplayın. Povidon çözeltisinin son katını uygulayın. Kornea kurumasını önlemek için, barajın her iki gözünün üzerine yapay gözyaşı jeli yerleştirin (Şekil 2A, B).
- Hazırlık yaptıktan sonra, burun konisi ile barajı belirlenen ameliyat alanına taşıyın.
- Uterin laparotomi
NOT: Cerrahi işlem boyunca steril eldiven kullanın. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.- Ameliyat alanında, baraj sırtını yerleştirin ve burun konisini bantla yerine sabitleyin. Emici pedin altındaki ısıtma yastığını 45 °C'ye ayarlayın.
- Forseps ve makas kullanarak, cilt boyunca yaklaşık 2 cm'lik bir orta hat kesisi yapın. Cildi çadırlamak için forseps kullanın ve cilde dikey bir kesi yapın. Bundan sonra, uterus boynuzlarını ortaya çıkarmak için peritondan benzer büyüklükte bir kesi daha yapın. Forseps kullanarak, dikey insizyonu yaparken peritona çadır uygulayın (Şekil 2C, D).
NOT: Peritonun kesilmesi sırasında düzgün bir şekilde çadır kurulmaması, bağırsakların ölümcül bir insizyonuna yol açabilir. - Karın yanlarına bastırarak uterus boynuzlarına kesiden hafifçe masaj yapın. Bunu, uterusu alet kullanmadan dikkatlice yönlendirerek, kazara yaralanmayı önlemek için sadece parmaklarınızı kullanarak yapın. Açıkta kalan uterusu, barajın karnını kaplayan steril bir cerrahi örtünün üzerine yerleştirin ve gerektiğinde kullanımdan önce 30 ° C'ye ısıtılabilen steril salin damlaları ile ameliyat boyunca nemli tutun (Şekil 2E, F).
NOT: Rahim boynuzları Wang ve ark.27'de tarif edildiği gibi tanımlanabilir. - Rahim açığa çıktıktan sonra, manipülasyon için üç çift plasenta seçin.
NOT: Plasentalar Elmore ve ark.24 tarafından tanımlandığı gibi tanımlanabilir. Embriyoların hayatta kalmasını en üst düzeye çıkarmak için, 6'dan fazla plasenta tedavi edilmemelidir. 12'den az embriyo varsa, 4'ten fazla plasenta enjekte edilmemelidir. İki bitişik plasenta seçin, böylece biri bir kontrol enjeksiyonu ve diğeri deneysel plazmid alır. İki bitişik plasentanın kullanılması, uterustaki benzer yerlerdeki plasentaların daha iyi karşılaştırılmasını sağlar ve ayrıca hayatta kalma oranının artmasını sağlar. Seçilen plasental çiftler rastgele seçilir ve her iki uterus boynuzu boyunca aralıklı olarak yerleştirilir (Şekil 1B). - Plasenta manipülasyonlarının yerini ve embriyoların uterus boynuzları içindeki organizasyonunu kaydedin, böylece embriyolar ve plasentalar toplama sırasında tanımlanabilir, çünkü bir baraj hem kontrol hem de deneysel olarak tedavi edilen plasenta / embriyoları taşıyacaktır.
- Plasental enjeksiyon ve kontrol plazmidinin elektroporasyonu
NOT: Aseptik bir tekniği sürdürmek için, kullanmadan önce elektroporasyon küreklerini ve mikro enjektörünü soğuk bir sterilant ile sterilize edin. Steril olmayan herhangi bir yüzeye temas ederse eldivenleri değiştirin.- Kalibre edilmiş mikropipeti kullanarak, üç enjeksiyon için yeterli miktarda uygun kontrol plazmidini yükleyin. Tüm enjeksiyonları, desidua (beyaz) ve kavşak bölgesi (koyu kırmızı) arasındaki plasentaya lateral olarak ~ 0.5 mm derinlikte gerçekleştirin (Şekil 3A-F).
- Üç kontrol plasentanına enjeksiyon yapın.
