Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Ca 2 + görüntüleme, aksiyon potansiyelleri ve Ca 2 + sitoplazmaya girişi veya hücre içi Ca 2 + depolarının salınımını içeren çeşitli sinyal mekanizmaları dahil olmak üzere hücresel aktivite için bir proxy olarak kullanılabilir. Farelerde dorsal kök ganglionunun (DRG) birincil duyusal nöronlarının Pirt-GCaMP3 tabanlı Ca2+ görüntülemesi, çok sayıda hücrenin aynı anda ölçülmesinin avantajını sunar. 1.800'e kadar nöron izlenebilir, bu da nöronal ağların ve somatosensoriyel süreçlerin in vivo popülasyon düzeyinde normal fizyolojik bağlamlarında bir topluluk olarak incelenmesine izin verir. İzlenen çok sayıda nöron, diğer yöntemler kullanılarak tespit edilmesi zor olacak aktivite kalıplarının tespit edilmesini sağlar. Uyaranlar, fare arka pençesine uygulanabilir ve uyaranların DRG nöron topluluğu üzerindeki doğrudan etkilerinin incelenmesine izin verir. Ca2+ geçicilerini üreten nöronların sayısı veCa2+ geçicilerinin genliği, spesifik duyusal modalitelere duyarlılığı gösterir. Nöronların çapı, aktif lif tiplerinin (zararlı olmayan mekanolara karşı zararlı ağrı lifleri, Aβ, Aδ ve C lifleri) kanıtını sağlar. Spesifik reseptörleri eksprese eden nöronlar, Pirt-GCaMP ile birlikte td-Domates ve spesifik Cre rekombinazları ile genetik olarak etiketlenebilir. Bu nedenle, DRG'nin Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntülemesi, ağrı, kaşıntı, dokunma ve diğer somatosensoriyel sinyalleri incelemek için popülasyon düzeyinde bir topluluk görevi gören spesifik duyusal modalitelerin ve nöron alt tiplerinin analizi için güçlü bir araç ve model sağlar.
Giriş
Primer duyusal nöronlar doğrudan cildi innerve eder ve somatosensoriyel bilgiyi merkezi sinir sistemine geri taşır 1,2. Dorsal kök gangliyonları (DRG'ler), 10.000-15.000 birincil duyusal nöronunhücre gövdesi kümeleridir 3,4. DRG nöronları farklı boyutlarda, miyelinasyon düzeylerinde ve gen ve reseptör ekspresyon paternleri sunar. Daha küçük çaplı nöronlar ağrıyı algılayan nöronları içerir ve daha büyük çaplı nöronlar tipik olarak ağrılı olmayan mekanik uyaranlara cevap verir 5,6. Yaralanma, kro....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm prosedürler, San Antonio'daki Teksas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
NOT: Bir kez başladıktan sonra, hayvan cerrahisi (adım 1) ve görüntüleme (adım 2) sürekli olarak tamamlanmalıdır. Veri analizi (adım 3) daha sonra yapılabilir.
1. Sağ taraf L5 DRG görüntüleme için hayvanın ameliyatı ve emniyeti
NOT: Bu çalışmada 8 haftalık ve daha büyük hem erkek hem de dişi Pirt-GCaMP3 C57BL/6J fareler kullanılmıştır. Her iki cinsiyet de eşit der....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 4: Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının temsili görüntüleri. (A,D) Pirt-GCaMP3 farelerinin L5 dorsal kök ganglionlarının tek kareli yüksek çözünürlüklü taramaları gösterilmiştir. (B,E) . Uyaranların yokluğunda, sırasıyla panel A ve panel D'den 15 kare Pirt-GCaMP3 L5 DRG gangli.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kalıcı ağrı, çok çeşitli bozukluklarda mevcuttur, insanların yaklaşık% 8'i için yaşam kalitesini zayıflatır ve / veya azaltır29. Birincil duyusal nöronlar ciltteki zararlı uyaranları tespit eder ve plastisiteleri kalıcı ağrıya katkıda bulunur8. Nöronlar hücre kültüründe ve eksplantlarda incelenebilirken, bunu yapmak onları normal fizyolojik bağlamlarından uzaklaştırır. DRG'nin cerrahi maruziyeti, ardından Pirt-GCaMP3 Ca2 + görüntüleme, arka pençeye uygulanan uyar.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibeleri R01DE026677 ve R01DE031477 (Y.S.K.'ye), UTHSCSA başlangıç fonu (YSK) ve Teksas Üniversitesi sisteminden (YSK) Yükselen STAR Ödülü ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Anased Enjeksiyon (Ksilazin) | Covetrus, Akorn | 33197 | |
| C Epiplan-Apochromat 10x/0.4 DIC | Cal Zeiss | 422642-9900-000 | |
| Pamuk Uçlu Aplikatörler | McKesson | 24-106-1S | |
| Kavisli Hemostat | Güzel Bilim Araçları | 13007-12 | |
| DC Sıcaklık Kontrol Cihazı | FHC | 40-90-8D | |
| DC Sıcaklık Kontrol Cihazı Isıtma Yastığı | FHC | 40-90-2-05 | |
| Dumont Seramik Kaplı Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11252-50 | |
| FHC DC Sıcaklık Kontrol Cihazı | FHC | 40-90-8D | |
| Fluriso (İzofluran) | MWI Hayvan Sağlığı, Piramal Grubu | 501017 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Güzel Bilim Araçları | 16221-14 | |
| GelFoam | Pfizer | 09-0353-01 | |
| Ketaset (Ketamin) | Zoetis | KET-00002R2 | |
| Işıldayan Yeşil Sahne Bandı | JSITON/ Amazon | B803YW8ZWL | |
| Matrx VIP 3000 İzofluran Buharlaştırıcı | Midmark | 91305430 | |
| Mikro diseksiyon makası | Roboz | RS-5882 | |
| Mikro diseksiyon yayı makas | Güzel Bilim Araçları | 15023-10 | |
| Mikro diseksiyon yaylı makas | Roboz | RS-5677 | |
| Mini Rektal Termistör Probu | FHC | 40-90-5D-02 | |
| Çalışma makası | Roboz | RS-6812 | |
| Pirt-GCaMP3 C57BL/6J | fareler Johns Hopkins Üniversitesi | N/A | Her iki cinsiyet de eşit derecede iyi görüntülenebilir. Genç farelerde zayıf veya aralıklı Pirt promotör ekspresyonu nedeniyle fareler en az 8 haftalık olmalıdır. |
| SMALGO küçük hayvan algometresi | Bioseb In vivo Araştırma Cihazları | BIO-SMALGO | |
| Stereotaksik çerçeve | Kopf Model 923-B | 923-B | |
| td-Domates C57BL/6J fareler | Jackson Laboratuvarı | 7909 | |
| Üst Plaka, Newport'ta 6 inç x 10 | 290-TP | ||
| TrpV1-Cre C57BL/6J fareler | Jackson Laboratuvarı | 17769 | |
| Zeiss LSM 800 konfokal mikroskop | Cal Zeiss | LSM800 | |
| Zeiss Zen 2.6 Blue Edition Yazılımı | Cal Zeiss | Zen (Blue Edition) 2.6 |
Kaynaklar
- Rivero-Melián, C., Grant, G. Distribution of lumbar dorsal root fibers in the lower thoracic and lumbosacral spinal cord of the rat studied with choleragenoid horseradish peroxidase conjugate. The Journal of Comparative Neurology. 299 (4), 470-481 (1990).
- Wessels, W. J., Marani, E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
