Yöntem makalesi

İnsan Foliküllerinde Gen İfade Analizleri

DOI:

10.3791/64807

⸱

17 Şubat 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan yumurtalık foliküllerinin dondurulmuş-çözülmüş kortikal dokudan nasıl izole edileceğini özetleyen bir protokol açıklıyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık, farklı hücre tiplerinden oluşan heterojen bir organdır. Folikülogenez sırasında meydana gelen moleküler mekanizmaları incelemek için, proteinlerin lokalizasyonu ve gen ekspresyonu sabit doku üzerinde gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bir insan folikülündeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için, bu karmaşık ve hassas yapı izole edilmelidir. Bu nedenle, Woodruff'un laboratuvarı tarafından daha önce tarif edilen uyarlanmış bir protokol, folikülleri (oosit ve granüloza hücreleri) çevrelerinden ayırmak için geliştirilmiştir. Yumurtalık kortikal dokusu ilk önce iki araç kullanılarak küçük parçalar elde etmek için manuel olarak işlenir: bir doku dilimleyici ve bir doku doğrayıcı. Doku daha sonra en az 40 dakika boyunca% 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile enzimatik olarak sindirilir. Bu çürütme adımı 37 °C ve %5 CO2'de gerçekleştirilir ve her 10 dakikada bir ortamın mekanik pipetlenmesi eşlik eder. İnkübasyondan sonra, izole edilmiş foliküller, mikroskop büyütme altında kalibre edilmiş bir mikrokapiller pipet kullanılarak manuel olarak toplanır. Doku parçalarında foliküller hala mevcutsa, prosedür manuel mikrodiseksiyon ile tamamlanır. Foliküller bir kültür ortamında buz üzerinde toplanır ve fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi damlacıkları içinde iki kez durulanır. Bu sindirim prosedürü, folikül bozulmasını önlemek için dikkatlice kontrol edilmelidir. Foliküllerin yapısı tehlikeye girer girmez veya maksimum 90 dakika sonra, reaksiyon% 10 fetal sığır serumu içeren 4 ° C'lik bir bloke edici çözelti ile durdurulur. Gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) için RNA ekstraksiyonundan sonra yeterli miktarda toplam RNA elde etmek için en az 20 izole folikül (75 μm'nin altında boyutlu) toplanmalıdır. Ekstraksiyondan sonra, 20 folikülden toplam RNA'nın miktarının belirlenmesi ortalama 5 ng / μL'lik bir değere ulaşır. Toplam RNA daha sonra cDNA'ya retrokribe edilir ve ilgilenilen genler RT-qPCR kullanılarak daha fazla analiz edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık, korteks ve stroma içindeki foliküller de dahil olmak üzere fonksiyonel ve yapısal birimlerden oluşan karmaşık bir organdır. Folikülogenez, folikül aktivasyonu, büyümesi ve olgunlaşması süreci, ilkel sessiz bir durumdan döllenebilen ve erken embriyonik gelişimi destekleyen olgun bir foliküle kadar, araştırma1'de yaygın olarak incelenmiştir. Bu fenomeni yönlendiren mekanizmaların çözülmesi, kadınlar için doğurganlık bakımını iyileştirebilir2. Sabit insan dokusu üzerinde yapılan analizler, yumurtalığın fonksiyonel birimleri içinde protein ekspresyonunun ve gen lokalizasyonunun değerlendirilmesine izin verir 3,4. Bununla birlikte, yumurtalık folikülleri içindeki gen ekspresyon seviyelerini doğru bir şekilde değerlendirmek için folikülleri çevreleyen korteksten ayırmak için spesifik tekniklere ihtiyaç vardır. Bu nedenle, önceki bir çalışmada, gen ekspresyonunun doğrudan yumurtalık fonksiyonel biriminden analiz edilmesine izin vermek için bir folikül izolasyon tekniği geliştirilmiştir5. Enzimatik sindirim ve / veya mekanik izolasyonun yanı sıra lazer yakalama mikrodiseksiyonu gibi, bir doku parçası 6,7,8,9 içinde folikül izolasyonuna izin veren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. Folikül izolasyonu, gelişimin her aşamasında foliküllerin gen ekspresyon profillerini değerlendirmek için insan veya hayvan yumurtalık dokusu ile yaygın olarak kullanılmaktadır10,11,12. Bununla birlikte, optimal bir izolasyon prosedürü, folikülün yoğun korteks içindeki kırılgan yapısını dikkate almalı ve bu nedenle herhangi bir hasarı önlemek için dikkatle yapılmalıdır7. Bu makale, Woodruff'un laboratuvarı tarafından tanımlanan bir protokolden uyarlanmış, gen ekspresyon analizleri yapmak için insan foliküllerini dondurulmuş-çözülmüş yumurtalık korteksinden izole etmek için bir prosedürü açıklamaktadır13.