NOT: Plazmidlerin mikropipet ile çapraz kontaminasyonunu önlemek için deneysel enjeksiyonlardan önce tüm kontrol plazmid enjeksiyonlarını gerçekleştirin. Bu, aynı mikropipetin kullanılmasına izin verecektir, çünkü mikropipetlerin ve kalibrasyon süresinin değiştirilmesi ameliyat süresini önemli ölçüde artırır ve barajın sağkalımını azaltır. - Kontrol plazmid enjekte edilen plasentaların elektroporasyonunu enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde gerçekleştirin.
- Elektroporasyon için, bir elektroporasyon makinesine bağlı bir çift 3 mm'lik kürek kullanın. CRISPR birleştirme verimliliğini ve embriyoların yaşayabilirliğini sağlamak için aşağıdaki elektroporasyon ayarlarını kullanın: 2 darbe, 30 V, 30 ms darbe, 970 ms darbe kapalı, tek kutuplu.
- Enjeksiyondan sonra, ancak elektroporasyondan hemen önce, salini uterus duvarındaki üç bölgeye ve küreklere bir damlalık veya şırınga ile tam olarak uygulayarak, steril salin ile temas yerlerini kaplayın.
- Plasentanın lateral taraflarındaki elektroporasyon küreklerini yavaşça bastırın. Anot küreğini enjeksiyon bölgesine ve katotu tam karşısına yerleştirin (Şekil 4A-C).
- Elektroporasyon makinesindeki darbeye basın ve elektroporasyon küreklerini çıkarmadan önce iki darbenin tamamlanmasını bekleyin.
NOT: Nabızlar sırasında kürekler ve plasenta arasında genellikle az miktarda beyaz köpük görülür. Bu gerçekleşmezse, daha fazla kullanmadan önce pedallardan gelen voltajı bir voltmetre ile kontrol edin. Voltmetre üzerindeki okuma elektroporasyon voltajı ayarına uymuyorsa, kürekler işlevsizdir.
- Plasental enjeksiyon ve deneysel plazmidin elektroporasyonu
- Adım 3.4.1'deki aynı talimatları izleyin. Adım 3.4.2'ye gidin. Kontrol plazmidi yerine deneysel plazmid kullanımı.
- Enjeksiyondan sonraki 2 dakika içinde üç deneysel enjekte plasentanın hepsinin elektroporasyonunu gerçekleştirin. Bu, kontrol plazmidleri ile enjekte edilenlerle aynı şekilde yapılmalıdır. 3.4.4 adımını izleyin. adım 3.4.7'ye gidin.
- Ameliyatın tamamlanması
- Plasental manipülasyon tamamlandıktan sonra, uterus boynuzlarına sadece parmaklarınızı kullanarak karın boşluğunun içine nazikçe masaj yapın (Şekil 5A).
- İlk olarak, 13 mm 3/8c iğne alaşımı ile 45 cm uzunluğunda kaplamalı ve örgülü çözünebilir dikişler kullanarak periton tabakası üzerinde çift düğümlü tek dikişler uygulayın. Dikişleri birbirinden 2-3 mm aralıklarla yerleştirin (Şekil 5B).
- Periton tabakasını diktikten sonra, cildi çözülebilir dikişlerle dikin. Barajın dikişi geri alamamasını sağlamak için tek dikişleri 2-3 mm arayla üçlü düğümleyin (Şekil 5C).
- Dikiş tamamlandıktan sonra, izofluran'ı% 1'e ve oksijeni 3.5 L / dak'ya ayarlayın ve ciltteki dikişlere doku yapıştırıcısı uygulayın (Şekil 5D).
NOT: Doku yapıştırıcısı isteğe bağlıdır, ancak baraj çiğneme nedeniyle insizyonun tekrar açılmasını önlemek için önerilir. - Doku yapıştırıcısı kuruduğunda, buharlaştırıcıyı kapatın ve barajı ameliyat alanından çıkarın. Barajı sırtındaki destekleyici bir kafese yerleştirin.
