Yöntem makalesi

RPA-CRISPR/Cas12a-SPM ve Derin Öğrenmeye Dayalı DNA Virüs Tespit Sistemi

DOI:

10.3791/64833

⸱

10 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonunu bir CRISPR/Cas12a sistemi ile birleştiren bir protokol sunuyoruz ve hasta başı DNA virüsü tespiti için yapay zeka destekli bir sınıflandırma ile taşınabilir akıllı telefon mikroskobu oluşturuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA virüslerinin eser tespiti için rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA) ve CRISPR/Cas12a sistemini birleştiren hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve bakım noktası (POC) DNA virüsü tespit sistemini rapor ediyoruz. Hedef DNA, RPA ve CRISPR/Cas12a tarafından ayrı ayrı amplifiye edilir ve tanınır, bu da Cas12a'nın florofor söndürücü etiketli bir DNA raportörünü parçalayan ve floresansı genelleştiren kollateral bölünme aktivitesini tetikler. POC tespiti için taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüler çekmek üzere üretilmiştir. Ayrıca, pozitif veya negatif numunelerin ikili sınıflandırması için derin öğrenme modelleri, yüksek doğruluk elde ederek sistem içinde konuşlandırılır. Kurbağa virüsü 3 (FV3, cins Ranavirus, Iridoviridae familyası) bu DNA virüsü POC tespit sistemi için bir örnek olarak test edilmiştir ve tespit sınırları (LoD) 40 dakika içinde 10'ye ulaşabilir. Yetenekli operatörler ve hantal cihazlar olmadan, yapay zeka (AI) destekli sınıflandırmaya sahip taşınabilir ve minyatür RPA-CRISPR/Cas12a-SPM, POC DNA virüsü tespiti için büyük potansiyel gösterir ve bu tür virüslerin yayılmasını önlemeye yardımcı olabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, 20141 ve 20182'de Ebola virüsü hastalığı (EVH) salgını, 2015'te Orta Doğu Solunum Sendromu (MERS)3, 2015'te Zika virüsü hastalığı salgını4, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'nin neden olduğu Koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) dahil olmak üzere farklı virüslerin neden olduğu bulaşıcı hastalık salgınları sık sık meydana gelmiştir.5 ve 2022'de Maymun Çiçeği virüsünün (MKPV) neden olduğu devam eden Maymun Çiçeği (MKPV)6'dir. Salgın bulaşıcı hastalıkların bu ani salgınları çok sayıda ölüme neden olmakta ve büyük ekonomik kayıplar ve sosyal huzursuzluk getirmektedir. Enfeksiyonu hızlı bir şekilde teşhis etmek ve virüsün daha fazla yayılmasını önlemek için acilen hızlı ve doğru bir tespit sistemi gereklidir.

Son zamanlarda, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ve CRISPR ile ilişkili (Cas) proteinler dünya çapında ilgi görmüş ve nükleik asit tespitinde umut verici sonuçlar göstermiştir 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . CRISPR RNA (crRNA) tarafından yönlendirilen CRISPR/Cas12a proteini, hedef DNA'ya bağlanır ve onu parçalar. Bu aktivite, trans-bölünme olarak bilinen spesifik olmayan tek sarmallı DNA'nın (ssDNA) salınmasına yol açar ve nükleik asit tespiti için algılama sinyalini geliştirmek için kullanılabilir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) gibi bazı geleneksel tespit yöntemleri, bakım noktası (POC) tespiti için karmaşık, zaman alıcı ve maliyetlidir. Önceki çalışmamız, CRISPR / Cas12a teknolojisine dayalı Afrika domuz ateşi virüsü (ASFV) için otomatik, entegre ve uygun maliyetli bir tespit sistemini başarıyla geliştirdi. Bu sistemde, amplifikasyona ihtiyaç duymadan 2 saatlik bir zaman dilimi içinde 1 pM'lik bir algılama limitine ulaştık. CRISPR/Cas12a sistemi ve rekombinaz polimeraz amplifikasyonu (RPA), eser DNA tespiti için duyarlılığı ve özgüllüğü geliştirmek üzere birleştirilmiştir. Diğer izotermal amplifikasyon teknikleriyle karşılaştırıldığında, RPA'nın tasarımı basittir ve karmaşık sıcaklık kontrol ekipmanı olmadan daha kısa bir reaksiyon süresine sahip olduğu için kullanımı kolaydır.

Patojenlerin POC tespiti için, sonuç okumaları 16,17,18 için akıllı telefon mikroskobu (SPM), el tipi florimetre veya yanal akış şeritleri gibi aletler geliştirilmiştir. SPM, görüntüleri bir kamera aracılığıyla yakalar ve hızlı veri analizi için bazı mobil uygulamalara yükler. Bu tür bir mikroskopi, yüksek hassasiyete sahip taşınabilir, ucuz ve minyatür bir sinyal toplama sistemi yapar ve H5N1, Zika virüsü ve SARS-CoV-219,20 gibi patojenleri tespit etmede avantajlar göstermiştir. Bu nedenle, hedef DNA virüsünün RPA-CRISPR/Cas12a tespiti tarafından tetiklenen floresan sinyallerini yakalamak için taşınabilir bir SPM oluşturuyoruz. Bir florofor ve bir söndürücüyü birbirine bağlayan ssDNA raportör probu, CRISPR / Cas12a hedef DNA virüsünü tanıdığında parçalanacak ve florofor tarafından yayılan floresan SPM tarafından yakalanabilir.

