Dorsal kök gangliyonları ve Schwann hücrelerinin kokültür sisteminde, periferik sinir sisteminin miyelinasyonu incelenebilir. Bu model, periferik miyelinasyonu gözlemlemek ve ölçmek ve ilgilenilen bileşiklerin miyelin kılıfı üzerindeki etkilerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçan dorsal kök ganglion eksplantları ve schwann hücrelerinin bir kokültüründe periferik aksonların in vitro miyelinasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Miyelinasyon süreci, sinir sisteminde hızlı ve yeterli sinyal iletimini sağlamak için gereklidir. Periferik sinir sisteminde, nöronlar ve Schwann hücreleri, aksonların miyelinasyonunu kontrol etmek için karmaşık bir etkileşime girer. Bu etkileşimin bozuklukları ve miyelin kılıfının parçalanması, enflamatuar nöropatilerin ayırt edici özellikleridir ve nörodejeneratif bozukluklarda ikincil olarak ortaya çıkar. Burada, periferik sinir sistemindeki miyelinasyon sürecini araştırmak, akson-Schwann hücre etkileşimlerini incelemek ve terapötik ajanların her hücre tipi üzerindeki potansiyel etkilerini ayrı ayrı değerlendirmek için periferik aksonların sağlam bir miyelinasyonunu geliştiren dorsal kök gangliyon eksplantları ve Schwann hücrelerinin bir kokültür modelini sunuyoruz. Metodolojik olarak, embriyonik sıçanların (E13.5) dorsal kök ganglionları toplandı, çevre dokularından ayrıştırıldı ve 3 gün boyunca bütün eksplantlar olarak kültürlendi. Schwann hücreleri 3 haftalık yetişkin sıçanlardan izole edildi ve siyatik sinirler enzimatik olarak sindirildi. Elde edilen Schwann hücreleri, manyetik aktive edilmiş hücre sıralama ile saflaştırıldı ve neuregulin ve forskolin ile zenginleştirilmiş koşullar altında kültürlendi. 3 günlük dorsal kök ganglion eksplant kültüründen sonra, askorbik asit içeren bir ortamda bir dorsal kök ganglion eksplantına 30.000 Schwann hücresi eklendi. Miyelinasyonun ilk belirtileri, immünositokimyasal boyamada miyelin bazik proteini için dağınık sinyaller yoluyla kokültürün 10. gününde tespit edildi. 14. günden itibaren, miyelin kılıfları oluşturuldu ve aksonlar boyunca yayıldı. Miyelinasyon, aksonal yoğunluktaki farklılıkları hesaba katmak için miyelinasyon alanı ve akson alanının bir oranı olarak miyelin bazik protein boyaması ile ölçülebilir. Bu model, periferik sinir sisteminin enflamatuar ve nörodejeneratif hastalıklarında demiyelinasyon ve nörodejenerasyon patolojisini ve olası tedavi fırsatlarını anlamak için çok önemli olan in vitro periferik miyelinasyonun çeşitli yönlerini incelemek için deneysel fırsatlar sunmaktadır.
Giriş
Periferik sinir sisteminde (PNS), hızlı bilgi iletimine miyelin sarılı aksonlar aracılık eder. Aksonların miyelinasyonu, elektrik uyarılarının hızlı yayılmasını sağlamak için gereklidir, çünkü sinir liflerinin iletim hızı akson çapı ve miyelin kalınlığı1 ile ilişkilidir. Periferden merkezi sinir sistemine (CNS) duyusal sinyalleme, dorsal kök gangliyonu (DRG) olarak adlandırılan dorsal kökün genişlemesinde bulunan birinci dereceden duyusal nöronların aktivasyonuna dayanır. Miyelin oluşumu ve bakımı için, PNS'deki miyelinleştirici Glia hücreleri olan aksonlar ve Schwann hücreleri arasında sürekli iletişim zorunludur2.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi'ne uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Schwann hücre kültürü
- Schwann hücre kültürü için kaplama
- Hücre kültürü bulaşıklarını steril koşullar altında kaplayın. Her biri iki adet 60 mm doku kültürü (TC) kabına 2 mL% 0.01 poli-L-lizin (PLL) uygulayın ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- PLL'yi çıkarın, TC bulaşıklarını damıtılmış suyla 2 kat yıkayın ve 4 ° C'de gece boyunca 2 mL 1 μg /cm2 laminin ile inkübe edin. TC bulaşıkları aqua dest ile 2 kat yıkayın ve tabakların hava kurumas....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kokültürde miyelinasyon 10, 12, 14, 16, 18 ve 20. günlerde değerlendirildi. DRG eksplantları ve Schwann hücreleri MBP, βIII-tübülin ve DAPI için boyandı. Kokültürdeki aksonal ağ yoğundu ve gözlemin zaman içinde gözle görülür şekilde değişmedi. Miyelinin ilk belirtileri, küçük parçalar şeklinde, 10. günde tespit edildi ve 12. günde arttı (Şekil 2). MBP pozitif alanlar, kültürün 20. gününe kadar zamanla artmıştır. Miyelinasyon, MBP ve βIII-tübülin pozitif alanlarının bir oranı olarak ölçüldü. .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, iki ayrı hücre tipi kültürü, Schwann hücreleri ve dorsal kök gangliyon eksplantlarını birleştirerek in vitro miyelinasyon üretimi için hızlı ve kolay bir protokol sunuyoruz.