4. Ameliyat sonrası bakım ve izleme
- Ameliyatın acil komplikasyonlarını önlemek için hamile barajının gözetim altında temiz bir kafeste en az 30 dakika iyileşmesine izin verin. Tamamen ambulatuvar olana ve yardım almadan ayaklarının üzerine dönene kadar gözlemleyin. Ameliyat sonrası barajı tek başına barındırın.
- Embriyo toplanmasına kadar kurumsal postoperatif bakım ve takibi takip edin. Baraj ağırlığını kaydedin ve dikişleri ve kesi yerini günlük olarak izleyin.
5. E14.5 plasenta toplanması
- E14.5'te, barajı bir ketamin / ksilazin kokteyli (1 mg / mL ketamin ve 0.1 mg / mL ksilazin) ile derinlemesine uyuşturun ve ardından barajı servikal olarak yerinden çıkarın.
- Barajın karnına makasla V şeklinde bir kesi yapın ve uterusu çıkarın. Hemen buz üzerinde 5 cm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Forseps kullanarak, embriyoyu ve ilgili plasentayı uterustan dikkatlice çıkarın.
NOT: Ameliyat sırasında hangisinin doğrudan manipülasyon aldığını belirlemek için embriyonun yerinin ve uterus boynuzlarındaki ilgili plasentanın kaydını tutun. - Plasenta ağırlıklarını kaydedin. RNAse içermeyen forseps ve tıraş bıçağı kullanarak, plasentayı orta çizginin yarısına kadar kesin. Bir yarısını 4 ° C'de% 4 PFA'ya koyun. Kalan yarısını tekrar ikiye bölün ve kalan iki çeyreği -80 ° C'de, biri RNA depolama reaktifi olan iki tüpte saklayın.
NOT: Embriyolar ve diğer maternal dokular, gelecekte kullanılmak üzere koleksiyondan -80 ° C'de saklanabilir.
6. Plasental gen ekspresyon analizi
- RNA depolama reaktifinde -80 ° C'de depolanan plasentanın çeyreğini kullanın.
- RNA izolasyonu için Trizol yöntemini, RNA konsantrasyonu için bir spektrofotometreyi, bir cDNA sentez kitini ve SYBR Green Master Mix28 ile qPCR'yi kullanarak Elser ve ark.'da açıklandığı gibi qPCR için plasentaları işleyin. Elser ve ark.'da atıfta bulunulan Turbo DNAfree kiti DNAse yerine, numunelerin kirletici madde içermediğinden emin olmak için Trizol RNA izolasyonundan sonra bir RNAcleanup kiti kullanın28.
NOT: Trizol için malzeme güvenlik bilgi formunu (MSDS) okuyun ve kimyasal bir duman davlumbazında kullanın. - Kontrol plazmidinin GFP primerleri ile ve deneysel plazmidin BLAST primerleri ile plazmid yerleştirilmesini değerlendirin ( Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Plazmidin varlığını belirlemek için BT değerini kullanın.
NOT: 35'in üzerindeki BT değerleri yanlış pozitiftir ve sadece 35'in altındakiler plazmidin başarıyla yerleştirildiğinin pozitif bir göstergesi olarak düşünülmelidir. - Temizlik geni 18'lere normalleştirilmiş IGF-1 plasental ekspresyonunu değerlendirin (Ek Tablo 1'de listelenen primerler). Katlama değişimini hesaplamak için ddCT yöntemini kullanın ve ardından deneysel numunelerin normalleştirilmiş kıvrım değişimini kontrol numunelerinin ortalama kıvrım değişimine hesaplayın.
7. Plasental protein seviyesi analizi
- Plasentanın -80 ° C'de depolanan çeyreğini kullanın. Dokuyu, son pH'ı 7.4 olan diH 2 O'da 11.5 mM Tris HCl, 5 mM MgCl2 ve 10 mM proteaz inhibitöründen yapılmış bir tampon çözeltisinde homojenizeedin. Dokuyu parçalamak için elde taşınan bir homojenizatör ve havane kullanın.