SPM21'den gelen floresan görüntülerinden sonuç bilgilerini elde etmek için genellikle kullanılan profesyonel yazılımla karşılaştırıldığında, bazı uzmanlar, floresan görüntüleri22 elde ettikten sonra virüs DNA konsantrasyonlarını ölçmek için makine öğrenimi ve derin öğrenmeyi kullanır, bu da daha fazla zaman alıcıdır. Tıbbi görüntülerin sınıflandırılması söz konusu olduğunda, geleneksel sinir ağları (CNN'ler) genellikle ham pikselli görüntülerden uçtan uca bir şekilde özellikleri öğrenmek için kullanılır 23,24,25,26. AlexNet, DenseNet-121 ve EfficientNet-B7 gibi popüler CNN tabanlı derin öğrenme modelleri bu alanda başarıyla uygulanmıştır27,28. Bununla birlikte, belirli alanlarda büyük veri setleri elde etmek zor olabilir ve bu da transfer öğrenmeyi gerektirir29,30. Bu yaklaşım, büyük bir veri kümesine sahip bir derin öğrenme modelini önceden eğitir ve önceden eğitilmiş model, küçük bir veri kümesine sahip yeni bir görev için başlangıç noktası olarak kullanılır. Bu teknik, büyük veri kümelerine olan ihtiyacı azaltabilir, aşırı öğrenmeyle mücadele edebilir ve eğitim süresini azaltabilir31. Burada, pozitif ve negatif numunelerin floresan görüntülerinin ikili sınıflandırması için transfer öğrenmeli derin öğrenme modellerini kullanıyoruz.

Bu yöntemde, DNA virüslerinin iz tespiti için RPA ve CRISPR/Cas12a sistemini birleştiriyoruz. Hedef DNA, RPA ve CRISPR/Cas12a tarafından ayrı ayrı amplifiye edilir ve tanınır, bu da Cas12a'nın florofor söndürücü etiketli bir DNA raportörünü parçalayan ve floresansı genelleştiren kollateral bölünme aktivitesini tetikler. POC tespiti için floresan görüntüleri almak ve ikili sınıflandırma için derin öğrenme modelleri geliştirmek için taşınabilir bir SPM oluşturuyoruz. Yerleşik POC algılama sisteminin şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Yetenekli operatörler ve hantal cihazlar olmadan, yapay zeka (AI) destekli sınıflandırmaya sahip RPA-CRISPR/Cas12a-SPM, POC DNA virüsü tespiti için büyük potansiyel gösterir.

figure-introduction-1
Şekil 1: RPA-CRISPR/Cas12-SPM algılama sisteminin şeması ve toplanan görüntüler için yapay zeka sınıflandırması. Hayvansal kaynaklı örneklerin nükleik asitleri PINDBK tarafından salınır. Virüsün Hedef DNA'sı, RPA-CRISPR/Cas12a sistemi tarafından özel olarak amplifiye edilir ve tanınır. CRISPR/Cas12a, crRNA ile bağlanır ve Cas12a-crRNA kompleksi, hedef DNA ile bağlanır, bu da ssDNA raportör problarında CRISPR/Cas12a'nın kollateral bölünmesini tetikler. Raportör üzerindeki florofor serbest bırakılır ve floresan, ticarileştirilmiş bir plaka okuyucu veya oluşturduğumuz SPM tarafından algılanır. Floresan görüntülerini sınıflandırmak için AlexNet, DenseNet-121 ve transfer öğrenmeli EfficientNet-B7 dahil olmak üzere üç farklı derin öğrenme modeli kullanılır. Bu figür Lei ve ark.35'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numunelerin işlenmesi

  1. Çift sarmallı bir DNA virüsü olan Kurbağa Virüsü 3'ü (FV3, cins Ranavirüs, Iridoviridae ailesi) ele alalım. FV3'ün tespiti için hedef olarak majör kapsid (mcp) genini seçin, çünkü yüksek oranda korunur ve genellikle ranavirüs tespiti için hedef olarak kabul edilir. Seçilen hedef dizi Tablo 1'de gösterilmiştir.
    NOT: Kurbağa Virüsü 3 bu protokolde örnek olarak alınmıştır.
  2. Hedef DNA fragmanlarının hazırlanması için, FV3 ve Enfeksiyöz Dalak ve Böbrek Nekroz Virüsünden (ISKNV, başka bir Ranavirüs) mcp geninin DNA fragmanlarını kullanın.
    NOT: Bu çalışmada, hedef DNA fragmanları, Malzeme Tablosunda listelenen bir şirketten ticari olarak elde edilmiştir. Hedef ve sonraki tespitin kontrolü olarak kabul edilirler.
AdSıra
FV3 MCPNTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcg... 3' (240 bp)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCCCCCC... 3' (240 bp)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 bp)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3' (231 bp)

Tablo 1: Bu yöntemde seçilen hedef dizi.

2. RPA reaksiyonu

  1. Hedef dizi için RPA primer çiftlerini tasarlayın ve sentezleyin. RPA primer çiftlerinin dizileri Tablo 2'de açıklanmıştır.
  2. 5x RPA reaksiyon tamponunu (Tablo 3) ve MgCl2'yi (100 mM) hazırlayın.
  3. Dört temel RPA enzimini (UvsX, UvsY, GP32, Bsu proteini) 1x RPA reaksiyon tamponunda, Tablo 4'te ayrıntılı olarak açıklandığı gibi önceden tasarlanmış primerlerle birlikte karıştırın.
  4. Karışımı iyice girdaplayın.
  5. Her RPA reaksiyonu için 1. adımdan elde edilen hedeften 1 μL ekleyin ve tekrar girdap ile iyice karıştırın.
  6. Reaksiyonu başlatmak için 7 μLMgCl2 (100 mM) ekleyin. Her RPA reaksiyonunun son hacmi 50 μL'dir.
  7. Testi 37 ° C'de 30 dakika boyunca gerçekleştirin.
  8. RPA ürünü 4 °C'de birkaç gün saklanabilir. RPA ürünleri bozuldukça, daha iyi tanı sonuçları elde etmek için mümkün olan en kısa sürede daha fazla algılama için kullanın.
  9. [İsteğe bağlı] DNA jeli elektroforezi yapın.
    1. 5 μL RPA ürününü çıkarın, uygun hacimde 6x DNA yükleme tamponu ekleyin ve Tris-asetat EDTA (TAE) tamponunda DNA jel elektroforezi gerçekleştirin.
    2. Yükleme tamponu bantları jelin dibine ulaşana kadar elektroforezi yaklaşık 20 dakika boyunca 120 V'un altında çalıştırın.
    3. Numunenin bantlarının boyutunu işaretleyicinin bantlarıyla karşılaştırarak hedef dizinin numuneden başarılı bir şekilde yükseltilip yükseltilmediğini belirleyin.
AdSıra
RPA başlangıç bilgisi FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA astarı RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCCCGACCTGGG

Tablo 2: Bu yöntemde kullanılan RPA primerleri.

ParçaOrijinal konsantrasyonİlave
PEG 20.000-114 mg
ATP100 milyon125 μL
dNTP'ler25 milyon48 μL
Tris-HCl1 AYLIK125 μL
DTT (Türkçe)1 AYLIK125 μL
Fosfokreatin1 AYLIK250 μL
Kreatin kinaz10 μg/μL50 μL
ddH2O-277 μL
Toplam Hacim-1 mL

Tablo 3: 5x RPA reaksiyon tamponunun bileşimi (pH 7.5).

ParçaOrijinal konsantrasyonİlave
5x RPA reaksiyon tamponu-10 μL
UvsX proteini5 mg / mL2,6 μL
UvsY proteini5 mg / mL0,9 μL
GP32 proteini5 mg / mL2,54 μL
Bsu proteini5 mg / mL0,88 μL
İleri Astar100 μM0,25 μL
Ters Astar100 μM0,25 μL
ddH2O-24,58 μL
Hedef-1 μL
*MgCl2100 milyon7 μL
Toplam Hacim50 μL
*RPA reaksiyonunu başlatmak için son olarak MgCl2'nin eklenmesi gerekir.

Tablo 4: RPA reaksiyonunun bileşimi.

3. SPM olmadan CRISPR / Cas12a algılama

  1. Hedef dizinin crRNA'larını (Malzeme Tablosu) ve CRISPR/Cas12a için bir florofor ve bir söndürücüyü bağlayan ssDNA raportör probunu kullanın. Burada, karboksi tetrametilrodamin (TAMRA), ssDNA raportör problarının 5' uçlarında florofor ve 3' uçlarında söndürücü olarak Kara Delik Söndürücü-2 (BHQ2) ile bağlanır. CrRNA ve ssDNA raportörünün ayrıntılı dizisi Tablo 5'te açıklanmıştır.
  2. Lachnospiraceae bakterisi Cas12a (LbCas12a) proteinini 10x CRISPR / Cas12a reaksiyon tamponu ile hazırlayın.
  3. 100 μL'lik bir reaksiyon hacminde LbCas12a-crRNA kompleksleri ve 500 nM ssDNA raportör probu ile 1x CRISPR/Cas12a reaksiyon tamponunda bölüm 2'den 1 μL RPA reaksiyon ürününü çözün.
  4. LbCas12a ve crRNA'yı karıştırdıktan sonra, fonksiyonel bir kompleks oluşturmak için karışımın en az 5 dakika bekletilmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımına başka bileşenler ekleyin ve tüm reaksiyonu 37 ° C'de gerçekleştirin. Her CRISPR / Cas12a reaksiyonunun son hacmi 100 μL'dir. Her bir CRISPR/Cas12a reaksiyonundaki her bir bileşenin ayrıntılı konsantrasyonları Tablo 6'da açıklanmıştır.
  5. 100 μL CRISPR/Cas12a algılama reaksiyonunu 37 °C'de 30 dakika boyunca gerçekleştirin.
  6. Floresan sinyallerini, 535 nm'lik bir uyarma dalga boyunda ve 595 nm'lik bir emisyon dalga boyunda 60'lık bir kazançla bir mikroplaka okuyucu tarafından sürekli olarak inceleyin.
    NOT: Uyarma ve emisyon ışığının farklı dalga boylarının tespiti, önceden tasarlanmış ssDNA raportör problarındaki florofor ve söndürücü seçimine bağlıdır.
  7. Toplanan bu veriler için, tüm verileri normalleştirmek için kontrol değerini pozitif numunelerin ölçümüne bölün, ardından bunları iki örnekli bir t-testi analizi için entegre edin.
AdSıra
FV3 için LbCas12a crRNAuaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT
ssDNA muhabiri/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tablo 5: Bu yöntemde kullanılan CRISPR/Cas12a crRNA ve ssDNA raportör dizileri.

ParçaOrijinal konsantrasyonİlave
NEBuffer r2.1-10 μL
lba Cas12a (cpf1)10 μM0,5 μL
crRNA (Kızılderili Elektroniği10 μM0,625 μL
LbCas5a/crRNA kompleksinin birleşmesine izin vermek için en az 12 dakika bekleyin.
DNA muhabiri100 μM0,5 μL
ddH2O-87.375 μL
Hedef-1 μL
Toplam Hacim-100 μL

Tablo 6: CRISPR/Cas12a Reaksiyonunun bileşimi.

