Yöntem makalesi

Cnidarian Model Sisteminde Kromatin İmmünopresipitasyon Ekzaiptazi diafanası

2.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64817

⸱

17 Mart 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red Sea Research Center (RSRC), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST), 2KAUST Environmental Epigenetics Program (KEEP), Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Model organizma Exaiptasia diaphana için histon işareti H3K4me3'e karşı bir kromatin immünopresipitasyon (X-ChIP) testi sunulmuştur. Testin özgüllüğü ve etkinliği, kantitatif PCR ve yeni nesil dizileme ile doğrulanır. Bu protokol, deniz anemonu E. diaphana'daki protein-DNA etkileşimlerinin daha fazla araştırılmasını sağlar.

Özet

Histon translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM'ler) ve diğer epigenetik modifikasyonlar, genlerin transkripsiyonel makineye kromatin erişilebilirliğini düzenler, böylece bir organizmanın çevresel uyaranlara yanıt verme kapasitesini etkiler. Yüksek verimli dizileme (ChIP-seq) ile birleştirilmiş kromatin immünopresipitasyonu, epigenetik ve gen regülasyonu alanlarında protein-DNA etkileşimlerini tanımlamak ve haritalamak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, cnidarian epigenetik alanı, kısmen, yüksek su içeriği ve mukus miktarları moleküler yöntemleri engelleyen simbiyotik deniz anemonu Exaiptasia diaphana gibi model organizmaların benzersiz özellikleri nedeniyle, uygulanabilir protokollerin eksikliği nedeniyle engellenmektedir. Burada, E. diaphana gen regülasyonunda protein-DNA etkileşimlerinin araştırılmasını kolaylaştıran özel bir ChIP prosedürü sunulmaktadır. Çapraz bağlama ve kromatin ekstraksiyon adımları, verimli immünopresipitasyon için optimize edildi ve daha sonra histon işareti H3K4me3'e karşı bir antikor kullanılarak ChIP gerçekleştirilerek doğrulandı. Daha sonra, ChIP testinin özgüllüğü ve etkinliği, kantitatif PCR kullanılarak H3K4me3'ün yapısal olarak aktive edilmiş birkaç gen lokusu etrafında nispi doluluğunun ölçülmesi ve genom çapında ölçek analizi için yeni nesil dizileme ile doğrulandı. Simbiyotik deniz anemonu E. diaphana için bu optimize edilmiş ChIP protokolü, mercanlar gibi simbiyotik cnidarians'ı etkileyen çevresel değişikliklere organizma tepkilerinde yer alan protein-DNA etkileşimlerinin araştırılmasını kolaylaştırır.

Giriş

Hükümetlerarası İklim Değişikliği Paneli'nin (IPCC) 2022 raporu, artan farkındalık ve azaltma çabalarına rağmen, giderek daha yoğun ve sık görülen deniz ısı dalgalarının mercan resiflerini önümüzdeki on yıllar içinde kapsamlı ağartma ve toplu ölüm riskine soktuğunu vurguluyor1. Mercan kayalığı koruma ve restorasyon çabalarını bilgilendirmek için, değişen çevresel koşulların bentik cnidarians üzerindeki mevcut ve öngörülen etkileri, altta yatan tepki ve dayanıklılık mekanizmalarını anlamak için birden fazla biyolojik düzeyde araştırılmaktadır2.

Bentik cnidarianlar için geçerli araştırma araçlarının mevcudiyeti bu zorluğun üstesinden gelmek için çok önemlidir ve bu araçları geliştirmek, diğer alanlarda kurulan bilgi ve teknolojileri deniz organizmalarına aktarmak için aktif bir çaba gerektirir3. Birçok mercan türüyle çalışmanın önündeki engeller, deniz anemonu Exaiptasia diaphana (genellikle Aiptasia olarak adlandırılır)4 gibi model sistemler kullanılarak kısmen hafifletilir. Bu hızlı büyüyen, fakültatif olarak simbiyotik deniz anemonlarının laboratuvar koşullarında tutulması nispeten kolaydır, hem eşeyli hem de eşeysiz olarak çoğalırlar ve kalsiyum karbonat iskeletinden yoksundurlar5. E. diaphana'nın açık erişimli referans genomu5, dizileme gerektiren epigenetik yöntemlerin kullanımını kolaylaştırır. Bununla birlikte, yüksek su içeriği, mukus üretimi ve birey başına düşük doku miktarları gibi özellikler, tekrarlanabilir protokollerin oluşturulmasında zorluklar yaratmaktadır, bu nedenle E. diaphana ve benzer özelliklere sahip diğer cnidarians üzerindeki epigenetik araştırmaları engellemektedir.

Epigenetik modifikasyonlar, kromatinle ilişkili süreçleri düzenleyerek bir organizmanın genomik nükleotid dizisini değiştirmeden fenotipi değiştirebilir6. Cnidarian epigenetik düzenlemesi çoğunlukla evrimsel tarih ve gelişim 7,8,9,10, simbiyoz oluşumu ve sürdürülmesi 11,12,13 ve çevresel değişikliklere tepki 14,15 bağlamlarında araştırılmaktadır. Spesifik olarak, çoğu durumda, bir sitozin bazına bir metil grubunun eklenmesini içeren DNA metilasyon modellerindeki varyasyonlar, ısınma13 ve okyanus asitlenmesi16 gibi değişen çevresel koşullara yanıt olarak gözlemlenmiştir. DNA metilasyon modellerinin de nesiller arası kalıtsal olduğu gösterilmiştir ve bu da mercanın çevresel stres faktörlerine alışmasında epigenetiğin rolünü vurgulamaktadır17. DNA metilasyonu ile karşılaştırıldığında, kodlamayan RNA'lar11,18,19, transkripsiyon faktörleri 9,10 veya cnidarianlarda histon sonrası translasyonel modifikasyonlar (PTM'ler) gibi diğer önemli epigenetik düzenleyiciler hakkında nispeten az sayıda çalışma yapılmıştır20. DNA ile ilişkili proteinlerin araştırılması özellikle zordur, çünkü mevcut yöntemler çalışma organizmasının referans genomuna erişim gerektirir ve büyük örneklem boyutları ve ihtiyaç duyulan yüksek özgüllüklü antikorlar nedeniyle pahalıdır3. Spesifik histon kalıntılarında PTM'ler oluşturan çok çeşitli kimyasal gruplarla, özellikle yaklaşmakta olan çevresel stresler bağlamında, cnidarianlarda kromatin modifikasyon manzaralarını anlamak büyük bir zorluk olmaya devam etmektedir.