NOT: Numune, tampon hacminin %10'unu geçmemelidir. - Homojenize numuneleri tamponda 1:12'de seyreltin, böylece bir bisinkoninik asit testi (BCA) kitinin tespit edilebilir aralığında olurlar. BCA testini üreticinin talimatlarına göre yapın ve bir plaka okuyucu kullanarak toplam proteini ölçün.
- BCA testini yaptıktan sonra, tüm numuneleri, Gümüşoğlu ve ark.29'da yapıldığı gibi, IGF-1 ELISA için aynı toplam protein konsantrasyonu olan 2 mg / mL'ye normalleştirin.
- IGF-1 ELISA'yı üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirin ve standart bir konsantrasyon eğrisi kullanarak IGF-1 protein seviyelerini bir plaka okuyucu ile ölçün.
8. Floresan in situ hibridizasyon etiketlemesi kullanarak mekansal CRIPSR doğrulaması
- Plasenta yarımları 1-3 gün boyunca 4 ° C'de% 4 PFA'da uygun şekilde sabitlendikten sonra, optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğinde dondurmadan önce 4 ° C'de% 20 sakaroza taşıyın.
- OCT'ye gömülü plasenta yarımlarını -20 ° C'lik bir kriyostatta seri olarak 10 μm bölümlere ayırın ve etiketlenecek slaytlara yerleştirin. Plasenta yarımlarını, üç alt bölgenin tümü görünecek şekilde bölümlere ayırın. Slaytları yerinde hibridizasyon için kullanılana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Üreticinin protokollerini izleyerek floresan in situ hibridizasyon (FISH) etiketlemesi gerçekleştirin. Bir slaydı bir dCas9-3xNLS-VP64 probu ve aynı plasentanın ikinci bir "kardeş" slaydını bir Prl8a8 probu ile melezleştirin.
NOT: dCas9-3xNLS-VP64 probu, aşırı ekspresyon plazmidinin varlığını algılar. Prl8a8 probu, plasentanın alt bölgelerinin tanımlanabilir olmasını sağlayan kavşak bölgesinin spongiotrofoblastlarını vurgular. Bu iki prob, çok kanallı floresanın plasentalardaki yeşil otofloresan ile karışmasını önlemek için ayrı "kardeş" slaytlarda etiketlenmiştir. - Her iki probu da algılama boyası (Opal 620) ile etiketleyin. Üreticinin FISH protokolünü tamamladıktan sonra, DAPI montaj ortamını uygulayın ve slayta bir kapak fişi yerleştirin. Kapak kapağını şeffaf oje ile kapatın.
- Slaytları dik bileşik floresan mikroskobunda görüntüleyin ve uygun bir görüntü işleme yazılımı kullanarak işleyin. Burada CellSens yazılımı kullanıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Genel prosedür sonuçları (Şekil 6)
Çalışmada, manipüle edilmiş üç grup vardı. Bunlar arasında genel bir CRISPR Cas9 kontrol plazmidi (Cas9 Kontrolü), bir aktivasyon kontrolü CRISPR plazmidi (Act Control) veya bir IGF-1 SAM aktivasyon plazmidi (Igf1-OE) ile enjekte edilen plasentalar vardı. Cas9 Kontrolü nakavt plazmidler için daha uygundur ve aktivasyon kontrolü aşırı ekspresyon/aktivasyon plazmidleri için daha uygundur. Plasentaların enjeksiyon ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Plasenta fetal büyümenin birincil düzenleyicisidir ve daha önce de belirtildiği gibi, plasental gen ekspresyonundaki veya fonksiyonundaki değişiklikler fetal gelişimi önemli ölçüde etkileyebilir6. Burada özetlenen protokol, nispeten gelişmiş bir cerrahi yaklaşım kullanarak fare plasentasının hedefli bir in vivo CRISPR manipülasyonunu gerçekleştirmek için kullanılabilir. Bu teknik, daha ileri çalışmalar için kullanılabilecek canlı embriyoların ve bunlara karşılık gelen plasentaların önemli...