Dondurulmuş insan dokusundan yumurtalık folikülü izolasyonunun ilk adımı çözme işlemidir. Bu işlem, daha önce tarif edildiği gibi, kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun greftlenmesi için kullanılan klinik protokole dayanarak gerçekleştirilir14,15. İşlem, ortamın azalan konsantrasyonlarında yumurtalık korteksi durulayarak kriyoprotektan ajanların uzaklaştırılmasını amaçlamaktadır. Daha sonra, folikülleri almak için enzimatik ve mekanik izolasyondan önce doku parçalanır. Farklı aşamalardaki foliküller, ilgilenenleri izole etmek için yüksek büyütmeli ve kaliteli optiklere sahip bir stereomikroskop kullanılarak ayırt edilebilir. İzole edilen her folikül, mikroskopa entegre edilmiş bir cetvel kullanılarak ölçülür ve foliküller gelişim aşamalarına göre toplanabilir: ilkel foliküller (30 μm), birincil foliküller (60 μm), ikincil foliküller (120-200 μm) ve antral foliküller (>200 μm)16. Foliküllerin morfolojisine göre daha ileri sınıflandırma yapılabilir: primordiyal foliküller bir kat düzleştirilmiş granüloza hücresine (GC) sahiptir, primer foliküller bir kat küboidal GC'ye sahiptir, ikincil foliküller en az iki kat küboidal GC'ye sahiptir ve GC'ler arasında bir boşluğun varlığı antral aşamayı karakterize eder. İlgilenilen foliküller seçildiğinde, RNA ekstraksiyonu gerçekleştirilir. RNA miktarı ve kalitesi, gerçek zamanlı kantitatif polimeraz zincir reaksiyonundan (RT-qPCR) önce değerlendirilir (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje Erasme Hastanesi Etik Kurulu (Brüksel, Belçika) tarafından onaylanmıştır. Bu protokole dahil edilen hastaya 2000 yılında kemoterapiye maruz kalmadan önce fertilitenin korunması için yumurtalık dokusu kriyoprezervasyonu (OTC) uygulandı. Hasta, kalan dondurulmuş dokusunu depolama süresinin sonunda araştırmaya bağışlamak için bilgilendirilmiş yazılı onay imzaladı.

1. Kriyokorunmuş yumurtalık dokusunun çözülmesi

  1. Beş çözme çözeltisi içeren 6 delikli bir plaka hazırlayın. İlk kuyu, Leibovitz-15 besiyeri, 0.1 mol / L sakaroz, 1.5 mol / L dimetil sülfoksit (DMSO) ve% 1 insan serum albümininden (HSA) oluşan 5 mL kriyoprotektan çözeltisi içerir. Bir sonraki kuyucuklar, azalan kriyoprotektan konsantrasyonlarına sahip 5 mL Leibovitz-15 ortamı içerir: 1 mol / L, 0.5 mol / L ve 2 x 0 mol / L DMSO.
    NOT: Kriyoprotektan çözeltisi, doğurganlık kliniğinde kullanılan protokole göre farklılık gösterebilir.
  2. Yumurtalık kortikal parçası içeren bir şişeyi güvenlik kurallarına (kriyojenik eldivenler, koruyucu gözlükler ve kapalı ayakkabılar) uygun olarak sıvı azottan çıkarın ve tüpü 30 sn boyunca oda sıcaklığında (RT) tutun.
  3. Flakonu dikey bir davlumbazın altında açmadan ve doğrudan 6 delikli plakanın ilk kuyucuğuna (buz üzerinde) aktarmadan önce şişeyi RT'de 2 dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın.
  4. Parçayı art arda 6 delikli plakanın her bir kuyucuğuna aktarın, her biri 5 mL Leibovitz-15 ortamında azalan kriyoprotektan konsantrasyonları içerir. Her ortamdaki dokuyu 5 dakika boyunca (buz üzerinde) hafifçe çalkalayın.

2. Folikül izolasyonu

NOT: Tüm deneyler RNase içermeyen malzemeler kullanılarak ve dikey bir başlık altında gerçekleştirilir.