Bu çalışmanın amacı, mercan modeli E. diaphana (Bodega ve ark.21 tarafından orijinal protokol) için optimize edilmiş bir kromatin-immünopresipitasyon (ChIP) protokolü sunarak cnidarianlarda histon PTM'lerinin, histon varyantlarının ve diğer kromatinle ilişkili proteinlerin araştırılmasını ilerletmektir. ChIP, lokusa özgü protein-DNA etkileşimlerini karakterize etmek için kantitatif PCR veya bu etkileşimleri tüm genom boyunca haritalamak için yeni nesil dizileme (NGS) ile birleştirilebilir. Genel olarak, proteinler ve DNA geri dönüşümlü olarak çapraz bağlanır, böylece ilgilenilen protein (POI) in vivo olarak ilişkili olduğu aynı lokusa bağlı kalır. Memeli model sisteminde yaygın olarak kullanılan yaygın çapraz bağlama yöntemi genellikle oda sıcaklığında 15 dakika veya altında tutulurken, çapraz bağlama yaklaşımı, formaldehitin E. diaphana tarafından üretilen mukustan daha etkili bir şekilde nüfuz etmesine izin vermek için optimize edilmiştir. Doku daha sonra sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulur, homojenize edilir ve çekirdekleri hücrelerden çıkarmak için parçalanır. Bu adımlardaki malzeme kaybı, yalnızca bir lizis tamponu kullanılarak ve daha sonra doğrudan kromatini ~ 300 bp uzunluğunda parçalara ayıran sonikasyona geçilerek önlenir. Bu fragmanlar, PTM düzeyinde hassasiyete kadar POI'ye özgü bir antikor ile inkübe edilir. Antikor-protein-DNA immünokompleksi, birincil antikorlara bağlanan manyetik boncuklar kullanılarak çökeltilir, böylece sadece POI ile ilişkili DNA segmentleri seçilir. Çapraz bağın tersine çevrilmesinden ve çökeltinin temizlenmesinden sonra, elde edilen DNA segmentleri, segmentleri bir referans genoma eşlemek ve böylece POI'nin ilişkili olduğu lokusları tanımlamak için dizileme için qPCR veya DNA kütüphanesi yapımı için kullanılabilir. Her adım için dikkat edilmesi gereken noktalar hakkında daha fazla ayrıntı Jordán-Pla ve Visa22'de bulunabilir.

Protokol

Şekil 1'de prosedüre ilişkin bir genel bakış verilmiştir. ChIP-Seq verileri, BioProject kod PRJNA931730 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA931730) altında NCBI Dizi Okuma Arşivi'nde (SRA) mevcuttur.

figure-protocol-1
Şekil 1: ChIP protokolü iş akışı. Her adımın tahmini süresi ve isteğe bağlı durma noktaları dahil olmak üzere ChIP protokolü iş akışına genel bakış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Hayvan toplama

  1. Plastik bir spatula kullanarak, ~ 20 mm pedal çapı veya daha büyük olan 7 simbiyotik E. diaphana'yı (CC5) akvaryum duvarlarından nazikçe ayırın ve 15 mL'lik bir tüpe pipetleyin.
    NOT: Anemon sayısının boyutlarına ve kaç IP'nin amaçlandığına bağlı olarak optimize edilmesi önerilir. Anemonlar sıvı nitrojen (LN2) içinde hızlı dondurulabilir ve ChIP'ye başlamadan önce en az 1 ay boyunca -80 ° C'de saklanabilir. Aksi takdirde, anemonların 15 mL'lik tüpün duvarlarına yerleşmesini önlemek için hemen ilerlemeniz önerilir.

2. Çapraz bağlama

  1. 10 mL% 0.5 çapraz bağlama tamponu hazırlayın (Tablo 1).
  2. Anemonların tüpün dibine çökmesine izin verin veya oda sıcaklığında ~ 3.500 x g'ye kadar çıkarak birkaç saniye santrifüjde döndürün ve ardından fazla deniz suyunu bir vakum pompası ile alın. Bunları 1x DPBS'de askıya alarak yıkayın ve ardından DPBS'yi çıkarın.
  3. Gereksiz tamponun aktarılmasını önlemek için anemonları cımbız veya plastik bir spatula kullanarak% 0.5 çapraz bağlama tamponuna aktarın. 1 saat boyunca 12 rpm ve 4 ° C'de bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
  4. Bu arada, 10 mL %1 çapraz bağlama tamponu hazırlayın (Tablo 1).
  5. Adım 2.2'de olduğu gibi, %0,5'lik tamponu çıkarın ve tüpü %1'lik çapraz bağlama tamponu ile yeniden doldurun. Gece boyunca 12 rpm ve 4 °C'de bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
    NOT: Tüpü nazikçe ters çevirerek tüm anemonların asılı olduğundan ve birbirine yapışmadığından emin olun.
  6. Ertesi gün, 2 M'lik bir glisin stoğundan 10 mL söndürme tamponu hazırlayın (Tablo 1).
  7. Adım 2.2'deki gibi% 1'lik çapraz bağlama tamponunu çıkarın ve çapraz bağlama reaksiyonunu durdurmak için söndürme tamponundaki anemonları askıya alın. 12 rpm ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
  8. Söndürme tamponunu adım 2.2'deki gibi çıkarın ve anemonları DPBS'de iki kez yıkayın. Birden fazla numune işleniyorsa, numune bazında 3.2-3.4 adımları üzerinde çalışırken anemonları DPBS'de asılı tutun.
    NOT: Bu noktada numunenin ani dondurulması ve -80 °C'de en fazla 1 ay saklanması ile deney duraklatılabilir. Dondurmadan ve saklamadan önce tüpü bir kağıt mendil üzerine boşaltarak fazla DPBS'yi çıkarın.