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını kabul etmektedir: R01 MH122435, NIH T32GM008629 ve NIH T32GM145441. Yazarlar, Dr. Val Sheffield ve Dr. Calvin Carter'ın Iowa Üniversitesi'ndeki laboratuvarlarına ameliyathane ve ekipmanlarının kullanımı için ve ayrıca Dr. Eric Van Otterloo, Dr. Nandakumar Narayanan ve Dr. Matthew Weber'e mikroskopi konusundaki yardımları için teşekkür eder. Yazarlar ayrıca Dr. Sara Maurer, Maya Evans ve Sreelekha Kundu'ya pilot ameliyatlardaki yardımları için teşekkür eder.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml Tüpler | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| Thermo Fisher Scientific | % 4 Paraformeldhyde (PFA). | ||
| 96 Kuyu plakası | Cornings | 3598 | BCA kiti için |
| Emici Alt Pedler | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Aktivasyon Kontrolü Plazmid | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-437275 | Seyreltme için sağlanan dnoz içermeyen su |
| AMV Ters Transkriptaz | New England Biolabs | M0277L | cDNA sentezi için kullanın |
| Anestezik Gaz Buharlaştırıcı | Vetamac | VAD-601TT | VAD-kompakt buharlaştırıcı |
| Yapay Gözyaşı Jeli | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| BCA Protein Test Kiti | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Protein miktar tayini |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | El tipi doku homojenizatörü |
| CellSens Yazılımı | Olympus | V4.1.1 | FISH görüntülerine görüntü işleme. |
| Santrifüj 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Plakalı santrifüj |
| Kloroform | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | RNA izolasyonu |
| Pamuk Uçlu Aplikatörler | ProAdvantage | 77100 | Kullanmadan önce sterilize edin |
| CRISPR/Cas9 Kontrol Plazmidi | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-418922 | Seyreltme için sağlanan dnoaz içermeyen su |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Diseksiyon Mikroskobu | Leica | M125 C | Nekroskopi sonrası görüntüleme için kullanılır |
| Çözünebilir | Sütürler Med Vet International | J385H | |
| Damıtılmış Su | Gibco | 15230162 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Kalsiyum; (-) Magnezyum |
| ECM 830 Elektro Elektroporatör (Elektroporasyon Makinesi) | BTX Harvard Aparatı | 45-0662 | Yalnızca jeneratör |
| Elektrikli Tıraş Bıçağı | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Elektroporasyon kürekleri / Cımbız | BTX Harvard Aparatı | 45-0487 | 3 mm çaplı kürekler; teller dahildir |
| Gömme Kaseti: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Plasenta gömme kasetleri |
| Etanol | Thermo Fisher Scientific | 268280010 | |
| F-Hava Bidonları | Penn Veteriner Malzemeleri A.Ş | BIC80120 | Fazla izofluran filtresi |
| Hızlı Yeşil Boya FCF | Sigma | F7252-5G | 1 & mu'ya çözün; g / ml ve filtre; Işıktan koruyun |
| Filtre tabanlı mikroplaka fotometre (plaka okuyucu) | Fisher Scientific | 14377576 | BCA ve ELISA |
| forseps | VWR | 82027-386 | İnce uçlar, düz, tırtıklı |
| Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10 | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Cam Kılcal Damarlar - Borosilikat Cam (Mikropipet) | Sutter Aleti | B150-86-10 | OD: 1.5 mm, İç Çap: 0.86 mm, 10 cm uzunluk |
| Halt Proteaz ve Fosfotaz inhibitör kokteyli (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Protein homojenizasyon tamponu |
| Isıtma Yastığı | Thermotech | S766D | Dijital Nemli Isıtma Yastığı |
| Kanama Durdurucular | VWR | 10806-188 | Tam surrated çene; kavisli |
| Sıcak Su Banyosu | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plazmid (m1) | Santa Cruz Biyoteknoloji | sc-421056-ACT | Seyreltme için sağlanan dnaz içermeyen su |