  1. Çözülmüş dokuyu 10 mL diseksiyon ortamı (Leibovitz-15 ortamı, sodyum piruvat [2 mmol / L], L-glutamin [2 mmol / L], HSA [% 0.3], penisilin G [30 μg / mL] ve streptomisin [50 μg / mL]) ile doldurulmuş 2 mm'lik ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Gerekirse dokunun boyutunu bir neşterle ayarlayın.
    NOT: Klinik protokole bağlı olarak, dondurulmuş dokunun boyutu 8 mm x 4 mm x 1 mm ila 4 mm x 2 mm x 1 mm arasında değişebilir. Bu protokol için 4 mm x 2 mm x 1 mm'lik iki şerit kullanılmıştır.
  2. Doku dilimleyicinin üç parçasını yığın, parçayı iki blok arasına koyun ve parçayı bir bıçak kullanarak ikiye bölün, 0,5 mm kalınlığında iki parça elde etmek için bloklar arasında kaydırın.
  3. Parçayı kesmek ve daha küçük parçalar elde etmek için doku doğrayıcıyı kullanın. Gerekirse, doku tamamen parçalanana kadar kalan parçaları bir neşterle manuel olarak kesin.
  4. Parçalanmış dokuyu, % 0.2 kollajenaz ve% 0.02 DNaz ile desteklenmiş 7 mL sindirim ortamı (kültür ortamı [McCoy'un 5A ortamı, 3 mmol / L glutamin,% 0.1 HSA, 30 μg / mL penisilin G, 50 μg / mL streptomisin, 2.5 μg / mL transferrin, 4 ng / mL selenyum ve 50 μg / mL askorbik asit] ile doldurulmuş ızgaralı bir Petri kabına aktarın).
  5. Çanağı inkübatöre% 5 CO2 ve 37 ° C'de koyun. Her 10 dakikada bir, Petri kabını inkübatörden çıkarın ve 1 mL'lik bir pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu yıkayın.
  6. Sindirim ortamında 45 dakikalık inkübasyondan sonra, çanağı 5x-6.3x büyütme aralığına sahip bir stereomikroskop altına yerleştirin ve bir mikrokapiler pipet kullanarak folikülleri alın. İlgilendiğiniz folikülleri seçin ve bir ağız pipeti ile emerek izole edin.
    NOT: Ağız pipetlemesi, boruya malzeme kaybını ve kontaminasyonu önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.
  7. Foliküller bir korteks parçasında sıkışıp kalırsa, folikülleri stromadan serbest bırakmak için korteksi şırıngaların ucuyla sökerek iki 27 G şırınga ile mekanik olarak izole edin.
    NOT: Zarar görmemesi için foliküllere şırıngalarla dokunmayın.
  8. Folikülleri, mikrokapiler ile, 500 μL yağ kültürü (damla başına 1 ila 10 folikül) ile kaplanmış kalibre edilmiş kültür ortamının 15 μL'lik damlalarını içeren 4 delikli bir plakaya aktarın. Bu adım, toplama işlemi sırasında folikül canlılığını korur. İşlemin sonunda, folikülleri her seferinde 5 s boyunca iki kez durulayın, 500 μL yağ kültürü (buz üzerinde) ile kaplanmış iki damla 15 μL fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) halinde durulayın.
  9. Boş bir tüpte ağız pipetini (maksimum 10 μL) kullanarak minimum miktarda PBS ile 20 folikül toplayın ve tüpü buz üzerinde tutun.
    NOT: RNA kararlılığı için, adım 2.8 ve adım 2.9'u buz üzerinde gerçekleştirmek çok önemlidir. Standart RT-qPCR (SYBR Green) için yeterli RNA'ya sahip olmak için yaklaşık 20 folikül (<75 μm) gereklidir.
  10. Sindirim ortamında maksimum 90 dakikalık inkübasyondan sonra, Petri kabına% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş kültür ortamından oluşan fazla miktarda soğuk (4 ° C) bloke edici çözelti (7.5 mL) ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.
    NOT: Bloke edici çözelti, deneyci plakaya yapışan folikülleri veya hasarlı folikülleri (asimetrik şekil veya daha koyu renkli foliküller) gözlemlediği anda eklenebilir. Foliküler hasarı önlemek ve izolasyondan hemen sonra RNA ekstraksiyonu yapmak için folikül izolasyonunun maksimum 2.5 saatlik bir süre içinde yapılması önerilir.