Tablo 1: ChIP protokolünde kullanılan çözeltiler ve arabellekler. Protokolde kullanılan her bir tampon için bileşenler ve ilgili konsantrasyonları listelenmiştir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Homojenizasyon ve lizis

  1. Lizis tamponunu (Tablo 1) gün içinde taze olarak hazırlayın (numune başına 2 mL) ve 100x proteaz inhibitör kokteyli ekleyin (PIC, Malzeme Tablosuna bakınız) 1x'lik bir nihai konsantrasyona kadar. Porselen bir harcı ve havaneli etanol ile temizleyin ve tüm aletleri LN2 ile soğutmaya başlayın.
  2. DPBS'yi boşaltın ve mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarmak için anemonları bir kağıt mendil üzerine boşaltın. Harcın içine biraz LN2 dökün ve anemonları cımbız kullanarak aktarın.
  3. Havaneli kullanarak, dokuyu dikkatlice parçalayarak başlayın ve ardından numune ince bir toz olana kadar öğütün. Buz çözmeyi önlemek için gerektiği kadar LN2 ile doldurmaya devam edin.
  4. Buz üzerinde 5 mL'lik bir tüpe 2 mL lizis tamponu yerleştirin. Numuneyi bir spatula kullanarak toplayın ve numunenin tampon içinde çözünmesini sağlayarak lizis tamponuna aktarın. Numuneyi buz üzerinde 1 dakika dinlendirin ve ardından ters çevirerek karıştırın. Diğer tüm numuneler için 3.2-3.4 adımlarını tekrarlayın, numuneler arasındaki tüm ekipmanı etanol ile iyice temizleyin.
    NOT: Bu adımda numune kaybını mümkün olduğunca en aza indirin.
  5. Bir Dounce doku öğütücüyü ( Malzeme Tablosuna bakın) lizis tamponu ile yıkayın, numuneyi aktarın ve sıkı bir havaneli ile 20-30 kez iki katına çıkarın.
  6. Numuneyi tekrar tüpüne aktarın, doku öğütücüyü etanol ve damıtılmış su ile yıkayın ve tüm numuneler için adım 3.5'i tekrarlayın.
  7. Numuneleri gece boyunca ~ 14 rpm ve 4 ° C'de bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
  8. Mikroskop altında (20x büyütme) başarılı bir lizis olup olmadığını kontrol etmek için 10:1 oranında 10 μL numune ile karıştırarak Tripan mavisi kullanın. Boya çekirdeğe nüfuz ederse, lizis başarılı olur.
    NOT: Numune -80 °C'de 2 aya kadar saklanarak deney bu noktada duraklatılabilir.

4. Sonikasyon

  1. Kapaktan ve duvarlardan herhangi bir sıvıyı çıkarmak için numuneyi oda sıcaklığında 3-5 saniye boyunca ~2.000 x g'de bir santrifüjde kısaca döndürün.
  2. Lizatı 25 G'lik bir iğne ve 1 mL'lik bir şırıngadan 10 kez geçirerek agregaları parçalayın.
  3. Sonikasyon sırasında mümkün olduğunca serin tutmak için numuneyi bir buz banyosuna yerleştirin.
  4. Sonikasyon iğnesini etanol ile temizleyin. Numuneyi, iğne tüpün altından 1 cm yukarıda ve duvarlara değmeyecek şekilde sonikatör içine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  5. Görev döngüsünü P'ye ve çıkışı 0'a ayarlayın. Sonikatörü başlatın ve numunede köpük oluşmadığından emin olun (aksi takdirde, iğne konumunu durdurun ve yeniden ayarlayın). Çıkış gücünü yavaşça 2'ye yükseltin ve ardından 2 dakika boyunca sonikasyon yapın.
  6. Sonikatörü kapatın, çıkış gücünü tekrar 0'a ayarlayın ve numunenin 2 dakika dinlenmesine ve soğumasına izin verin.
  7. Örnek başına toplam dört sonikasyon ve soğuma seti için 4.5-4.6 adımlarını tekrarlayın. Numuneyi çıkarın, buz üzerinde saklayın ve ardından diğer numunelerle tekrarlayın. Sonikatör iğnesini numuneler arasında ve sonunda etanol ile temizleyin.
    NOT: Sonikasyon yoğunluğu ve döngü sayısının, 150-500 bp boyutunda parçalar verirken en düşük sonikasyon yoğunluğuna ulaşmak için optimize edilmesi gerekebilir.

5. DNA ekstraksiyonu ve parça boyutu kontrolü

NOT: IP'ye geçmeden önce, parçaların boyutunun kontrol edilmesi gerekir. Parçalar çok büyükse (>500 bp), sonikasyon döngülerinin sayısı ve / veya sonikasyon yoğunluğu arttırılmalıdır; Çok küçüklerse (<150 BP), sonikasyon süresi ve / veya yoğunluğu azaltılmalıdır.

  1. Numunenin bir alt kümesinde parça boyutu kontrolünü gerçekleştirirken numuneyi buz üzerinde tutun. 100 μL'lik bir alt kümeyi 1.5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
  2. 8 μL RNase kokteyli ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 700 rpm'de çalkalarken 42 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  3. 2 μL proteinaz K ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). ve 700 rpm'de çalkalarken 55 °C'de 1 saat inkübe edin.
  4. Numuneyi, 700 rpm'de çalkalarken en az 1 saat 95 °C'de inkübe ederek ters çapraz bağlayın.
  5. 1x TAE tamponu ve% 0.01 etidyum bromür ( Malzeme Tablosuna bakınız) ile% 1 agaroz jeli veya alternatif bir jel lekesi hazırlayın.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir saflaştırma kiti kullanarak numuneden DNA'yı çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
  7. Ekstrakte edilen DNA'nın parçalanma boyutunu kontrol etmek için, agaroz jeli bir merdiven ve numune ile yükleyin. 4 μL 1 kbp merdiveni 1 μL 6x mor yükleme boyası ile karıştırın ve agaroz jelin bir oyuğuna yerleştirin. 20 μL DNA'yı 4 μL 6x mor yükleme boyası ile 1x nihai konsantrasyon için karıştırın ve bir kuyuya pipetleyin. Tüm örnekler için tekrarlayın.
  8. Jeli yaklaşık 30 dakika boyunca 100 V'ta çalıştırın ve ardından jeli bir tepsiye yükleyerek, jel görüntüleme sistemine yerleştirerek ve ilgili sistemin yazılımının talimatlarını izleyerek görüntüleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Ortalama 150-500 bp arasında olması gereken parçalanma boyutlarına göre devam edip etmeyeceğinize karar verin (Şekil 2).

