Method Article

Kırmızı Kan Hücresi Proteinlerinde Dinamik Değişikliklerin İmmün Boyama Tabanlı Tespiti

DOI:

10.3791/64843

⸱

March 17th, 2023

 , 
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enükleasyonlu kırmızı kan hücrelerinin protein aktivasyonundaki dinamik değişiklikleri yakalamak, daha sonra değerlendirilmek üzere akut uyaranlardaki dinamik değişikliklerin korunması gibi metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Sunulan protokol, ilgili protein değişikliklerinin korunmasını ve analizini ve müteakip tespitini sağlayan numune hazırlama ve boyama tekniklerini açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kırmızı kan hücresi (RBC) proteinlerinin antikor etiketlemesi, genel protein içeriğindeki değişiklikleri veya protein aktivasyon durumlarındaki akut değişiklikleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılan, yarı kantitatif bir yöntemdir. RBC tedavilerinin değerlendirilmesini, belirli hastalık durumlarındaki farklılıkların karakterizasyonunu ve hücresel tutarlılıkların tanımlanmasını kolaylaştırır. Akut olarak değiştirilmiş protein aktivasyonunun tespiti (örneğin, mekanotransdüksiyon yoluyla), aksi takdirde geçici protein modifikasyonlarını korumak için yeterli numune hazırlığı gerektirir. Temel prensip, spesifik primer antikorların ilk bağlanmasını sağlamak için istenen RBC proteinlerinin hedef bağlanma bölgelerinin hareketsiz hale getirilmesini içerir. Numune, ikincil antikorun karşılık gelen birincil antikora bağlanması için en uygun koşulları garanti etmek için daha fazla işlenir. Floresan olmayan ikincil antikorların seçimi, oksidasyonu durdurmak için mikroskop altında gerçek zamanlı olarak kontrol edilmesi gereken boyamayı geliştirmek için biyotin-avidin eşleşmesi ve 3,3-diaminobenzidin-tetrahidroklorür (DAB) uygulaması dahil olmak üzere ek tedavi gerektirir. Boyama yoğunluğu tespiti için görüntüler standart bir ışık mikroskobu kullanılarak alınır. Bu protokolün bir modifikasyonunda, bunun yerine floresein ile konjuge bir ikincil antikor uygulanabilir, bu da daha fazla geliştirme adımına gerek olmaması avantajına sahiptir. Bununla birlikte, bu prosedür, boyama tespiti için bir mikroskoba bağlı bir floresan objektif gerektirir. Bu yöntemlerin yarı kantitatif doğası göz önüne alındığında, spesifik olmayan antikor reaksiyonlarını ve arka plan sinyallerini hesaba katmak için birkaç kontrol boyası sağlamak zorunludur. Burada, farklı boyama tekniklerinin ilgili sonuçlarını ve avantajlarını karşılaştırmak ve tartışmak için hem boyama protokollerini hem de ilgili analitik süreçleri sunuyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kırmızı kan hücreleri (RBC'ler) kardiyovasküler sistemi 70 ila 140 gün boyunca geçer ve ortalama RBC yaşı yaklaşık 115 gündür 1,2. Yaşlanan veya hasar görmüş eritrositler, makrofajlar tarafından yönlendirilen etkili bir temizleme işlemi olan eritrofagositoz ile dolaşımdan çıkarılır3. Bu hücrelerin önceden belirlenmiş ömrü, farklılaşma ve olgunlaşma sırasında çekirdek, mitokondri ve ribozomlar dahil olmak üzere hücre organellerinin teslim edilmesinin bir sonucudur4. Bu nedenle, dolaşımdaki RBC'ler, yeni proteinlerinsentezini engelleyen bir translasyon makinesinden yoksundur 3. Mevcut proteinlere yapılan dinamik, translasyon sonrası modifikasyonların, RBC'lere etki eden hücre dışı ve hücre içi stresörlere yanıt olarak akut, biyokimyasal düzenlemenin tek uygulanabilir mekanizmasını temsil ettiği sonucuçıkar 5.

Mekanik kuvvetler, RBC'ler içindeki biyokimyasal yolların aktivasyonuna veya modülasyonuna neden olan başlıca hücre dışı ipuçları gibi görünmektedir. RBC membranlarında6 mekanosensitif protein olan Piezo1'in keşfi, bu hücrelerde mekanik olarak aktive edilen sinyalleri araştıran birkaç araştırma hattına ilham verdi7. Örneğin, son gelişmeler, RBC'lerin fiziksel özelliklerinin, translasyon sonrası fosforilasyon ve ubikitinasyon9 içeren proteinlerin8 akut ve dinamik değişiklikleri tarafından aktif olarak düzenlendiğini göstermiştir. Bu normal modifikasyonlar bazı hastalıklarda farklılık gösterdiğinden9,10,11, özellikle mekanobiyolojik süreçlerle ilgili olarak RBC proteinlerinin aktivasyon durumunu belirlemek bilimsel ve klinik açıdan ilgi çekici görünmektedir.