3. RNA ekstraksiyonu

NOT: RNA ekstraksiyonu, bir RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen talimatları izleyerek, elüsyon hacimlerini uyarlayarak gerçekleştirilir.

  1. RNA ekstraksiyon kiti ile birlikte verilen lizis çözeltisinin 100 μL'sini, folikülleri içeren tüpe kimyasal bir başlık altında ekleyerek izole edilmiş folikülleri askıya alın ve foliküllerin yapısını kırmak için yüksek hızda (2.500 rpm / dak) vorteks yapın. Tüpe 50 μL etanol (% 100) ekleyin ve kısa bir süre yüksek hızda vorteks yapın.
    NOT: Lizis tamponu 2-merkaptoetanol ve tiyosiyanik asit içerdiğinden, bu adım kimyasal bir başlık altında dikkatle gerçekleştirilmelidir.
  2. Tüpün toplam hacmini (yaklaşık 160 μL) bir sütun ve bir toplama tüpünden oluşan bir mikrofiltre kartuşu tertibatına aktarın ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin. Kolonu, kit ile birlikte verilen 180 μL yıkama çözeltisi 1 ile yıkayın ve tüpü 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj edin.
  3. Kolona kit ile birlikte verilen 180 μL 2/3 yıkama çözeltisini ekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 10 s boyunca santrifüj yapın. Bu adımı iki kez gerçekleştirin. Filtreyi kurutmak için tüpü 1 dakika boyunca son bir kez santrifüj edin ve kartuşun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.
  4. Nükleik asitlerin elüsyonunu iki adımda gerçekleştirin:
    1. İlk olarak, filtreye 8 μL ılık elüsyon çözeltisi (75 ° C) ekleyin, RT'de 1 dakika bekleyin ve 4 ° C'de 16.363 x g'de 30 s santrifüj yapın.
    2. Bu adımı 7 μL elüsyon çözeltisi ile tekrarlayın.
      NOT: Salınan nükleik asitleri içeren tüp buz üzerinde tutulmalıdır. DNA kontaminasyonunu önlemek için, DNA yıkımının ek bir adımı şiddetle tavsiye edilir-adım 3.5.
  5. Tüpü 2 IU DNaz ve 1x DNaz tamponu ile 37 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. RT'de 2 dakika boyunca 1/10 DNaz inaktivasyon reaktifi ile enzimatik aktiviteyi bloke edin.
  6. Tüpü 4 °C'de 16.363 x g'de 1,5 dakika boyunca santrifüjleyin. Son olarak, RNA'yı içeren süspansiyonu toplayın ve yeni bir tüpe aktarın.
  7. Bir spektrofotometre (NanoDrop 2000 yazılımı > Nükleik Asit > RNA) kullanarak numunede bulunan RNA miktarını değerlendirin. Boş olarak 1 μL elüsyon çözeltisi kullanın ve izole foliküllerden ekstrakte edilen RNA miktarını 1 μL çözelti ile ölçün.
  8. RNA saflığı için 260/280 oranını kontrol edin (yaklaşık 2.0). Numuneyi −80 °C'de saklayın veya RT-qPCR gerçekleştirmek için doğrudan geriye dönük olarak transkripte edin.
    NOT: RNA bütünlüğünü değerlendirmek için, numune -80 ° C'de donmadan önce veya sonra yüksek çözünürlüklü otomatik bir elektroforez sistemi ile işlenebilir. Bu çalışmada retrotranskripsiyonu takiben RT-qPCR aşağıdaki siklus ile uygulanmıştır:
    Sahneyi 50 °C'de 20 sn ve 95 °C'de 10 dakika ile tutun
    95 °C'de 15 sn ve 60 °C'de 1 dakika ile 40 PCR döngüsü
    95 °C'de 15 sn, 60 °C'de 1 dakika, 95 °C'de 30 s ve 60 °C'de 15 s ile erime eğrisi aşaması