| İndüksiyon Odası | Vetamac | 941443 | Belirli bir litre boyutu gerekmez |
| İzofluran | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| İzoproponal/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | RNA izolasyonu |
| Ketamin HCl 100mg / ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2 / Magneisum Klorür | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Protein homojenizasyon tamponu |
| MicroAmp & trade; Barkodlu Optik 384 Kuyulu Reaksiyon Plakası | Fisher Scientific | 4309849 | Barkodlu plakalar gerekli değildir |
| Mikrokılcal Uç | Eppendorf | 5196082001 | BTX Mikroenjektöre Bağlı |
| Mikroenjektör | BTX Harvard Aparatı | 45-0766 | Paslanmaz Çelik Pipet Tutucu, 130 mm Uzunluk, 1 ila 1,5 mm Pipetler için |
| Microject 1000A (Enjeksiyon Makinesi) | BTX Harvard Aparatı | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus Sistem |
| Mikropipet Çektirme Modeli P-97 | Sutter Aleti | P-97 | Alevli/Kahverengi tip mikropipet çektirme |
| Mikroplaka Karıştırıcı (Plaka Çalkalayıcı) | scilogex | 822000049999 | |
| Fare/Sıçan IGF-I/IGF-1 Kantikin ELISA | Kiti R & D Systems | MG100 | |
| İğneler | BD - Becton, Dickson ve Şirket | 305106 | 30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm) |
| Azot Tankı | Linde | 7727-37-9 | Herhangi bir iç gaz |
| Steroid Olmayan Antienflamatuar İlaç (NSAID) | Norbrook Laboratories Limited NDC | 55529-040-10 | Meloksikam |
| Burun Konisi | Vetamac gibi analesjik | 921609 | 9-14 mm |
| Opal 620 tespit boyası | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | FISH için kullanılır |
| Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) Bileşik | Sakura | 4583 | |
| Oksijen Tankı | Linde | 7782 - 44 - 7 | Tıbbi sınıf oksijen |
| Havaneli | USA Scientific Inc | 14155390 | |
| Povidon-İyot Çözeltisi, %5Avrio | Health LP | NDC 67618-155-16 | |
| Güç SYBR ve ticaret; Yeşil PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | qPCR |
| Rastgele Heksamerler için Kullanım (Rastgele Primerler) | New England Biolabs | S1330S | cDNA sentezi için kullanın |
| Tıraş Bıçağı | Grainger | 26X080 | |
| RNA Temizleme Kiti & Yoğunlaştırıcı | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| RNAscope kiti v.2.5 | Gelişmiş Hücre Teşhisi | 323100 | Floresan in situ hibridizasyon için gerekli tüm reaktifleri içerir. Problar ayrı satılır. |
| RNAscope ve ticaret; Prob- mm-prl8a8-c2 | gelişmiş hücre teşhisi | 528641-C2 | |
| RNAkapsam ve ticaret; Prob- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Gelişmiş Hücre Teşhisi | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Yerinde hibridizasyon için kuru fırın |
| Makas | VWR | 82027-578 | Diseksiyon Makası, Keskin Uç, 4¹/? |
| Sodyum Klorür (Salin) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Steril, % 0.9 |
| Sodyum Sitrat, Trisodyum Tuzu, Dihidrat, [Sitrik Asit, Trisodyum Dihidrat] | Araştırma Ürünü Uluslararası | 03-04-6132 | |
| Sodyum Hidroksit 1N Konsantresi, Fisher | Chemical Fisher Scientific | SS277 | Protein homojenizasyon tamponu |
| Buharlı Pişirici | Bella | B00DPX8UBA | |
| Steril Cerrahi Örtü | Busse | 696 | Kullanmadan önce sterilize edin |
| Superfrost Plus Mikroskop Slaytları | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Kapak Camı 24x60 | Leica | 3800160 | |
| Şırıngaları | BD - Becton, Dickson ve Company | 309659 | BD Luer Kayma Uçlu Şırınga steril, tek kullanımlık, 1 mL |