4. SPM kurulumu

  1. Uyarma yolu için, lazer yoğunluğunu azaltmak için nötr yoğunluk (ND) filtrelerinden geçecek bir lazer ışını ayarlayın.
  2. Asferik bir mercekten (bundan böyle L1 olarak anılacaktır) toplanmış bir ışın oluşturun ve bunu dikroik ayna (DM) ile yansıtın.
  3. Işığı, numunenin floresansını aydınlatmak ve heyecanlandırmak için objektif (20x) boyunca numunenin yerleştirildiği cam slayta yönlendirin. Numune aşaması, ışını objektifin arka odak düzlemine yönlendirerek hassas odak düzlemi ayarına olanak tanır. Yukarıda bahsedilen adımlar, SPM cihazının uyarma yolunu oluşturur.
  4. Emisyon yolu için, objektifin diğer tarafında bir ara görüntü oluşturmak üzere harici bir lens (bundan böyle L2 olarak anılacaktır) konumlandırın. Objektif aynı anda numuneyi aydınlatır ve emisyon sinyalini toplar.
  5. Emisyon yolunun sonuna yerleştirilmiş akıllı telefonu kullanarak numuneden gelen floresan sinyalini kaydedin. Sallanmayı önlemek için sabit bir braket kullanın.
  6. Uyarılmış ışığı filtrelemek için L1 ile akıllı telefonun kamerası arasına bir bant geçiren filtre ayarlayın ve yalnızca örnekten yayılan ışığın kameraya ulaşmasına izin verin, bu da algılamayı optimize edebilir.
  7. Taşınabilir dağıtım için SPM kurulumunu bir devre tahtası üzerinde hareketsiz hale getirin.
    NOT: RPA-CRISPR/Cas12a reaksiyonuna dayalı floresan tespiti için SPM cihazının şeması ve fiziksel görünümü Şekil 2'de gösterilmiştir. CRISPR/Cas12a algılaması, bir sonraki adımda açıklanan ön işlem görmüş cam slayt üzerinde gerçekleşir.

figure-protocol-1
Şekil 2: Floresan tespiti için kullanılan SPM cihazının şematik ve fiziksel görünümü. (A) RPA-CRISPR/Cas12a reaksiyonundan sonra floresan görüntü toplama için SPM cihazının fiziksel görünümü. (B) RPA-CRISPR/Cas12a reaksiyonuna dayalı floresan tespiti için SPM cihazının şeması. Bu şekil, Lei ve ark.35'in izniyle değiştirilmiştir (ayarlanmış görüntü konumu ve rengi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. SPM ile algılama için cam slaytın işlenmesi

  1. Baz ve sertleştirici maddeyi 10:1 oranında karıştırarak polidimetilsiloksan (PDMS) hazırlayın, ardından 80 °C'de bir ocak gözünde 2 saat pişirin.
  2. Hem PDMS'yi hem de cam slaytı tedavi edin (Uzunluk: 75 mm; Yükseklik: 50 mm) 120 s boyunca oksijen plazma tedavisi ile, ardından bunları birbirine bastırın.
  3. Bardağı/PDMS'yi 95 °C'de 2 saat pişirin; Si-O-Si bağı ile kalıcı olarak mühürlenir. PDMS, yüksek şeffaflığa sahiptir ve otomatik floresan içermez, bu da SPM algılamasına elverişlidir. Cam lam ve PMDS'nin tedavisi He ve ark.32'ye göre yapılır.

6. SPM ile CRISPR / Cas12a algılama

  1. Hedef dizinin crRNA'larını (Malzeme Tablosu) ve CRISPR/Cas12a için bir florofor ve bir söndürücüyü bağlayan ssDNA raportör probunu kullanın. Bu yöntemde, ssDNA raportör problarının 5' uçlarında florofor olarak karboksi tetrametilrodamin (TAMRA) ve 3' uçlarında söndürücü olarak Kara Delik Söndürücü-2 (BHQ2) bağlanır. CrRNA ve ssDNA raportörünün ayrıntılı dizisi Tablo 5'te açıklanmıştır.
  2. Lachnospiraceae bakterisi Cas12a (LbCas12a) proteinini 10x CRISPR / Cas12a Reaksiyon Tamponu ile hazırlayın.
  3. 100 μL'lik bir reaksiyon hacminde LbCas12a-crRNA kompleksleri ve 500 nM ssDNA raportör probu ile 1x CRISPR/Cas12a reaksiyon tamponunda bölüm 2'den 1 μL RPA reaksiyon ürününü çözün.
  4. LbCas12a ve crRNA'yı karıştırdıktan sonra, fonksiyonel bir kompleks oluşturmak için karışımın en az 5 dakika bekletilmesine izin verin. İnkübasyondan sonra, reaksiyon karışımına diğer bileşenleri ekleyin ve reaksiyonu 37 ° C'de tamamlayın. Her CRISPR / Cas12a reaksiyonunun son hacmi 100 μL'dir. Her bir CRISPR/Cas12a reaksiyonundaki her bir bileşenin ayrıntılı konsantrasyonları Tablo 6'da açıklanmıştır.
  5. Ön işlem görmüş cam slayt üzerinde 100 μL CRISPR/Cas12a algılama reaksiyonunu gerçekleştirin ve bir lamel ile örtün. Cam slaytı RT'de reaksiyonla 10 dakika inkübe edin.
  6. SPM ile floresan sinyallerini ölçün. Algılama reaksiyonu ile cam slaytı SPM sahnesine koyun, uygun bir mesafeyi koruyun, odak uzaklığını ve netliği ayarlayın, ardından reaksiyonun görüş alanını arayın ve bir görüntü yakalamak için odaklayın.
    NOT: Numunelerden elde edilen verilerin yaklaşık konsantrasyon aralığına ölçeklenebilmesi için önce standart bir eğri elde edilmelidir. 10 nM, 1 nM, 100 pM ve 10 pM, negatif kontrol olarak başka bir virüs (RPA'dan önce) dahil olmak üzere çeşitli saflaştırılmış hedef konsantrasyonları kullanılır.