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu izolasyon prosedürünü kullanarak, deneyci spesifik gen ekspresyon analizleri yapmak için stromal ortamdan folikülleri alabilir. Foliküllerin büyüklüğüne ve morfolojisine dayanarak, folikülogenezin farklı aşamalarını ayırt etmek mümkündür. Deneyci, uyarlanmış bir mikrokapiler pipet kullanarak ilgilendiği folikülleri boyutlarına göre seçebilir. Maksimum 75 μm'lik bir mikrokapiller kullanarak, primordial ve primer folikülleri ikincil, antral ve matür foliküllerden ayırmak mümkündür. Ayrıca, deneyci folikül morfolojisine ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yumurtalık dokusunun kriyoprezervasyonu, kanser hastalarının fertilitesini korumak için umut verici bir yaklaşımdır. Klinikte, çözülmüş kortikal doku remisyon sonrası hastaya tekrar aşılanır ve yumurtalık fonksiyonunun ve doğurganlığın yeniden başlamasına izin verir19,20. Klinik kullanımın yanı sıra, folikülogenezi düzenleyen mekanizmaları incelemek için depolama süresinin sonunda araştırma için artık yumurtalık fragmanları da bağışlanabilir. Dahası, bu doku,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar birbiriyle çelişen çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma bir Bilim Mükemmelliği (EOS) hibesi (ID: 30443682) ile desteklenmiştir. I.D. Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique'de (FNRS) yardımcı araştırmacıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 mm ızgaralı Petri kabıCorning430196
2100 Expert yazılımıAgilentsürüm B.02.08.SI648
4 kuyulu plakaSigma AldrichD6789
6 kuyulu plakaCarl Roth  EKX5.1
Agilent toplam RNA 6000 pico kitiAgilent5067-1513
Askorbik asitSigma AldrichA4403
Mikrokılcal pipetler için aspiratör tüpü tertibatlarıSigma AldrichA5177
SantrifüjEppendorf5424R
Kollajenaz IVYaşam Teknolojileri17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript ters transkriptazPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15Yaşam Teknolojileri11415-049
L-GlutaminSigma AldrichG7513
McCoy ' s 5A + bikarbonat + HepesLifeTechnologies12330-031
McIlwain doku doğrayıcıStoelting51350
Mikrokılcal RI EZ-İpuçları 200 ve mikro; mCooperSurgical7-72-2200/1
Mikrokılcal RI EZ-İpuçları 75 & mikro; mCooperSurgical7-72-2075/1
NanoDrop 2000/2000c işletim yazılımıThermoFishersürüm 1.6
NanoDrop spektrofotometreThermoFisher2000/2000c
Penisilin GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR yeşil ana karışımThermoFisherA46109
Primerler: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primerler: HPRTF: CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACACAGAGGGCTACAA
Primerler: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Gerçek Zamanlı qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
RNAqueous-micro toplam RNA izolasyon kitiThermoFisherAM1931
SelenyumSigma AldrichS9133
Sodyum piruvatSigma AldrichS8636
StereomikroskopNikonSMZ800
Streptomisin sülfatSigma AldrichS1277
SükrozSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Serisi II  su ceketli CO2  inkübatörlerThermoFisher3110
Thomas Stadie-Riggs doku dilimleyiciThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
2100 Biyoanaliz cihazı Agilent G2939BA 10652202001