| Termo Bilim ve Ticaret; Canlandırıcı ve ticaret; Nanodrop ve ticaret; WiFi ve Qubit &trade özellikli bir Spektrofotometre; 4 Florometre | Fisher Scientific | 13-400-525 | Bu konfigürasyon Qubit 4 florometre ile birlikte gelir. Kübit nicelemesi gerekli değildir. |
| Doku Yapıştırıcı | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | 1M. Protein homojenizasyon tamponu |
| TRIzol & trade; Reaktif | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | RNA izolasyonu |
| TSA Tampon Paketi | Gelişmiş Hücre Teşhisi | 322810 | Opal 620 algılama boyasını seyreltmek için kullanılır |
| Evrensel F-Devresi | Vetamac | 40200 | Buharlaştırıcı ve buharlaştırıcı aksesuarlarına takılı |
| Dik Bileşik Floresan Mikroskobu | Olympus | BX61VS | BALIK görüntüleme |
| için kullanılırDAPI Vektör | Laboratuvarları | H-1200 | Lamel montaj ortamı |
| ViiA™ 384 Kuyulu Bloklu 7 Gerçek Zamanlı PCR Sistemi | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Bu, SYBR 384 kuyulu blok tespiti içindir. TaqMan ve/veya daha küçük bloklar mevcuttur |
| Islak n Yabani Oje, Vahşi Parlaklık, Şeffaf Tırnak Koruyucu, Tırnak Rengi, | Amazon | C450B | |
| , Ksilazin, 20mg/ml | Anased | 343730_RX |
Kaynaklar
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
- Rosenfeld, C. S. The placenta-brain-axis. Journal of Neuroscience Research. 99 (1), 271-283 (2021).
- Maslen, C. L. Recent advances in placenta-heart interactions. Frontiers in Physiology. 9, 735(2018).
- Kundu, S., Maurer, S. V., Stevens, H. E. Future horizons for neurodevelopmental disorders: Placental mechanisms. Frontiers in Pediatrics. 9, 653230(2021).
- Woods, L., Perez-Garcia, V., Hemberger, M. Regulation of placental development and its impact on fetal growth-new insights from mouse models. Frontiers in Endocrinology. 9, 570(2018).
- Goeden, N., et al. Maternal Inflammation disrupts fetal neurodevelopment via increased placental output of serotonin to the fetal brain. Journal of Neuroscience. 36 (22), 6041-6049 (2016).
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Wilson, R. L., et al. Analysis of commonly expressed genes between first trimester fetal heart and placenta cell types in the context of congenital heart disease. Scientific Reports. 12 (1), 10756(2022).
- Renaud, S. J., Karim Rumi, M. A., Soares, M. J. Review: Genetic manipulation of the rodent placenta. Placenta. 32, S130-S135 (2011).
- Wenzel, P. L., Leone, G. Expression of Cre recombinase in early diploid trophoblast cells of the mouse placenta. Genesis. 45 (3), 129-134 (2007).
- Zhou, C. C., et al. Targeted expression of Cre recombinase provokes placental-specific DNA recombination in transgenic mice. PLoS One. 7 (2), e29236(2012).
- Wattez, J. S., Qiao, L., Lee, S., Natale, D. R. C., Shao, J. The platelet-derived growth factor receptor alpha promoter-directed expression of cre recombinase in mouse placenta. Developmental Dynamics. 248 (5), 363-374 (2019).
- Nadeau, V., et al. Map2k1 and Map2k2 genes contribute to the normal development of syncytiotrophoblasts during placentation. Development. 136 (8), 1363-1374 (2009).
- Chakraborty, D., Muto, M., Soares, M. J. Ex vivo trophoblast-specific genetic manipulation using lentiviral delivery. BioProtocol. 7 (24), e2652(2017).
- Okada, Y., et al. Complementation of placental defects and embryonic lethality by trophoblast-specific lentiviral gene transfer. Nature Biotechnology. 25 (2), 233-237 (2007).