figure-protocol-2
Şekil 2: Parça boyutu kontrolü. Sonikasyonu takiben, numunenin bir alt kümesi çapraz bağlanır, saflaştırılır ve kromatinin 150-500 bp arasındaki parça boyutlarına kesildiğinden emin olmak için bir agaroz jel üzerinde çalıştırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

6. İmmünopresipitasyon (IP)

  1. Bir pipet kullanarak, DNA ekstraksiyonu sırasında buz üzerinde tutulan ana numunenin hacmini kontrol edin. % 1'lik bir nihai konsantrasyona% 10 Triton X-100 ekleyin.
  2. Numuneyi 20.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika döndürün ve ardından süpernatantı bir pipet kullanarak temiz bir tüpe aktarın.
    NOT: Numune burada -80 °C'de 2 aya kadar dondurularak deney duraklatılabilir. Aşağıdaki IP adımlarının ayrıntılarının her deneme için ayarlanması ve optimize edilmesi gerekir. IP başına antikor miktarının optimize edilmesi gerekebilir.
  3. Lizis tamponunu boş olarak kullanarak, mevcut bir DNA konsantrasyon ölçüm sisteminin talimatlarını izleyerek kromatin konsantrasyonunu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Numune hacmine ve planlanan IP sayısına bağlı olarak, sırasıyla% 1 ve 1x'lik nihai konsantrasyonlara% 10 Triton X-100 ve 100x PIC ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek numunenin toplam hacmini artırın. Toplam 1.000 μL hacimde 100 μg kromatin kullanılması tavsiye edilir.
  5. Her IP için hacmi ayrı, düşük tutmalı 1,5 mL'lik bir tüpe dağıtın (Malzeme Tablosuna bakınız). ChIP-qPCR için, eşdeğer hacimdeki numuneyi sahte kontrol olarak 1,5 mL'lik başka bir tüpe yerleştirin. Giriş kontrolü olarak IP'lerin hacminin 'unu alın ve -20 °C'de saklayın.
  6. Her bir IP'ye 4 μg antikor (burada, H3K4me3 antikoru, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Sahte hiçbir şey eklemeyin. IP reaksiyonlarını ve mock'u tüp döndürücü üzerinde gece boyunca 12 rpm'de ve 4 ° C'de inkübe edin.

7. İmmünokomplekslerin manyetik boncuklarla geri kazanılması

NOT: Manyetik boncukları kurutmaktan daima kaçının; Onları sıvı ile kapalı tutun veya çözeltileri mümkün olduğunca çabuk doldurun. Her zaman birbiri ardına bir numune üzerinde çalışın.

  1. Karıştırmak için manyetik boncukları yavaşça ters çevirin ( Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Gün içinde taze 10 mL bloke edici solüsyon (Tablo 1) hazırlayın ve hafifçe karıştırın.
  3. Çapı artırmak için bir pipet ucunun ucunu kesin ve 50 μL manyetik boncukları ayrı tüplere aktarın (IP başına bir tüp ve sahte için bir tüp).
  4. Her tüpe 1 mL bloke edici çözelti ekleyin ve bunları 12 rpm ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir döndürücü üzerinde inkübe edin.
  5. Boncukları manyetik bir rafa üzerindeki engelleme solüsyonuna yerleştirin ve ayrılmasını bekleyin. Bu arada, duvarlardaki kalıntıları gidermek için IP reaksiyonlarını oda sıcaklığında 3-5 saniye boyunca 2.000 x g'da döndürün.
  6. Bir pipet kullanarak, bloke edici çözelti süpernatantını çıkarın ve atın ve ardından boncukları numunelerden biri veya sahte ile duvardan yıkayın. Karışımı ilgili düşük tutma tüpüne geri yerleştirin ve ardından bir sonraki örneğe geçin.
  7. Tüm tüpleri bir döndürücü üzerinde 12 rpm ve 4 ° C'de 3 saat inkübe edin.

8. Yıkama, elüsyon ve çapraz bağın tersine çevrilmesi

  1. İmmünokompleks geri kazanım inkübasyonu sırasında yıkama tamponlarını ve TE tuz tamponunu (Tablo 1) hazırlayın.
  2. İnkübasyondan sonra, IP'leri ve mock'u manyetik rafa yerleştirin ve mıknatısların ayrılması için yaklaşık 10-20 s bekleyin.
  3. Süpernatanı atın ve düşük tuzlu 1 mL yıkama tamponu ekleyin. Tüm reaksiyonlarla tekrarlayın ve ardından tüpleri manyetik raftan çıkarın ve boncuklar askıya alınana kadar karıştırın.
  4. 12 rpm ve 4 °C'de bir döndürücü üzerinde 5 dakika inkübe edin.
  5. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin, düşük tuzlu yıkama tamponunu çıkarın, ardından yüksek tuzlu 1 mL yıkama tamponu ekleyin ve adım 8.4'teki gibi inkübe edin.
  6. Dönüşümlü olarak düşük ve yüksek tuz kullanarak toplam dört yıkama için 8.3-8.5 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
    NOT: Yüksek tuzlu yıkama tamponu çok serttir ve her yıkama adımında yalnızca tam olarak 5 dakika kullanılmalıdır.
  7. Süpernatanı bir pipet kullanarak çıkarın ve atın ve 1 mL TE tuz tamponu ile yıkayın; Bir kez daha tekrarlayın. İkinci yıkamadan sonra, tüp kapağındaki boncukları temizleyin.
  8. Yıkama sırasında elüsyon tamponunu (Tablo 1) yapın. İkinci TE tuz tamponu yıkamasını attıktan sonra, her reaksiyona 210 μL elüsyon tamponu ekleyin.
  9. Manyetik boncukları askıya alın ve 65 °C'de elüteleyin, 700 rpm'de 15 dakika sallayın.
  10. Reaksiyonları manyetik rafa yerleştirin, elüatı toplayın ve 1.5 mL'lik yeni bir tüpe yerleştirin.
  11. Elüsyon işlemini başka bir 210 μL elüsyon tamponu ile tekrarlayın ve IP başına 420 μL elüte nihai hacmi için elüatı ilk partiye ekleyin ve taklit edin.
  12. Girişi dondurucudan çıkarın ve toplam 420 μL hacme elüsyon tamponu ekleyin.
  13. Tüm elüatları ve girdiyi gece boyunca 65 °C ve 700 rpm'de inkübe ederek ters çapraz bağlayın.