RBC protein aktivasyon durumlarındaki akut değişikliklerin belirlenmesi bazı metodolojik zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Örneğin, RBC numunelerinin daha sonraki analizler için saklanması, translasyon sonrası modifikasyonlar dayanıklı olmadığından, modifiye edilmiş RBC proteinlerinin korunmasını gerektirir. Ayrıca, klasik protein tespit yöntemlerinin (örneğin, western blotting), bu hücrelerdeki protein içeriğinin ~% 98'ini oluşturan hemoglobine göre düşük protein bolluğu nedeniyle RBC'lerde standardize edilmesi çok zordur12. Bu nedenle, nitrik oksit sentazın RBC'ye özgü izoformu (RBC-NOS)13,14 gibi önemli RBC proteinlerinin akut modifikasyonlarını araştırırken, kimyasal olarak korunmuş RBC'lerin antikor bazlı boyanması tercih edilen yöntem olmuştur. RBC-NOS'un, RBC deforme olabilirliği15,16,17 dahil olmak üzere temel RBC özellikleri için vazgeçilmez görünen nitrik oksit (NO) enzimatik olarak ürettiği gösterilmiştir. RBC-NOS'un translasyon sonrası modifikasyonları, katalitik enzim aktivitesini düzenler, serin 1177 kalıntısının fosforilasyonu enzim aktivitesini arttırmak için tarif edilirken, serin 114 veya treonin 495 kalıntılarının fosforilasyonu, azalmış RBC-NOS aktivitesi18,19 ile ilişkilendirilmiştir.

Toplu olarak, RBC proteinlerinin geçici modifikasyonları önemli hücresel fonksiyona katkıda bulunur ve bu modifiye proteinlerin saptanmasını sağlayan standartlaştırılmış protokoller yüksek değere sahiptir. Burada, RBC-NOS protein aktivasyonunun saptanmasını kolaylaştırmak için spesifik antikorlardan yararlanan iki farklı protokol sunuyoruz ve veri analizi ve yorumlanması için önerileri tartışıyoruz.

Açıklanan protokollerin performansı, insan damar sistemi (5 Pa) içinde meydana gelenleri yansıtan mekanik kuvvetlere yanıt olarak serin 1177 kalıntısında RBC-NOS'un fosforilasyonunda iyi bildirilen artış ölçülerek değerlendirildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokoller Helsinki Bildirgesi ile uyumludur ve Köln Alman Spor Üniversitesi (9/16/2013) ve Griffith Üniversitesi (2019/808) Etik Kurulları tarafından onaylanmıştır. Gönüllüler, ilgili patolojilerin bulunmadığından emin olmak için tarandı ve yazılı bilgilendirilmiş onam verildi.

1. İmmünohistokimya protokolleri kullanılarak RBC proteinlerinin boyanması

NOT: Gerekli kimyasalların ve malzemelerin ayrıntılı bir listesi Malzeme Tablosunda verilmiştir. Aşağıdaki bölümlerde gerekli solüsyonların hazırlanması ve ardından immünohistokimya protokolünün ayrıntılı bir açıklaması açıklanmaktadır (Şekil 1).

