Yöntem makalesi

Kurşun Tanımlamadan Doğrulamaya Küçük Molekül Tarama Stratejileri

DOI:

10.3791/64811

⸱

20 Ocak 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TARTIŞILAN MAKALELER:

Festa, F., Labaer, J. Kendi kendine monte edilmiş insan protein mikrodizilerinde kinaz inhibitörü taraması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 152, E59886 (2019).

Stockman, BJ ve ark. Nükleosit ribohidrolazların bileşik inhibisyonu, IC50 değerleri, artefakt aktivitesi ve tüm hücre aktivitesini belirlemek için NMR Tabanlı aktivite testleri. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 148, E59928 (2019).

Gao, S. et al. Caenorhabditis elegans'ın otomatik fenotipik profillemesi ile kimyasal toksisitenin tahmini için yüksek verimli bir test. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 145, E59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Yapışık hücrelerde hedef katılımı ölçmek için yüksek içerikli görüntüleme kullanma. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 141, e58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Tek devirli proteaz PCSK9'un proteolizini değerlendirmek için yüksek verimli bir lusiferaz testi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 138, E58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Antiviral ilaçları taramak ve konakçı bağışıklık hücresi yanıtlarını karakterize etmek için insan influenza A virüsü enfeksiyonlarının zebra balığı modellerini kullanma. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 119, E55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Antikor dizileri tarafından sinyal iletim yollarının sorgulanmasıyla tirozin kinaz inhibitörlerine direncin değerlendirilmesi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 139, E57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Satıcılar, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Küçük molekül inhibitörlerini taramak için NADH'ye bağlı ATPaz testinin yarı yüksek verimli bir adaptasyonu. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 150, e60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. DEĞİŞTİRME yoluyla protein-protein etkileşimlerinin inhibitörlerinin geliştirilmesi: ATP olmayan rekabetçi CDK inhibitörlerinin tasarım ve geliştirilmesine uygulama. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Kimyasal inhibitör kütüphanelerinin taranması yoluyla T hücresi reseptör sinyallemesinin aracılarının tanımlanması. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 143, E58946 (2019).

Takakusagi, Y. İlaç-protein etkileşimlerinin küresel validasyonu için biyosensör tabanlı yüksek verimli biyopanning ve biyoinformatik analiz stratejisi. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 166, E61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. HiBiT CRISPR hücre hatları kullanılarak hedeflenen protein bozunma bileşiklerinin Yüksek Verimli hücresel profili. Görselleştirilmiş Deneyler Dergisi. 165, E61787 (2020).

Editöryal

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genomik devrimi, genetik bozulma ve farklı hastalık fenotipleri arasındaki ilişki hakkında büyük miktarda bilgi ile sonuçlanmıştır1. Bu, çok sayıda proteinin potansiyel ilaç hedefleri olarak açıklanmasına yol açmış ve bu hedefleri inhibe eden bileşiklerin keşfi ve geliştirilmesine olan ilgiyi artırmıştır2. Bu bağlamda, isabetli bileşik keşfi, hedef doğrulama, bağlanma afinitelerinin ölçülmesi, seçicilik, toksisite ve hücre içi hedef katılımının yanı sıra bileşik reaktivitesi, stabilitesi ve farmakokinetik özellikleri için önemli yaklaşımlar olarak farklı tarama stratejileri ortaya çıkmıştır. Bu koleksiyon, küçük moleküllerin biyokimyasal ve/veya biyolojik aktivitesini taramak ve değerlendirmek için kullanılabilecek çok sayıda stratejiyi sergilemek amacıyla bu alandaki bazı metodolojik gelişmeleri yakalamaktadır.