7. Veri kümesi ve veri artırma

  1. Bölüm 6'daki algılama testinden floresan görüntülerini veri kümeleri olarak toplayın. Veri paralelliğini sağlamak için her örnek için en az üç paralel algılamayı tekrarlayın.
    1. Daha yüksek paralellik elde etmenin bazı uygun yolları onaylanabilir. Örneğin, her bir örnekten floresan görüntüleri toplarken, manuel olarak odaklanın ve görüntü almak için nispeten daha parlak bir alan arayın. Aynı zamanda, beşten fazla farklı yerde floresan sinyalini elde etmek için her numuneyi fotoğraflayın.
  2. ImageJ ile her görüntünün ortalama gri değerini ve bir konsantrasyon grubundaki ortalama gri değerin standart sapmasını ölçün.
  3. Veri temizleme için bir yoğunluk aralığı [medyan - standart sapma, medyan + standart sapma] ayarlayın.
    NOT: İlk adımlarda elde edilen görüntülerde büyük farklılıklar içeren görüntüler olabilir, bu nedenle görüntüleri taramak gerekir. Görüntülerin yoğunlukları ayarlanan eşiğin dışındaysa, aykırı değerler olarak kabul edilmeli ve hariç tutulmalıdır.
  4. Saflaştırılmış hedef için görüntüleri, sırasıyla artan sırada 0-6 ile artan konsantrasyonlarda etiketleyin.
  5. Sistemin sağlamlığını artırmak ve aşırı uyumu önlemek için Python'daki dönüştürme işlevleri aracılığıyla yatay çevirme, dikey çevirme ve rastgele gürültü gibi görüntü büyütme tekniklerini uygulayın. Bu, veri kümesinde varyasyonların tanıtılmasına yardımcı olur.

8. Öğrenmeyi aktarın

  1. Omurga ağı olarak, sınıflandırma için derin öğrenme modeli AlexNet33'ü benimseyin.
  2. Bölüm 7'deki önceden eğitilmiş modelin kısıtlamasını karşılamak için, Python'daki dönüştürme işlevleri aracılığıyla giriş görüntülerini 224 piksel x 224 piksel x 3 kanal (kırmızı, yeşil ve mavi renk kanalları için 224 piksel yükseklik ve genişlik ve 3 kanal derinliği) olarak yeniden şekillendirin.
    NOT: Bu adım, dönüştürme de dahil olmak üzere aktarım öğreniminde heterojen veriler için yaygın bir ön işlemedir.
  3. ImageNet veri kümesiyle önceden eğitilmiş bir omurga ağı kullanarak özellikleri ayıklayın ve öğrenilen ara gizli katmanların ağırlıklarından yararlanın.
  4. Floresan sınıflandırma işi bağlamında, başlangıçta ImageNet görevi için 1000 nöron içeren sinir ağının son tam bağlı katmanını, 2 veya 7 nöronlu tam bağlantılı bir katmanla değiştirin.
  5. Karışıklık matrisi, doğruluk, kesinlik, geri çağırma ve Lawton ve Viriri34'ü temel alan F1 puanı dahil olmak üzere bir dizi ölçüm kullanarak kurulum eğitim modelinin performansını değerlendirin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, DNA virüsleri için hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas ve bakım noktası (POC) algılama sistemine odaklanır. RPA reaksiyonu için primer çiftleri tasarımı ve CRISPR/Cas12a reaksiyonu için crRNA tasarımı, RPA-CRISPR/Cas12a reaksiyonunun verimliliğini etkileyeceği ve sonraki algılama ve sınıflandırmayı etkileyeceği için temel parçalardan ikisidir.

Bu yöntemde FV3, DNA virüsü tespitinin bir örneği olarak kabul edilir. FV3 için bazı RPA primer çiftleri tasarlanmış ve en verimli olanı seçilerek iyi amplifikasyon verimliliği gösterdiğinden emin olunmuştur, bu da adım 2.8'de belirtildiği gibi RPA ürünlerinin jel elektroforezi yoluyla bantların parlaklığının ve boyutunun sağlanmasıyla doğrulanabilir. Aynı zamanda, CRISPR/Cas12a crRNA'ları tasarladık ve RPA'sız CRISPR/Cas12a reaksiyonunda tetiklenen daha güçlü floresan sinyaline dayalı olarak en verimli olanı seçtik. RPA için üç ileri ve üç geri primer ve Cas12a için üç crRNA'nın dizisi Tablo 7'de gösterilmektedir. Şekil 3'te gösterilen agaroz jel elektroforezi sonuçlarına dayanarak, 6. primer çifti, yöntem için seçilen daha iyi amplifikasyon verimliliği (F2 ve R1) verir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, crRNA-3, yöntemde seçilen kollateral bölünme için en verimli olanıdır.

RPA astarı F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAG
RPA astarı F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA astarı F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAGTGGT
RPA astarı R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCCCGACCTGGG
RPA astarı R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCCCGACCTGGGAA
RPA astarı R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGCGT

Tablo 7: Reaksiyon optimizasyonu için RPA primerleri ve crRNA dizileri.