- Lecuyer, M., et al. a placental marker of fetal brain defects after in utero alcohol exposure. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 44(2017).
- Jones, H. N., Crombleholme, T., Habli, M. Adenoviral-mediated placental gene transfer of IGF-1 corrects placental insufficiency via enhanced placental glucose transport mechanisms. PLoS One. 8 (9), e74632(2013).
- Jones, H., Crombleholme, T., Habli, M. Regulation of amino acid transporters by adenoviral-mediated human insulin-like growth factor-1 in a mouse model of placental insufficiency in vivo and the human trophoblast line BeWo in vitro. Placenta. 35 (2), 132-138 (2014).
- Song, A. J., Palmiter, R. D. Detecting and avoiding problems when using the Cre-lox system. Trends in Genetics. 34 (5), 333-340 (2018).
- Chuah, M. K., Collen, D., VandenDriessche, T. Biosafety of adenoviral vectors. Current Gene Therapy. 3 (6), 527-543 (2003).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: Lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Elmore, S. A., et al. Histology atlas of the developing mouse placenta. Toxicologic Pathology. 50 (1), 60-117 (2022).
- Sferruzzi-Perri, A. N., Sandovici, I., Constancia, M., Fowden, A. L. Placental phenotype and the insulin-like growth factors: Resource allocation to fetal growth. The Journal of Physiology. 595 (15), 5057-5093 (2017).
- Agrogiannis, G. D., Sifakis, S., Patsouris, E. S., Konstantinidou, A. E. Insulin-like growth factors in embryonic and fetal growth and skeletal development (Review). Molecular Medicine Reports. 10 (2), 579-584 (2014).
- Wang, L., Jiang, H., Brigande, J. V. Gene transfer to the developing mouse inner ear by in vivo electroporation. Journal of Visualized Experiments. (64), e3653(2012).
- Elser, B. A., et al. Combined maternal exposure to cypermethrin and stress affect embryonic brain and placental outcomes in mice. Toxicological Sciences. 175 (2), 182-196 (2020).
- Gumusoglu, S. B., et al. Chronic maternal interleukin-17 and autism-related cortical gene expression, neurobiology, and behavior. Neuropsychopharmacology. 45 (6), 1008-1017 (2020).
- Liu, F., Huang, L. Electric gene transfer to the liver following systemic administration of plasmid DNA. Gene Therapy. 9 (16), 1116-1119 (2002).
- Kalli, C., Teoh, W. C., Leen, E. Introduction of genes via sonoporation and electroporation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 818, 231-254 (2014).
- Wu, W., et al. Efficient in vivo gene editing using ribonucleoproteins in skin stem cells of recessive dystrophic epidermolysis bullosa mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (7), 1660-1665 (2017).
- Nakamura, H. Electroporation and Sonoporation in Developmental Biology. , Springer. Tokyo, Japan. (2009).
- Bond, A. M., et al. Differential timing and coordination of neurogenesis and astrogenesis in developing mouse hippocampal subregions. Brain Sciences. 10 (12), 909(2020).
- Kojima, Y., Tam, O. H., Tam, P. P. Timing of developmental events in the early mouse embryo. Seminars in Cell & Developmental Biology. 34, 65-75 (2014).
- Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of primary mouse trophoblast cells and trophoblast invasion assay. Journal of Visualized Experiments. (59), e3202(2012).
- Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference efficiently induces specific and reversible gene silencing in human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
- Dai, Z., et al. Inducible CRISPRa screen identifies putative enhancers. Journal of Genetics and Genomics. 48 (10), 917-927 (2021).
- Ursini, G., et al. Placental genomic risk scores and early neurodevelopmental outcomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. (7), e2019789118(2021).
- Smajdor, A. Ethical challenges in fetal surgery. Journal of Medical Ethics. 37 (2), 88-91 (2011).
- Antiel, R. M. Ethical challenges in the new world of maternal-fetal surgery. Seminars in Perinatology. 40 (4), 227-233 (2016).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