9. Protein ve RNA sindirimi ve DNA saflaştırması

  1. Elüata ve girişe 420 μL TE tuz tamponu ekleyerek SDS ( Malzeme Tablosuna bakınız) konsantrasyonunu %0,5'e kadar seyreltin.
  2. RNA sindirimi için 10 μL RNase kokteyli ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 42 ° C'de 700 rpm'de 30 dakika inkübe edin.
  3. Protein sindirimi için, hepsine 8 μL proteinaz K ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 55 ° C'de 700 rpm'de 1 saat inkübe edin.
  4. DNA saflaştırması için, bazı ayarlamalarla "MicroChIP için Ren Lab ENCODE Doku Fiksasyonu ve Sonikasyon Protokolü"23 izleyin:
    1. Faz Kilit jeli ile tüpleri hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın) jeli oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 20.000 x g'da tüpün dibine döndürerek.
    2. Bir çeker ocak altında, her tüpe bir numune ve aynı hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1) ekleyin. Tüpleri kuvvetlice çalkalayın ve köpüklü beyaz bir tabaka oluşturana kadar kısa bir süre girdaplayın.
      DİKKAT: Karışım toksik, aşındırıcı ve sağlık açısından tehlikelidir.
    3. 4 °C ve 20.000 x g'de 10 dakika döndürün. Sulu fazın temiz olup olmadığını kontrol edin.
    4. Sulu fazı bir pipet kullanarak taze bir tüpe aktarın. Olası numune hacmine bağlı olarak numune başına iki taze tüp gereklidir. Bu durumda, numunenin yarısını birinciden ikinci bir tüpe aktarın.
    5. Her numuneye 3 M sodyum asetat (NaAc, örneğin 400 μL'lik bir numune için 40 μL) ve 10 μL 5 mg/mL lineer akrilamit içindeki hacmin 1/10'unu ekleyin ve karıştırmak için ters çevirin.
    6. 0 etanolde numune hacminin 2 katını ekleyin (örneğin, 400 μL'lik bir numune için 800 μL) ve kuvvetlice çalkalayın. DNA'ya zarar verebileceğinden girdap yapmayın.
    7. Gece boyunca −20 °C'de veya −80 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    8. Santrifüjü 4 °C'ye soğutun ve ardından DNA'yı peletlemek için numuneleri 15.000 x g'da 30 dakika döndürün.
    9. Peletleri dikkatlice boşaltın ve ardından 1 mL% 70 EtOH ile yıkayın. 4 °C'de 5 dakika maksimum hızda döndürün.
    10. Dikkatlice boşaltın ve ardından birkaç saniye tekrar döndürün. Tüm etanolü çıkarmak için bir pipet kullanın. Küçük bir parça kaldıysa, tekrar döndürmeye yardımcı olabilir.
    11. Peletleri 30 μL nükleaz içermeyen suda yeniden süspanse edin ( bkz.
      NOT: Numune başına birkaç tüp varsa, bir peleti 30 μL'de yeniden süspanse edin, bir sonraki tüpe aktarın ve bir sonraki peleti aynı 30 μL'de yeniden süspanse edin.
  5. DNA konsantrasyonunu ölçün ve ardından numuneyi -20 °C'de saklayın.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü takiben, histon 3 lizin 4'ün (H3K4me3) trimetilasyonu ile ilişkili DNA immünopresipite edildi. ChIP-seq dereceli antikor daha önce deniz anemonu Nematostella vectensis7'de kullanılmış ve burada E. diaphana doku kesitlerinin immünofloresan boyanması ile doğrulanmıştır (Şekil 3). DNA verimi, girdi materyalinin miktarına bağlı olmakla birlikte, düzenli olarak 100 ng / μL civarındaydı. Elde edilen DNA fragmanları dizileme ve qPCR ( Ek Dosya 1'deki primer listesi) ile analiz edildi.

40 milyon okumalık bir sıralama derinliği, ~17,6 milyon benzersiz şekilde eşlenmiş okuma sağladı. Kalite kontrollerinden sonra, ham okumalar kırpıldı ve Bowtie24 kullanılarak E. diaphana genomuna eşlendi (bkz. Malzeme Tablosu). ChIP-Seq verilerinin MACS ile model tabanlı analizi (Malzeme Tablosuna bakınız) toplam 19.107 tepe noktası tanımlamıştır25. H3K4me3 için beklendiği gibi, çoğu tepe noktası transkripsiyonel başlangıç bölgesinin (TSS) yakınında bulunuyordu ve tepe sayısı frekansı, TSS'nin her iki tarafında, özellikle de gen gövdesine doğru keskin bir şekilde azaldı (Şekil 4).