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z. Progress in understanding human ovarian folliculogenesis and its implications in assisted reproduction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 30 (2), 213-219 (2013).
  3. Rosewell, K. L., Curry, T. E. Detection of ovarian matrix metalloproteinase mRNAs by in situ hybridization. Molecular Endocrinology. 590, 115-129 (2009).
  4. Tuck, A. R., Robker, R. L., Norman, R. J., Tilley, W. D., Hickey, T. E. Expression and localisation of c-kit and KITL in the adult human ovary. Journal of Ovarian Research. 8, 31(2015).
  5. Oktay, K., et al. Isolation and characterization of primordial follicles from fresh and cryopreserved human ovarian tissue. Fertility and Sterility. 67 (3), 481-486 (1997).
  6. Bonnet, A., et al. Transcriptome profiling of sheep granulosa cells and oocytes during early follicular development obtained by laser capture microdissection. BMC Genomics. 12, 417(2011).
  7. Chiti, M. C., et al. A modified and tailored human follicle isolation procedure improves follicle recovery and survival. Journal of Ovarian Research. 10 (1), 71(2017).
  8. Kim, E. J., et al. Comparison of follicle isolation methods for mouse ovarian follicle culture in vitro. Reproductive Sciences. 25 (8), 1270-1278 (2018).
  9. Chen, J., et al. Optimization of follicle isolation for bioengineering of human artificial ovary. Biopreservation and Biobanking. 20 (6), 529-539 (2022).
  10. Babayev, E., Xu, M., Shea, L. D., Woodruff, T. K., Duncan, F. E. Follicle isolation methods reveal plasticity of granulosa cell steroidogenic capacity during mouse in vitro follicle growth. Molecular Human Reproduction. 28 (10), (2022).
  11. McDonnell, S. P., Candelaria, J. I., Morton, A. J., Denicol, A. C. Isolation of small preantral follicles from the bovine ovary using a combination of fragmentation, homogenization, and serial filtration. Journal of Visualized Experiments. (187), e64423(2022).
  12. Schallmoser, A., Einenkel, R., Färber, C., Sänger, N. In vitro growth (IVG) of human ovarian follicles in frozen thawed ovarian cortex tissue culture supplemented with follicular fluid under hypoxic conditions. Archives of Gynecology and Obstetrics. 306 (4), 1299-1311 (2022).
  13. Xu, M., et al. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Human Reproduction. 24 (10), 2531-2540 (2009).
  14. Demeestere, I., Simon, P., Englert, Y., Delbaere, A. Preliminary experience of ovarian tissue cryopreservation procedure: Alternatives, perspectives and feasibility. Reproductive Biomedicine Online. 7 (5), 572-579 (2003).
  15. Demeestere, I., et al. Ovarian function and spontaneous pregnancy after combined heterotopic and orthotopic cryopreserved ovarian tissue transplantation in a patient previously treated with bone marrow transplantation: Case report. Human Reproduction. 21 (8), 2010-2014 (2006).
  16. Gougeon, A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1 (2), 81-87 (1986).
  17. Grosbois, J., Demeestere, I. Dynamics of PI3K and Hippo signaling pathways during in vitro human follicle activation. Human Reproduction. 33 (9), 1705-1714 (2018).
  18. Grosbois, J., Vermeersch, M., Devos, M., Clarke, H. J., Demeestere, I. Ultrastructure and intercellular contact-mediated communication in cultured human early stage follicles exposed to mTORC1 inhibitor. Molecular Human Reproduction. 25 (11), 706-716 (2019).
  19. Oktay, K., et al. Endocrine function and oocyte retrieval after autologous transplantation of ovarian cortical strips to the forearm. Journal of the American Medical Association. 286 (12), 1490-1493 (2001).
  20. Chung, E. H., Lim, S. L., Myers, E., Moss, H. A., Acharya, K. S. Oocyte cryopreservation versus ovarian tissue cryopreservation for adult female oncofertility patients: A cost-effectiveness study. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 38 (9), 2435-2443 (2021).
  21. Walker, C. A., Bjarkadottir, B. D., Fatum, M., Lane, S., Williams, S. A. Variation in follicle health and development in cultured cryopreserved ovarian cortical tissue: A study of ovarian tissue from patients undergoing fertility preservation. Human Fertility. 24 (3), 188-198 (2021).
  22. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: A comprehensive analysis of key protocol variables. Biology of Reproduction. 103 (3), 455-470 (2020).
  23. Rice, S., Ojha, K., Mason, H. Human ovarian biopsies as a viable source of pre-antral follicles. Human Reproduction. 23 (3), 600-605 (2008).
  24. Kristensen, S. G., Rasmussen, A., Byskov, A. G., Andersen, C. Y. Isolation of pre-antral follicles from human ovarian medulla tissue. Human Reproduction. 26 (1), 157-166 (2011).
  25. Dong, F. -L., et al. An research on the isolation methods of frozen-thawed human ovarian preantral follicles. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 7 (8), 2298-2303 (2014).
  26. Lierman, S., et al. Follicles of various maturation stages react differently to enzymatic isolation: a comparison of different isolation protocols. Reproductive Biomedicine Online. 30 (2), 181-190 (2015).
  27. Abir, R., et al. Pilot study of isolated early human follicles cultured in collagen gels for 24 hours. Human Reproduction. 14 (5), 1299-1301 (1999).
  28. Abir, R., et al. Morphological study of fully and partially isolated early human follicles. Fertility and Sterility. 75 (1), 141-146 (2001).
  29. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  30. Abir, R., et al. Mechanical isolation and in vitro growth of preantral and small antral human follicles. Fertility and Sterility. 68 (4), 682-688 (1997).
  31. Vanacker, J., et al. Enzymatic isolation of human primordial and primary ovarian follicles with Liberase DH: Protocol for application in a clinical setting. Fertility and Sterility. 96 (2), 379-383 (2011).
  32. Amargant, F., et al. Ovarian stiffness increases with age in the mammalian ovary and depends on collagen and hyaluronan matrices. Aging Cell. 19 (11), 13259(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Folik l zolasyonuOver DokusuEnzimatik SindirimGran l za H creleriRNA EkstraksiyonuRT qPCROosit zolasyonuFolik logenez

İlgili makaleler