figure-results-1
Şekil 3: RPA verimliliğinin değerlendirilmesi için agaroz jel elektroforezinin sonuçları. RPA reaksiyonları, 1 nM saflaştırılmış bir hedef ile aynı koşul altında farklı primer kombinasyonları kullanılarak gerçekleştirildi. 1 numaralı RPA-F3 ve RPA-R3, 2 adet RPA-F3 ve RPA-R2, 3 adet RPA-F3 ve RPA-R1, 4 adet RPA-F2 ve RPA-R3, 5 adet RPA-F2 ve RPA-R2, 6 adet RPA-F2 ve RPA-R1, 7 adet RPA-F1 ve RPA-R3, 8 adet RPA-F1 ve RPA-R2, 9 adet RPA-F1 ve RPA-R2 olarak kabul edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 4: CRISPR/Cas12a ile üç farklı crRNA ile FV3 hedef fragmanlarının tespiti. Tespitte uygulanan saflaştırılmış fragmanların konsantrasyonları, 30 dakikalık inkübasyon ile 10 nM kontrol DNA'sına karşı 10 nM ila 100 pM hedef DNA arasındaydı. Bu figür Lei ve ark.35'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5'teki verileri oluşturmak için optimize edilmiş RPA primerleri, crRNA ve SPM kurulumunu uyguladık. Örneklerdeki konsantrasyonu daha iyi anlamak için, FV3 ve Enfeksiyöz dalak ve böbrek nekroz virüsünden (ISKNV, Iridoviridae) yüksek oranda korunmuş majör kapsid (MCP) geninin 240 bp DNA fragmanını hedef ve kontrol olarak çoğalttık ve Tablo 8'de gösterilen prosedürlerle çalıştırılan bir PCR amplifikasyon kiti aracılığıyla kontrol ettik. Amplifiye edilmiş DNA'nın boyutu, agaroz jel elektroforezi ile doğrulanır ve saflaştırılmış dsDNA hedefini ve kontrolünü jelden çıkardık. Saflaştırılmış DNA parçaları, bir NanoDrop 2000 spektrofotometresi kullanılarak ölçülür.

figure-results-3
Şekil 5: Saflaştırılmış hedef DNA ve kontrol DNA'sının floresan görüntüleri. (A) Negatif kontrol. (B) Saflaştırılmış hedef DNA (100 pM). Bu figür Lei ve ark.35'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SafhaSıcaklık (°C)SaatDöngü(ler)
Sıcak başlangıç955 dk1
Denatürasyon9530 Saniye35
Tavlama6045 Saniye
Uzantı7230 Saniye
Uzantı725 dk1
Depolama4--

Tablo 8: PCR amplifikasyon prosedürü.

Yalnızca referans için, veri temizliğinden sonra 162 floresan görüntü içeren bir veri seti elde edilir. Daha fazla analiz için floresan görüntülerinin sayısının artırılması gerekiyor ve veri kümesini ikili sınıflandırma için 337 floresan görüntü ve çok sınıflı sınıflandırma için 398 floresan görüntü kullanarak eğittik.

RPA amplifikasyonu için 30 dakika ve RPA'dan sonra LbCas12a tespiti için 10 dakika dahil olmak üzere yaklaşık 40 dakika içinde algılama gerçekleştirdik. Geliştirilen algılama sistemi seçilen RPA primerleri ve crRNA ile kullanıldığında, 10 FV3 ve kontrolün sinyal yoğunluğu, Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi önemli farklılıklar gösterir.

Ek Şekil 1: Çeşitli konsantrasyonlarda saflaştırılmış fragmanlara sahip RPA-LbCas12a reaksiyonlarında toplanan floresan görüntüler için sinyal yoğunluğunun istatistikleri. *: p < 0.05; **: p < 0.01; : p < 0.001; : p < 0.0001; F: FV3, I: ISKNV; A.U.: Absorbans ünitesi. Bu figür Lei ve ark.35'in izniyle yeniden kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntemde yapay zeka yardımıyla hızlı, uygulaması kolay, son derece hassas, diziye özgü ve POC DNA virüsü tespit sistemi geliştiriyoruz. Numuneler alındıktan sonra, hedef diziyi amplifiye etmek için RPA uygulanır ve ardından CRISPR/Cas12a, hedef DNA'yı tanıyabilir ve algılama sinyalini büyüten floresan serbest bırakabilir. Taşınabilir akıllı telefon mikroskobu, floresan görüntüleri almak için üretilmiştir ve pozitif ve negatif numunelerin görüntülerinin ikili sınıflandırması için transfer öğrenmeli derin öğrenme modelleri kullanılır. FV3 bu yöntemde pozitif örnek olarak alınır ve daha sonra önerilen sistemin özgüllüğünü ve duyarlılığını geliştirmek için birden fazla perspektiften incelenir.

İlk strateji, belirli RPA astarları tasarlamak ve en verimli astarları elemektir. RPA reaksiyonunun amplifikasyon verimliliği, farklı primerlerdenetkilenir 36. DNA virüs suşlarının hedef genini amplifiye etmek için kullanılan primerlerin özgüllüğü, standart nükleotid dizilimi veritabanına karşı patlatma ile doğrulanabilir. Verimli RPA primer çiftleri tasarlamak için bir kılavuz olmadığından, deneysel doğrulama gereklidir37.

Başka bir yaklaşım, hedef virüsün crRNA'sını CRISPR/Cas12a reaksiyonu için tasarlamaktır, çünkü kollateral bölünme verimliliği, algılamaduyarlılığına önemli ölçüde katkıda bulunur 38,39. RPA'sız CRISPR/Cas12a reaksiyonunda tetiklenen floresan sinyalinin gücü, daha iyi crRNA'nın seçilmesinde dikkate alınmalıdır. Ayrıca, LbCas12a proteininin yan aktivitesi 24 saat32 boyunca sürekli olarak aktive edilir ve bu da algılamaya fayda sağlayabilir.