Dizileme verilerinden TSS'leri etrafında yüksek zirvelere sahip üç gen tanımlandı ve qPCR primerleri, bu genler içindeki birkaç yüksek tepe lokusunu hedeflemek için tasarlandı. qPCR verileri, giriş yüzdesi yöntemi kullanılarak normalize edildi (Şekil 5). Giriş ve sahte kontrollere göre H3K4me3'ün yüksek oranda zenginleştirilmesi gözlendi. Girdi yüzdesi %2.7 ile .7 arasında değişmekte olup, genler arasında ve aynı gen içindeki farklı lokuslar arasında zenginleştirme farklılıkları gözlenmiştir.

figure-results-1
Şekil 3: H3K4me3'ün immünofloresan boyanması. Bir E. diaphana doku kesiti, (A) mavi Hoechst nükleik asit boyası ve (B) H3K4me3'e karşı primer antikora karşı sarı florofor işaretli bir ikincil antikor ile boyandı. (C) Çekirdekte birlikte lokalizasyonu gösteren A ve B'nin örtüşmesi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: Transkripsiyonel başlangıç bölgesi etrafındaki yüksek tepe sayısı frekansı. Transkripsiyonel başlangıç bölgesi (TSS) çevresinde yukarı akış (-) ve aşağı (+) 2.000bp'yi kapsayan H3K4me3 modifikasyonunun tepe sayım frekansının dağılımı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Resim 5: H3K4me3 ChIP-qPCR, Exaiptasia diaphana'da. Sonuçlar, girdinin yüzdesi (%) olarak temsil edilir. İlgili genlerin (AIPGENE12312, AIPGENE26042 ve AIPGENE5950) transkripsiyonel başlangıç bölgesine yakın lokuslar ChIP-qPCR için seçildi. Hata çubukları, kopyalar arasındaki standart sapmayı gösterir, n = 3. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: qPCR için kullanılan primerlerin listesi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Yukarıdaki protokolü takiben, elde edilen DNA ChIP-qPCR ve ChIP-Seq için başarıyla kullanıldı. Daha önce diğer organizmalardan 26,27,28 bildirilen H3K4me3 için aynı genel tepe profili burada elde edildi, en yüksek tepe TSS çevresinde ve ChIP-qPCR'de beklenen bölgelerde yüksek zenginleştirme ile. ChIP-Seq verilerindeki nispeten yüksek sayıda çarpma eşlenmiş okuma, PCR kopyalarından kaynaklanmış olabilir. Benzersiz bir şekilde eşlenmiş okumaların miktarı, PCR kopyalarını azaltmak için DNA kütüphanesi hazırlama protokolünde yapılan değişikliklerle artırılabilir. ChIP-qPCR verileri için birkaç normalleştirme yöntemi vardır ve burada sunulan giriş yönteminin yüzdesi daha yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem, ChIP sırasında girdinin IP ve sahte örneklerden farklı şekilde işlenmesi dezavantajıyla IP'yi ve sahte örnekleri doğrudan girişe normalleştirir ve bu da hatalara neden olabilir. Alternatif kat zenginleştirme yöntemi, aynı astar setlerini kullanarak sahte sinyale dayalı olarak IP'nin sinyalini normalleştirir, böylece arka plan üzerinden bir sinyal-arka plan oranı verir. Bununla birlikte, sahte numunenin sinyal yoğunluğu büyük ölçüde değişebilir ve bu da veriler üzerinde büyük etkilere sahiptir. ChIP-qPCR ve veri normalizasyonu hakkında ayrıntılı bir tartışma Haring ve ark.29'da bulunabilir.

Yaygın ChIP protokollerine kıyasla yukarıda sunulan yöntemde önemli bir ayarlama, histon proteinleri için yaklaşık 15 dakikadan bir gece inkübasyona kadar çok daha uzun çapraz bağlama süresidir. Bu ayarlamanın temel amacı, çekirdek içindeki protein-DNA etkileşimlerini korumak için fiksatif formaldehitin mukus tabakasından E. diaphana'nın daha derin dokusuna nüfuz etmesini kolaylaştırmaktır. Bu adımın optimizasyonu, protein-DNA etkileşimlerini çapraz bağlama olmadan korumak için yeterli çapraz bağlanmayı sağlamak için kritik öneme sahiptir, bu yüzden kromatinin sonikasyon ile kesilmesi etkisiz hale gelir. SDS gibi deterjanların eklenmesi, sonikasyon verimliliğini de artırabilir29. Ek olarak, formaldehit ile uzun bir inkübasyonun homojenizasyon adımını kolaylaştırdığı ve çapraz bağlama adımından önce homojenize edilen taze veya donmuş anemonlara kıyasla daha ince ve eşit bir şekilde öğütülmüş bir numune ile sonuçlandığı bulundu. Önerilen parça uzunlukları aralıkları 100 bp ile 1.000 bp29,30 arasında değişir ve hedef proteine bağlı olabilir. Her kullanıcının, istenen parça uzunluğuna mümkün olduğunca az sonikasyon gücü ile ulaşmak için sonikasyon koşullarını optimize etmesi çok önemlidir, çünkü aşırı sonikasyon proteinleri denatüre edebilir ve böylece IP31'i etkileyebilir. ChIP'nin bir başka sınırlaması, özellikle anemonlar gibi nispeten küçük organizmaları etkileyen gerekli malzeme miktarıdır; Bu sorun, adımlar arasındaki numune kaybı azaltılarak giderildi. Numune homojenize edildikten sonra hemen parçalandı, böylece birkaç yaygın çekirdek hazırlama adımı atlandı. 20 anemondan elde edilen numune havuzu genellikle üç IP ve hem sahte hem de giriş kontrolleri için yeterli kromatin içeriyordu. Başlangıç materyali miktarı (yani, anemon sayısı) gelecekte, özellikle sadece bir hedef protein ile bir ChIP gerçekleştirirken daha da azaltılabilir. Amaçlanan aşağı akış yöntemine bağlı olarak, kontroller ayarlanmalıdır; ChIP-qPCR için ek kontroller29 içerdiği düşünülmelidir, ChIP-seq için ise sahte bir giriş kontrolü lehine atlanabilir.