Protein kinazlar, 500'den fazla üyesi olan geniş bir enzim ailesini temsil eder. Bu enzimler, tüm hücresel süreçlerin temel düzenleyicileridir ve arızaları çok sayıda hastalıkla ilişkilendirilmiştir3. Bu nedenle, ilaç keşfine ve buna bağlı olarak metodoloji geliştirmeye yoğun ilginin odağı olmuşlardır. Bu nedenle, bu koleksiyondaki dört makale bu alandaki ilerlemeler hakkında rapor vermektedir. Festa ve ark. kendi kendine birleşen nükleik asit programlanabilir protein dizileri (NAPPA)4 kullanan kinaz inhibitörü keşfi için bir tarama platformu tanımlamaktadır. Bu diziler, tam uzunlukta insan kinazlarını görüntüler ve büyük bir kinaz koleksiyonu boyunca bileşiklerin çoğullanmış olarak taranmasına izin verir, böylece yalnızca isabetlerin tanımlanmasına değil, aynı zamanda seçiciliğin profilinin çıkarılmasına da izin verir. Tieman et al. kinaz inhibitörü aktivitesinin bir okuması olarak fosforilasyon durumundaki hücre çapındaki değişiklikleri taramak için geliştirilmiş fosfoantikor mikrodizi tabanlı bir yöntemi tanımlar5. Bu, ilaç yanıtını ve etkinliğini anlamak için önemli bir parametre olan inhibisyona dirençli hale gelen yolların doğası hakkında fikir sahibi olmaya yol açabilir. Chen ve ark. T hücresi reseptörü (TCR) sinyallemesini etkileyen bileşikleri tanımlamak için kinaz inhibitörü koleksiyonlarını taramak için bir akış sitometrisi tahlili tanımlar6. Bu strateji, TCR sinyallemesinde yer alan kinazların hızlı bir şekilde tanımlanmasına yol açarak, immünoterapötik ilaç geliştirme hedefleri olarak potansiyellerini gösterdi. Son olarak, birçok kinazın aktivitesi, protein-protein etkileşimleri (PPI'ler) yoluyla düzenlenir, bu da bu PPI'ları hedefleyen bileşiklerin ilgi çekici olabileceğini düşündürür. Nandha Premnath ve ark. peptit bağlayıcıların özelliklerini aynıbağlanma yüzeyine 7 giren küçük moleküllere dönüştürerek kinazların ATP olmayan rekabetçi ÜFE'lerini geliştirmek için kullanılabilen REPLACE (hesaplamalı zenginleştirme kullanılarak kısmi ligand alternatifleriyle değiştirme) adı verilen bir yöntemi tanımlar.

Kinazlara ek olarak, diğer birçok enzim hastalıkta rol oynar ve ilaç keşfinde takip edilmiştir. Bu nedenle kinazlar dışındaki enzimler için optimize edilmiş yöntemler de ilgi çekicidir. Örneğin, Stockman ve ark. Trichomonas vaginalis8 parazitinden nükleozid ribohidrolaz inhibitörlerini keşfetmek ve değerlendirmek için nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisine dayalı aktivite deneylerini tanımlar. Bu tahliller IC50 değerlerinin belirlenmesi için de kullanılabilir. ATPaz inhibitörlerini taramak için, Radnai ve ark. sonuçta ATPaz aktivitesini nikotinamid adenin dinükleotidin (NADH) içsel floresansına çeviren iki enzimi (piruvat kinaz ve laktat dehidrojenaz) içeren birleştirilmiş bir enzim tahlil formatı kullanan yarı yüksek verimli bir tarama yöntemi geliştirdi9. Şimdiye kadar tarif edilen, işlemsel olan ve birden fazla adımı katalize eden tüm enzimlerin aksine, proprotein konvertaz subtilisin/kexin tip 9 (PCSK9), substratı tarafından otoinhibe edilen tek devirli bir proteazdır. Bu, PCSK9 inhibitörlerinin taranmasını zorlaştırır ve Chorba ve ark. PCSK9 bölünme aktivitesini bir okuma olarak salgılanan lusiferaz aktivitesine bağlayan ve böylece inhibitörler10 için taramayı mümkün kılan yüksek verimli hücre bazlı bir yöntemi tanımlar.