Virüslerin tanımlanması ve viral partiküllerin görüntülenmesi amacıyla floresan mikroskobu uygulanmıştır40,41. Bununla birlikte, konvansiyonel mikroskopi, hızlı POC teşhisi için hantal ve pahalıdır. Bu nedenle, önerilen sistemde, POC tespiti için görüntüleri yakalayarak floresan sinyalini elde etmek için daha az maliyetle taşınabilir bir SPM inşa edilmiştir. Bu tür taşınabilir SPM, algılama sistemi kurulumu için uygun maliyetli olan ticarileştirilmiş bir plaka okuyucu veya gerçek zamanlı PCR makinesinden çok daha düşük maliyetlidir.

Önerilen bu platformun bazı yönlerden de daha da geliştirilmesi gerekiyor. Bu tespit platformunu diğer DNA virüsü tespitine uygularken, hem RPA primerinin hem de Cas12a-crRNA dizisinin yeniden tasarlanması gerekir. Tasarımları için bir rehber olmadığından, verimliliklerini değerlendirmek için deneyler yapılması gerekir. Önerilen sistem taşınabilirliğin avantajlarını karşılayabilse de, daha hafif bir sistem elde etmek için tüm sistemin boyutunun daha da küçültülmesi gerekmektedir. Yakın mesafeli çekimler için cep telefonu kamerasının kendisine odaklanmak kolay olmadığından, daha kaliteli görüntüler için görüş alanı da dahil olmak üzere floresan görüntüler elde etme sürecinde ayarlanması zaman alır.

İlgili teknolojideki gelişmeler ve yeni uygulamalarla, POC tespitinde verimlilik artmaya devam edecektir. Burada sunulan yöntem, yeni yapay zeka yardımı ile CRISPR/Cas12a sistemine ve SPM platformuna dayalı POC tespitine yardımcı olabilecek bir iyileştirme örneğidir. Ek olarak, entegre sistem, crRNA'nın yeniden programlanabilirliği nedeniyle herhangi bir DNA hedefini tanımlamak için kullanılabilir. RPA-CRISPR/Cas12a-AI sistemi, DNA patojenlerinin tanımlanmasında tespit hassasiyeti, özgüllük, zaman ve güvenilirlik açısından önemli bir konuma sahip olacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı 31970752, Shenzhen Belediyesi Bilim, Teknoloji, İnovasyon Komisyonu JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Shenzhen Körfezi Laboratuvarı Açık Finansmanı, SZBL2020090501004; Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı 2020M680023; ve Çin Halk Cumhuriyeti Gümrük Genel İdaresi 2021HK007.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20x amplifikasyonOLYMPUSOPLN20X
532 nm yeşil lazerThorlabsPL2010.9 mW çıkış gücü ile
535 nm kesme dalga boyukromAT535
6x DNA yükleme tamponuThermo scientificR0611
96 kuyucuklu siyah mikroplakaCorning Incorporated3603Siyah, düz şeffaf tabanlı
Asferik lensLubangN/A
535 nm kesme dalga boyuna sahipdikroik aynaSEMROCKFF555-Di03-25-36
E.Z.N.A Jel Ekstraksiyon KitiOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T Filtre
tutucularRuicageN/A
Florofor-ssDNA-Söndürücü muhabir problarıSangon Biotech5uçta florofor olarak TAMRA (karboksi tetrametilrodaminon); BHQ2 (Kara Delik Söndürücü-2) 3 uçta söndürücü olarak
GP32ATG BiyoteknolojiM104
ImageJAçık kaynaklıSürüm 1.53t 24https://imagej.nih.gov/ij/ 'dan indirildi;
Mikroplaka okuyucuSPARK, TECANN/A
Çok Bloklu termal Döngüleyici PCR cihazıLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpektrofotometrelerThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Beijing) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Reaksiyon tamponu
Oksijen plazma tedavisi Elektro-Teknik  ÜrünlerN/A
Patojen İnaktive Edici, Nükleik asit ekstraksiyonu içermeyen, Proteinaz K (PINDBK) ile Doğrudan PCR'ye TamponEbioPINDBK -25mL
PCR primer çiftleriSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
RPA primer çiftleriSangon BiotechN/A
Akıllı TelefonHuaweiMate10
Çeviri aşamalarıRuicageN/A
İletilen nötr yoğunluk filtreleriThorlabsND40A
Üçlü akromatik lenslerThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiyoteknolojiM105
UvsYATG BiyoteknolojiM106
, Bant geçiren filtre SEMROCK FF01-542/27-25 Bsu DNA Polimeraz ATG Biyoteknoloji M103 Büyük Fragman crRNA Sangon Biotech N/A DNA parçaları Sangon Biotech N/A Dikroik tutucular Ruicage N/A