Antikor validasyonu bu protokolün kapsamı dışında olmasına ve bu nedenle burada sadece kısaca değinilmesine rağmen, ChIP'yi gerçekleştirmeden önce kritik bir adımdır. Özellikle omurgasız türler üzerinde ticari antikorlar kullanıldığında, istenen hedefler için spesifik antikorların mevcudiyeti bir sınırlama olabilir. İlk adımda, E. diaphana ve zebra balığı ve fareler de dahil olmak üzere diğer model organizmaların H3 N-terminal kuyruk dizisi karşılaştırıldı ve yüksek oranda korunmuş olduğu bulundu12. Antikor özgüllüğü daha sonra nükleik asit ve antikorun sinyallerini birlikte lokalize eden immünofloresan kullanılarak test edildi. Dizileme verilerinden elde edilen TSS etrafındaki H3K4me3'ün tepe profili, antikorun özgüllüğü konusunda daha fazla güven verir.

Antikor özgüllüğü ile ilgili bir başka husus, E. diaphana'nın yanı sıra diğer birçok antozoanın hücrelerinde barındırdığı simbiyotik dinoflagellatlarla herhangi bir etkileşim olasılığıdır. Lingulodinium32 ve Symbiodinium33 cinslerinin dinoflagellatlarındaki transkriptom analizleri, düşük ekspresyon seviyelerinde çekirdek histon H3 ve birkaç H3 varyantı dahil olmak üzere histon kodlayan genler bulmuştur ve histon kodunun fonksiyonel korunmasının kapsamı belirsizdir34. Marinov ve Lynch34 , dinoflagellat türleri içinde ve arasında H3 varyantı N-terminal kuyruklarının dizi korunumunu karşılaştırdı ve Symbiodiniaceae türleri, özellikle bitişik amino asitlerin lizin 4 ile uyumunu bir faktör olarak göz önüne alındığında, kuyruk dizisinde lizin 4 etrafında yüksek bir sapma gösterdi. Bu bölgenin aynı zamanda Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster ve Saccharomyces cerevisiae gibi E . diaphana12 dizisine uyan diğer model türlerden de ayrıldığı gösterilmiştir. Bu nedenle, H3K4me3'e karşı antikorun dinoflagellat H3 ile istenmeyen etkileşimi riski düşüktür. Ek olarak, diziler yalnızca E. diaphana genomuna hizalanır ve qPCR primerleri, E . diaphana dizilerine özgü olmalı ve istenmeyen olarak çökeltilmiş diziler için ekstra bir filtrasyon katmanı sağlamalıdır.

Sunulan ChIP protokolü, qPCR ve yeni nesil dizileme için yeterli DNA sağlar ve her kullanıcı tarafından bireysel optimizasyon muhtemelen gerekli olsa da, muhtemelen simbiyoz ve çevresel değişiklikler bağlamında, bentik cnidarianlarda protein-DNA etkileşimlerinin daha fazla araştırılması için bir başlangıç noktası sağlar.

Açıklamalar

Hiç kimse.

Teşekkürler

Hiç kimse.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 kb Plus DNA Merdivenİnvitrojen10787018
%100 Etanol
15 mL şahin tüpleri
%16 Formaldehit Çözeltisi (a/h), Metanol içermezThermo scientific28906
5 mL tüp
5PRIME Faz Kilidi tüpleriQuantabio2302820Faz kilidi jel - ışık
AGANI iğnesi 25 GTerumoAN * 2516R1
Agaroz
Sığır Serumu AlbüminSigma-AldrichA7030
Papyonaçık kaynak, https://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
Branson sonifier 250BransonSonicator 
Santrifüj Eppendorf5430 R15 mL ve 1.5 mL tüpler için rotorlu
ChIP dereceli antikor (burada poliklonal H3K4me3 antikoru)DiagenodeC15410003
Komple EDTA İçermeyen Proteaz İnhibitörü KokteyliRoche11873580001100x stok için 2 tablet/mL su
Kapak camıvwr48393 194
Tek Kullanımlık Spatulavwr80081-188
DNA saflaştırma kiti (burada QIAGEN QIAquick PCR saflaştırma kiti)QIAGEN28104
Dounce doku öğütücüWheatonsıkı havaneli
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu (DPBS) 1xgibco14190-094
Dynabeads Protein GThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-Aldrich3609
EGTASigma-Aldrich324626
Elektroforez sistemi
Etidyum bromür
FASTQC v0.11.9yazılımı
Gel Doc EZ Dokümantasyon SistemiBio-Rad1708270Jel görüntüleme sistemi
GlycineSigma-Aldrich50046
Injekt-F Tüberkülin şırıngası 1 mLB. Braun9166017V
Lineer akrilamid (5 mg/mL)InvitrogenAM9520
Düşük retansiyonlu 1,5 mL tüp
1,5 mL tüpler içinmanyetik ayırma rafı
Mikroskop Mikroskop
lamı
ChIP-Seq (MACS)açık kaynaklı
Harç ve havaneli, porselen
NanoDrop 2000c spektrofotometrenin, Thermo scientific ND-2000C
N-lauroylsarcosineSigma-Aldrich61739
Nükleaz içermeyen su
Pasteur pipeti
Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol Karışımı (25:24:1)Sigma-Aldrich77617
Proteinaz K (20 mg/mL)AmbionAM2546
Mor Yükleme Boyası 6xNew England BioLabsB7024S
Qubit 2.0 FlorometreInvitrogen
RNase Kokteyl Enzim KarışımıİnvitrojenAM2286RNase A = 500 U/mL, RNase T1 = 20000 U/mL
Sodyum asetatSigma-AldrichS2889
Sodyum klorürSigma-AldrichS9888
Sodyum deoksikolatSigma-Aldrich30970
SYBR Güvenli DNA Jel LekesiInvitrogenS33102
TAE tampon
TermomikserEppendorf5384000012
Tris tabanıSigma-Aldrich10708976001
Triton X-100 çözeltisiSigma-Aldrich93443
Tripan Mavi Leke (% 0.4)Gibco15250-061Tehlike: kansere neden olabilir. Doğurganlığa veya doğmamış çocuğa zarar verme şüphesi
var Tüp döndürücü SB3Stuart
UltraPure SDS Solüsyonu, %10Canlandırıcı15553027
Vakum pompası
Model Tabanlı Analizi