Çeşitli hedeflerin aktivitesini inhibe eden bileşikler bulmanın yanı sıra, bileşiğin hücrelerde amaçlanan hedefine geçtiğini doğrulayan tahliller de büyük ilgi görmektedir. Axelsson ve ark. immünofloresan antikorlar ve hücresel termal kayma testi (CETSA) ile yüksek içerikli görüntülemeyi birleştirmeye dayalı olarak yapışık hücrelerde hedef katılımını doğrulamak için bir strateji tanımlamaktadır11. Bu tahlil, stabilize edici bileşikleri tanımlamak için geniş bir bileşik koleksiyonu ile muamele edilen hücrelere izotermal bir ısı mücadelesi kullanır. Riching ve diğerleri tarafından geliştirilen, parçalayıcı moleküllerin hedef etkileşimini ve aktivitesini değerlendirebilen bir yöntem, ışıldayan bir protein üretmek ve lüminesansta bir azalma yoluyla bozunma parametrelerini izlemek için HiBiT/LgBiT etiketleme teknolojisini kullanır12. Son olarak, Takakusagi ve ark. ilaç bağlayıcı peptit motifleri ve küçük moleküller arasındaki bağlanmayı taramak için faj bazlı peptit ekranlarının kullanılmasına dayanan protein-ilaç etkileşimlerini doğrulamak için bir yöntem tanımlamaktadır13. Peptit görüntüleme ekranı, hedef bağlanmasını doğrulamak için biyoinformatik analizle birleştirilir.

Küçük molekül doğrulamanın bir başka katmanı, hayvan modellerindeki etkilerinin karakterizasyonudur. Bu koleksiyon, biri antiviral aktiviteye sahip bileşiklerin etkinliğini değerlendirmek için insan influenza A virüsü enfeksiyonunun zebra balığı (Danio rerio) modellerini ve ayrıca konakçı bağışıklık tepkisini14 kullanan ve diğeri bileşik toksisitesinin profilini çıkarmak için bir model olarak Caenorhabditis elegans'ı kullanan bu tür iki yöntemi içerir15. Bu çalışmaların her ikisi de, in vivo etkinliği ve toksisiteyi değerlendirebilen optimize edilmiş yöntemlere olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Sonuç olarak, ilaç keşfi ve geliştirme, çok sayıda darboğaz, zorluk ve yüksek başarısızlık olasılığı olan zorlu süreçlerdir. Ek olarak, ilaca dirençli patojenlerin sayısının endişe verici bir oranda arttığı bulaşıcı hastalıklar alanında veya kronik hastalıkların ve yaşlanan nüfusla ilişkili hastalıkların yaygınlığının arttığı alanlarda devam eden hastalık yükü, odaklanmış dikkatimizi ve eylemimizi gerektirmektedir. Bu koleksiyon, ilaç keşfini, doğrulamasını ve karakterizasyonunu hızlandırmayı amaçlayan çeşitli yöntemleri vurgulamaktadır. İleriye dönük olarak, bu alanda, özellikle tarama verimini artırmayı, kimyasal kütüphanelerin çeşitliliğini artırmayı ve yüksek verimli tarama (HTS) ile uyumlu in vivo modeller geliştirmeyi amaçlayan daha fazla yenilik görmeyi bekliyoruz. Ayrıca, daha hızlı ve daha küçük ölçekte etki, seçicilik, özgüllük, etkinlik ve toksisiteye ilişkin bütünsel bir görünüm sağlayan iş akışları özellikle kolaylaştırıcı olabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MK, Yaşam Bilimleri Editörleri için ücretli bir danışmandır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MK, NCI T32 CA236754 tarafından kısmen desteklenmektedir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Validation StrategiesKinase Inhibitor ScreeningNMR based Activity AssaysChemical Toxicity PredictionAutomated Phenotypic ProfilingHigh Content ImagingLuciferase AssayAntiviral Drug ScreeningProtein protein Interaction InhibitorsChemical Inhibitor LibrariesDrug protein InteractionsT cell Receptor Signaling

İlgili makaleler