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gire, S. K., et al. Genomic surveillance elucidates Ebola virus origin and transmission during the 2014 outbreak. Science. 345 (6202), 1369-1372 (2014).
  2. The Ebola Outbreak Epidemiology Team. Outbreak of Ebola virus disease in the Democratic Republic of the Congo, April-May 2018: an epidemiological study. Lancet. 392 (10143), 213-221 (2018).
  3. Zumla, A., Hui, D. S., Perlman, S. Middle East respiratory syndrome. Lancet. 386 (9997), 995-1007 (2015).
  4. Plourde, A. R., Bloch, E. M. A literature review of Zika virus. Emerg Infect Dis. 22 (7), 1185-1192 (2016).
  5. Yuan, X., et al. Current and perspective diagnostic techniques for COVID-19. ACS Infect Dis. 6 (8), 1998-2016 (2020).
  6. Minhaj, F. S., et al. Monkeypox outbreak - nine states, May 2022. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 71 (23), 764-769 (2022).
  7. Bao, M., et al. Challenges and opportunities for clustered regularly interspaced short palindromic repeats based molecular biosensing. ACS Sens. 6 (7), 2497-2522 (2021).
  8. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  9. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), 436-439 (2018).
  10. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  11. Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases. Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).
  12. Mukama, O., et al. An ultrasensitive and specific point-of-care CRISPR/Cas12 based lateral flow biosensor for the rapid detection of nucleic acids. Biosens Bioelectron. 159, 112143(2020).
  13. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  14. Yin, L., Man, S., Ye, S., Liu, G., Ma, L. CRISPR-Cas based virus detection: Recent advances and perspectives. Biosens Bioelectron. 193, 113541(2021).
  15. Dronina, J., Bubniene, U. S., Ramanavicius, A. The application of DNA polymerases and Cas9 as representative of DNA-modifying enzymes group in DNA sensor design (review). Biosens Bioelectron. 175, 112867(2021).
  16. Fozouni, P., et al. Amplification-free detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas13a and mobile phone microscopy. Cell. 184 (2), 323-333.e9 (2021).
  17. Kumar, M., et al. FnCas9-based CRISPR diagnostic for rapid and accurate detection of major SARS-CoV-2 variants on a paper strip. eLife. 10, e67130(2021).
  18. Lee, R. A., et al. Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).
  19. Ganguli, A., et al. Hands-free smartphone-based diagnostics for simultaneous detection of Zika, Chikungunya, and Dengue at point-of-care. Biomed Microdevices. 19 (4), 73(2017).
  20. Yeo, S. J., et al. Smartphone-based fluorescent diagnostic system for highly pathogenic H5N1 viruses. Theranostics. 6 (2), 231-242 (2016).
  21. von Chamier, L., et al. Democratising deep learning for microscopy with ZeroCostDL4Mic. Nat Commun. 12 (1), 2276(2021).
  22. Shiaelis, N., et al. Virus detection and identification in minutes using single-particle imaging and deep learning. ACS Nano. 17 (1), 697-710 (2020).
  23. Liu, Y., et al. Mixed-UNet: Refined class activation mapping for weakly-supervised semantic segmentation with multi-scale inference. Front. Comput. Sci. 4, 1036934(2022).
  24. Lawrimore, J., Doshi, A., Walker, B., Bloom, K. AI-assisted forward modeling of biological structures. Front Cell Dev Biol. 7, 279(2019).
  25. Yang, Y., Hu, Y., Zhang, X., Wang, S. Two-stage selective ensemble of CNN via deep tree training for medical image classification. IEEE Trans Cybern. 52 (9), 9194-9207 (2022).
  26. Zhang, R., et al. RCMNet: A deep learning model assists CAR-T therapy for leukemia. Comput Biol Med. 150, 106084(2022).
  27. Xie, Y., et al. Stroke prediction from electrocardiograms by deep neural network. Multimed Tools Appl. 80, 17291-17297 (2021).
  28. Wang, J., Zhu, H., Wang, S., Zhang, Y. -D. A review of deep learning on medical image analysis. Mobile Netw Appl. 26, 351-380 (2021).
  29. Artoni, P., et al. Deep learning of spontaneous arousal fluctuations detects early cholinergic defects across neurodevelopmental mouse models and patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23298-23303 (2020).
  30. Li, J., et al. DeepLearnMOR: a deep-learning framework for fluorescence image-based classification of organelle morphology. Plant Physiol. 186 (4), 1786-1799 (2021).
  31. Yosinski, J., Clune, J., Bengio, Y., Lipson, H. How transferable are features in deep neural networks. Proceedings of the 27th International Conference on Neural Information Processing Systems. 2, 3320-3328 (2014).
  32. He, Q., et al. High-throughput and all-solution phase African Swine Fever Virus (ASFV) detection using CRISPR-Cas12a and fluorescence based point-of-care system. Biosens Bioelectron. 154, 112068(2020).
  33. Krizhevsky, A., Sutskever, I., Hinton, G. E. ImageNet classification with deep convolutional neural networks. Commun. ACM. 60 (6), 84-90 (2017).
  34. Lawton, S., Viriri, S. Detection of COVID-19 from CT lung scans using transfer learning. Comput Intell Neurosci. 2021, 5527923(2021).
  35. Lei, Z., et al. Detection of frog virus 3 by integrating RPA-CRISPR/Cas12a-SPM with deep learning. ACS Omega. 8 (36), 32555-32564 (2023).
  36. Chen, Z., Huang, J., Zhang, F., Zhou, Y., Huang, H. Detection of shrimp hemocyte iridescent virus by recombinase polymerase amplification assay. Mol Cell Probes. 49, 101475(2020).
  37. Fu, X., Sun, J., Ye, Y., Zhang, Y., Sun, X. A rapid and ultrasensitive dual detection platform based on Cas12a for simultaneous detection of virulence and resistance genes of drug-resistant Salmonella. Biosens Bioelectron. 195, 113682(2022).
  38. Habimana, J. D., et al. Mechanistic insights of CRISPR/Cas nucleases for programmable targeting and early-stage diagnosis: A review. Biosens Bioelectron. 203, 114033(2022).
  39. Liang, Y., Lin, H., Zou, L., Deng, X., Tang, S. Rapid detection and tracking of Omicron variant of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas12a-based assay. Biosens Bioelectron. 205, 114098(2022).
  40. Sivaraman, D., Biswas, P., Cella, L. N., Yates, M. V., Chen, W. Detecting RNA viruses in living mammalian cells by fluorescence microscopy. Trends Biotechnol. 29 (7), 307-313 (2011).
  41. Wang, I. H., Burckhardt, C. J., Yakimovich, A., Greber, U. F. Imaging, tracking and computational analyses of virus entry and egress with the cytoskeleton. Viruses. 10 (4), 166(2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Bak m NoktasAk ll Telefon MikroskopisiDerin renme ModeliKurba a Vir s 3Floresan Sinyal TespitiKollateral KesimG r nt S n fland rmaViral Y k De erlendirmesi

İlgili makaleler