Kaynaklar

  1. Pörtner, H. -O. 2022: Summary for Policymakers. Climate Change 2022: Impacts, Adaptation, and Vulnerability. Contribution of Working Group II to the Sixth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2022).
  2. Cziesielski, M. J., Schmidt-Roach, S., Aranda, M. The past, present, and future of coral heat stress studies. Ecology and Evolution. 9 (17), 10055-10066 (2019).
  3. Eirin-Lopez, J., Putnam, H. Marine environmental epigenetics. Annual Review of Marine Science. 11, 335-368 (2021).
  4. Rädecker, N. Using Aiptasia as a model to study metabolic interactions in cnidarian-Symbiodinium symbioses. Frontiers in Physiology. 9 (214), (2018).
  5. Baumgarten, S. The genome of Aiptasia, a sea anemone model for coral symbiosis. PNAS. 112 (38), 11893-11898 (2015).
  6. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  7. Schwaiger, M. Evolutionary conservation of the eumetazoan gene regulatory landscape. Genome Research. 24 (4), 639-650 (2014).
  8. Zhang, X., Jacobs, D. A broad survey of gene body and repeat methylation in cnidaria reveals a complex evolutionary history. Genome Biology and Evolution. 14 (2), evab284(2022).
  9. Schwaiger, M. An ancestral Wnt-Brachyury feedback loop in axial patterning and recruitment of mesoderm-determining target genes. Nature Ecology & Evolution. 6 (12), 1921-1939 (2022).
  10. Ozment, E., et al. Cnidarian hair cell development illuminates an ancient role for the class IV POU transcription factor in defining mechanoreceptor identity. Elife. 10, e74336(2021).
  11. Baumgarten, S., et al. Evidence for miRNA-mediated modulation of the host transcriptome in cnidarian-dinoflagellate symbiosis. Molecular Ecology. 27 (2), 403-418 (2018).
  12. Li, Y. DNA methylation regulates transcriptional homeostasis of algal endosymbiosis in the coral model Aiptasia. Science Advances. 4 (8), eaat2142(2018).
  13. Rodriguez-Casariego, J. A., Cunning, R., Baker, A. C., Eirin-Lopez, J. M. Symbiont shuffling induces differential DNA methylation responses to thermal stress in the coral Montastraea cavernosa. Molecular Ecology. 31 (2), 588-602 (2021).
  14. Putnam, H. M., Davidson, J. M., Gates, R. D. Ocean acidification influences host DNA methylation and phenotypic plasticity in environmentally susceptible corals. Evolutionary Applications. 9 (9), 1165-1178 (2016).
  15. Weizman, E., Levy, O. The role of chromatin dynamics under global warming response in the symbiotic coral model Aiptasia. Communications Biology. 2, 282(2019).
  16. Liew, Y. J. Epigenome-associated phenotypic acclimatization to ocean acidification in a reef-building coral. Science Advances. 4 (6), eaar8028(2018).
  17. Liew, Y. J. Intergenerational epigenetic inheritance in reef-building corals. Nature Climate Change. 10 (3), 254-259 (2020).
  18. Liew, Y. J., et al. Identification of microRNAs in the coral Stylophora pistillata. PLoS One. 9 (3), e91101(2014).
  19. Huang, C., et al. Identification of long non-coding RNAs in two anthozoan species and their possible implications for coral bleaching. Scientific Reports. 7, 5333(2017).
  20. Rodriguez-Casariego, J. A., et al. Coral epigenetic responses to nutrient stress: Histone H2A.X phosphorylation dynamics and DNA methylation in the staghorn coral Acropora cervicornis. Ecology and Evolution. 8 (23), 12193-12207 (2018).
  21. Bodega, B., et al. A cytosolic Ezh1 isoform modulates a PRC2-Ezh1 epigenetic adaptive response in postmitotic cells. Nature Structural & Molecular Biology. 24 (5), 444-452 (2017).
  22. Jordán-Pla, A., Visa, N. Considerations on experimental design and data analysis of chromatin immunoprecipitation experiments. Chromatin Immunoprecipitation., edited by Visa, N., Jordán-Pla, A. Visa, N., Jordán-Pla, A. , Humana Press. Totowa, NJ. 9-28 (2017).
  23. ENCODE. Ren Lab ENCODE Tissue Fixation and Sonication Protocol for MicroChIP. , Stanford University. Available from: https://www.encodeproject.org/documents/ (2023).
  24. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, R25(2009).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nature Protocols. 7, 1728-1740 (2012).
  26. Howe, F. S., Fischl, H., Murray, S. C., Mellor, J. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. BioEssays. 39 (1), e201600095(2017).
  27. Zhang, Z., Shi, L., Dawany, N., Kelsen, J., Petri, M. A., Sullivan, K. E. H3K4 tri-methylation breadth at transcription start sites impacts the transcriptome of systemic lupus erythematosus. Clinical Epigenetics. 8, 14(2016).
  28. Li, X. High-resolution mapping of epigenetic modifications of the rice genome uncovers interplay between DNA methylation, histone methylation, and gene expression. The Plant Cell. 20, 2-276 (2008).
  29. Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2014).
  30. Landt, S. G. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  31. Raha, D., Hong, M., Snyder, M. ChIP-Seq: A method for global identification of regulatory elements in the genome. Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 21, Unit 21.19.1-Unit 21.19.14 (2010).
  32. Roy, S., Morse, D. A full suite of histone and histone modifying genes are transcribed in the dinoflagellate Lingulodinium. PLoS One. 7 (4), e34340(2012).
  33. Bayer, T., et al. Symbiodinium transcriptomes: Genome insights into the dinoflagellate symbionts of reef-building corals. PLoS One. 7 (4), e35269(2012).
  34. Marinov, G. K., Lynch, M. Diversity and divergence of dinoflagellate histone proteins. G3 Genes, Genomes, Genetics. 6 (2), 397-422 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ChIP-SeqCnidaria EpigenetiğiHiston ModifikasyonlarıProtein-DNA EtkileşimleriH3K4 TrimetilasyonuKantitatif PCRKromatin Ekstraksiyonuİmmünofloresan Boyama
Cnidarian Model Sisteminde Kromatin İmmünopresipitasyon Ekzaiptazi diafanası
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.