Protokolün kritik bir adımı, özellikle kültürün ilk günlerinde DRG eksplantlarının yetiştirilmesidir. DRG, güçlü bir aksonal ağ kurulmadan önce çok kırılgandır ve örneğin inkübatörden çıkarıldığında veya ortam değişimi sırasında çok dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Kuyunun dibinden ayrılan ve ortada y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Prof. Dr. Ralf Gold ve PD Dr. Gisa Ellrichmann'a tavsiye ve destekleri için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, tavşan | Novus Biologicals, Centannial, ABD | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-tübülin, fare | Biolegend, San Diego, ABD | 657402 | |
| Askorbik asit | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | A4403-100MG | |
| B27 takviyesi | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | 17504-044 | |
| Biyosfer Filtre Ucu, 100 & L | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Biyosfer Filtre Ucu, 1250 & L | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Biyosfer Filtre Ucu, 20 & L | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Biyosfer Filtre Ucu, 300 & L | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Sığır serum albümini | Carl Roth, Karlsruhe, Almanya | 8076.4 | |
| Hücre süzgeci, 100 & M | BD Bioscience, Heidelberg, Almanya | 352360 | |
| Santrifüj 5810-R | Eppendorf AG, Hamburg, Almanya | 5811000015 | |
| CO2 İnkübatörü Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Almanya | ||
| Lameller 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Almanya | P231.1 | |
| Kavisli ince forseps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Almanya | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | ||
| Damıtılmış su (Su Arıtma Sistemi) | Millipore, Molsheim, Fransa | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| DPBS (Ca2+ ve Mg2+) yok | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | D8537-6X500ML | |
| Etanol & | VWR, Radnor, ABD | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | F7524 | FCS, Schwann hücre kültürü |
| İnce forseps (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 11252-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | F6886-10MG | |
| Jelatin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | G1393-20ML | |
| Gentamisin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | 5710064 | |
| Keçi anti-fare IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | A11036 | |
| Keçi anti-tavşan IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | A11001 | |
| HBSS (Ca < sup>2 + < / sup> ve Mg < sup> + < / sup>) yok; | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| HERAcell İnkübatörü | Heraeus Instruments, Hanau, Almanya | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| At serumu | Pan-Biotech, Aidenbach, Almanya | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, ABD | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | L2020-1MG | |
| Leibovitz ve akut; s L-15 Orta Thermo | Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| L-Glutamin 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 15000-08 | |
| Mikroskop | Motic, Wetzlar, Almanya | Motic BA 400 | |
| Mikroskop Axio gözlemci 7 | Zeiss, Oberkochen, Almanya | 491917-0001-000 | |
| Mikroskop lamı | VWR, Radnor, ABD | 630-1985 | |
| MiniMACS ayırıcı | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya | 130091632 | |
| MS sütunları | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya | 130-042-201 | |
| Neubauer sayım odası | Asistan, Erlangen, Almanya | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, ABD | 100-03 | |
| Nörobazal ortam | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | N1408 | |
| Normal keçi serumu | Biozol, Eching, Almanya | S-1000 | |
| Nunclon & Delta; çoklu yemekler, 4 kuyulu | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | D6789 | |
| Paraformaldehit | Acros Organics, New Jersey, ABD | ||
| Penisilin / Streptomisin | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Hamburg, Almanya | 4430000018 | |
| Pipetler | Eppendorf AG, Hamburg, Almanya | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | P4707-50ML | |
| Reaksiyon tüpleri, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Reaksiyon tüpleri, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Reaksiyon kapları, 1.5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Güvenlik Kabini S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| Scissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 14083-08 | |
| Serolojik pipet, 10 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Serolojik pipet, 25 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Serolojik pipet, 5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 10094-13 | |
| Stereomikroskop Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Almanya | 495015-0012-000 | |
| Cerrahi makas | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Almanya | 14007-14 | |
| TC çanak 100, hücre + | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| TC kabı 35, hücre + | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| TC kabı 60, hücre + | Sarstedt, Nü mbrecht, Almanya | ||
| Thy-1 Mikro Boncuklar (MACS Kiti) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | X100-500ML | |
| Tripan Mavisi Çözeltisi %0.4 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | ||
| Tripsin (% 2.5), fenol kırmızısı yok | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | 15090-046 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Almanya | 25300-054 | |
| Tip I Kollajenaz | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Almanya | C1639 | |
| Su banyosu tipi 1008 | GFL, Burgwedel, Almanya | 4285 |
Kaynaklar
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
