Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Lipid nanopartikülleri (LNP'ler), Moderna ve Pfizer/BioNTech tarafından COVID-19 mRNA aşılarının başarılı bir şekilde geliştirilmesiyle son zamanlarda büyük ilgi görmüştür. Bu aşılar, mRNA-LNP terapötiklerinin etkinliğini göstermiş ve gelecekteki klinik uygulamalar için kapıyı açmıştır. mRNA-LNP sistemlerinde, LNP'ler, mRNA kargosunu nükleazlar tarafından bozulmaya karşı koruyan ve hücre içi iletimlerine aracılık eden dağıtım platformları olarak hizmet eder. LNP'ler tipik olarak dört bileşenden oluşur: iyonlaşabilir bir lipit, bir fosfolipid, kolesterol ve bir lipide bağlı polietilen glikol (PEG) konjugatı (lipid-PEG). Burada, ateşböceği lusiferazı kodlayan mRNA'yı kapsülleyen LNP'ler, LNP lipid bileşenlerini içeren organik fazın ve mRNA içeren sulu fazın mikroakışkan karışımı ile formüle edilir. Bu mRNA-LNP'ler daha sonra biyolüminesan plaka bazlı bir test kullanılarak HepG2 hücrelerinde transfeksiyon verimliliklerini değerlendirmek için in vitro olarak test edilir. Ek olarak, mRNA-LNP'ler, lateral kuyruk damarı yoluyla intravenöz bir enjeksiyonu takiben C57BL/6 farelerinde in vivo olarak değerlendirilir. Tüm vücut biyolüminesans görüntüleme, in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak gerçekleştirilir. mRNA-LNP özellikleri, HepG2 hücrelerindeki transfeksiyon etkinlikleri ve C57BL/6 farelerinde toplam ışıldayan akı için temsili sonuçlar gösterilmiştir.
Giriş
Lipid nanopartikülleri (LNP'ler) son yıllarda viral olmayan gen terapisi alanında büyük umut vaat etmektedir. 2018'de Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), kalıtsal transtirenin amiloidozu 1,2,3,4'ün tedavisi için ilk RNA interferansı (RNAi) terapötik olan Onpattro by Alnylam'ı onayladı. Bu, lipid nanopartikülleri ve RNA bazlı tedaviler için ileriye doğru atılmış önemli bir adımdı. Daha yakın zamanlarda, Moderna ve Pfizer/BioNTech, SARS-CoV-2 4,5'e karşı mRNA-LNP aş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Yüzeyleri ve ekipmanı RNazlar ve DNA için bir yüzey dekontaminantı ile silerek mRNA-LNP'leri formüle ederken her zaman RNaz içermeyen koşulları koruyun. Yalnızca RNaz içermeyen uçlar ve reaktifler kullanın.
Tüm hayvan prosedürleri, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna ve Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Ön formülasyon hazırlığı
- Temiz bir 4 L'lik kabı 200-300 mL taze 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun.<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
mRNA-LNP'ler, ortalama hidrodinamik çapı 76.16 nm ve polidispersite indeksi 0.098 olan bir mikroakışkan alet kullanılarak formüle edildi. mRNA-LNP'lerin pKa'sı , TNS testi18 yapılarak 5.75 olarak bulundu. Bu mRNA-LNP'ler için kapsülleme verimliliği, modifiye floresan testi ve
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iş akışıyla, çeşitli mRNA-LNP'ler in vitro ve in vivo verimlilikleri için formüle edilebilir ve test edilebilir. İyonlaşabilir lipitler ve eksipiyanlar, farklı fizikokimyasal özelliklere sahip mRNA-LNP'ler üretmek için farklı molar oranlarda ve farklı iyonlaşabilir lipid / mRNA ağırlık oranlarında değiştirilebilir ve birleştirilebilir22. Burada, molar oranı 35/16/46.5/2.5 (iyonlaşabilir lipid: yardımcı lipid: kolesterol: lipid-PEG) olan C12-200 mRNA-LNP'leri 10:1 iyonize edile.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
M.J.M., ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Direktörünün Yeni Yenilikçi Ödülü'nden (DP2 TR002776), Scientific Interface'de (CASI) Burroughs Wellcome Fund Kariyer Ödülü'nden, ABD Ulusal Bilim Vakfı KARİYER ödülünden (CBET-2145491) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 ve NIDDK R01 DK123049) ek fon sağladığını kabul eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.1 M Hidroklorik Asit | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0.22 μ m Şırınga Filtreleri | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Kayma Uçlu Şırınga | BD | 309659 | |
| 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipidler | 880150P | |
| 1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin (DOPE) | Avanti Polar Lipidler | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tüpleri | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Konik Tüpler | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 kanıt Etanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G İğneler | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Luer-Lok uçlu Tek Kullanımlık Şırıngalar | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Diyaliz Kasetler | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 Kuyu Siyah Duvar Siyah Alt Plaka | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 Kuyu Beyaz/Şeffaf Alt Plaka, TC Yüzey | Thermo Scientific | 165306 | |
| Amonyum Asetat, 1 Kilogram | Araştırma Ürünleri Uluslararası | 631-61-8 | |
| Amonyum Sitrat dibazik | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Şırınga steril, tek kullanımlık, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 İyonize Edilebilir Lipid | Cayman Kimyasal | 36699 | |
| C57BL / 6 Fareler | Jackson Laboratuvarı | 000664 | |
| Kolesterol | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Tek kullanımlık küvetler | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-Luciferin, Potasyum Tuzu | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, yüksek glikoz | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel İnsülin Şırıngaları - 0,5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Fetal Sığır Serumu | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Moleküler Biyoloji Sınıf Su | Cytiva | SH30538.03 | |
| Sonsuz 200 PRO Plaka Okuyucu | Tecan | N/A | |
| IVIS Spektrumu In Vivo Görüntüleme Sistemi | Perkin Elmer | N/A | |
| Büyük Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| Lusiferaz Test Kiti | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ateşleme Kartuşları - Klasik - 100'lü Paket | Hassas Nanosistemler | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ateşleme Cihazı | Hassas Nanosistemler | NIN0001 | |
| PBS - Fosfat Tamponlu Salin (10x) pH 7.4, RNaz içermeyen | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penisilin-Streptomisin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Sitrat Tamponu, (Sitrat 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen RNA Test Kiti | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lysis 5x Tampon | Promega | E3971 | |
| RNase Uzak Yüzey Dekontaminant | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Sodyum Klorür | Sigma | 7647-14-5 | |
| Sodyum Hidroksit | Sigma | 1310-73-2 | |
| Sodyum Fosfat | Sigma | 7601-54-9 | |
| TNS reaktifi (6- (p-Toluidino) -2-naftalinsülfonik asit sodyum tuzu) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalitik | NanoZS |
Kaynaklar
- Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
- Wood, H. FDA approves patisiran ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