figure-protocol-1
Şekil 1: Fosforilasyon bölgesi 1177'de RBC-NOS'un immünohistokimyasal ve immünofloresan boyaması için gerekli bireysel adımların şeması. Sunulan protokollerin çözelti hazırlama ve kan örneklemesinden antikor bazlı tespit ve görselleştirmeye kadar uzanan tipik bir iş akışı sunulmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Kan örneğinin alınması
    1. Yedi sağlıklı erkekten kan örnekleri (10 mL tam kan) alın. Gönüllüler, kardiyovasküler, hematolojik, nörolojik, endokrin veya metabolik hastalıklardan arınmış sağlıklı bireylerdi. Gönüllüler de sigara içmiyorlardı.
    2. Steril bir iğne ve şırınga kullanarak önkolun antekubital bölgesindeki belirgin bir damardan kan toplayın ve hemen aşağıdaki antikoagülanlardan biriyle kaplanmış tüplere aktarın: sodyum heparin (immünohistokimya için) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA; floresan etiketleme için).
    3. Antikoagüle kan örneklerini, 7,20'den önce açıklandığı gibi, Couette tipi bir kesme sistemi kullanarak hassas bir şekilde kontrol edilen mekanik kuvvetlere maruz bırakın.
      1. Kesme aparatı, 300 μm'lik bir boşlukla ayrılmış dönebilen bir kap ve sabit bir bob'dan oluşur. Kan örneğini boşluğa aktarın, bu da kabın hassas bir şekilde kontrol edilebilen dönme hızının numuneye iyi kontrol edilen mekanik kuvvetler uygulamasına neden olur. Burada sunulan temsili veriler, uzun süreler (300 s) boyunca insan damar sisteminde (5 Pa) meydana gelenleri yansıtan mekanik kuvvetler uygulanarak üretilmiştir.
  2. İmmün boyama için gerekli çözeltilerin hazırlanması
    1. Çözümleri Tablo 1'deki gibi hazırlayın. Çözeltiler, immün boyama prosedürünü gerçekleştirmeden önce hazırlanabilir ve ihtiyaç duyulana kadar belirli bir sıcaklıkta saklanabilir.
      NOT: Saklama süresi kimyasallar arasında değişiklik gösterebilir. Malzeme güvenlik bilgi formunu kontrol edin.
  3. Numune hazırlama
    1. Kısa ömürlü etkileri tespit edebilmek için, örneğin kayma gerilimi uygulaması, egzersiz, kısa süreli hipoksi maruziyeti vb.
    2. Formaldehit kullanarak RBC protein fiksasyonunu aşağıdaki gibi gerçekleştirin: tam kanı oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehit çözeltisinde 1: 2 oranında seyreltin. Numuneyi RT'de 3 dakika boyunca 132 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı pipetleyerek dikkatlice çıkarın.
    3. RBC peletini iki hacim 0.1 mol/L fosfat tamponlu salin (PBS) (1:3 seyreltme) içinde yeniden süspanse edin ve RT'de 5 dakika inkübe edin. Santrifüjlemeyi yukarıda açıklandığı gibi tekrarlayın ve berrak olması gereken süpernatanı pipetleme ile çıkarın. RBC peletini 0.1 mol/L PBS'lik bir hacimde (1:2 seyreltme) yeniden süspanse edin.
    4. Kan yaymalarını aşağıdaki gibi hazırlayın: alkole dayanıklı bir kalem (örneğin kurşun kalem) kullanarak numune kimliği, uygulanan antikor vb. ile bir mikroskop lamını etiketleyin. Ardından, hazırlanan RBC çözeltisinden 10 μL'yi etiket alanının hemen üzerine ekleyin.
    5. Numunenin üzerine yaklaşık 45°'lik bir açıyla ikinci bir slayt yerleştirin ve numuneyi slayt boyunca eşit olarak dağıtın. Numuneyi 5-7 saniye boyunca sabit hareketle brülörün üzerinde gezdirerek sürgüyü bir Bunsen brülörü üzerinde ısıyla sabitleyin.
      NOT: Numunelerin ısıyla sabitlenmeden önce havayla kurutulması önerilir. Numuneler boyanana kadar RT'de saklanabilir (Şekil 2).
  4. İmmünohistokimya boyama
    1. Her slaytta iki alanı işaretleyin: RBC'lerin ilgili birincil ve ikincil antikor ile inkübe edildiği bir test alanı ve birincil antikorun bir kontrol çözeltisi ile değiştirildiği bir kontrol alanı. Bu alan, RBC'lerin arka plan sinyalini belirlemek için bir tahlil kontrolü görevi görür.
    2. Tablo 2'ye göre prosedürden önce veya işlem sırasında çözeltiler hazırlayın. Test alanı başına 300 μL ve kontrol alanı başına 200 μL'lik bir hacme ihtiyaç vardır.
      NOT: Bu antikor bazlı boyama prosedürlerinin kantitatif verilerden ziyade yarı kantitatif veriler verdiğine dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, üretilen verilerden anlamlı sonuçların çıkarılabilmesini sağlamak için, uygun kontrol numuneleri (yani, protein aktivasyonunda değerlendirilen nispi değişiklikler için bir referans noktası sağlamak için) kesinlikle gereklidir.
    3. Tripsin sindirimi için,% 0.1 tripsini çözün ve RT'ye dengeleyin. Bir gres kalemi kullanarak her slaytta iki alanı işaretleyin: bir test alanı (slaytın 2 / 3'ü) ve bir kontrol alanı (slaytın 1 / 3'ü). Numune alanlarını yıkamak için transfer pipetleri kullanarak üç tamponlu salini (TBS) dikkatlice uygulayın. TBS'yi 30 saniye bekletin ve ardından dökün. Yıkama adımını tekrarlayın.
      NOT: Aksi belirtilmedikçe, hem kontrole hem de test alanına aşağıdaki çözümleri ekleyin. Alanların ilgili çözelti ile yeterince kaplanması gerekir. Çözeltileri tek kullanımlık transfer pipetleri kullanarak uygulayın ve her çözeltiden sonra pipetleri değiştirin.
    4. % 0.1 tripsin ekleyin, bir kapak veya alüminyum folyo ile amaca yönelik bir inkübasyon odası kullanarak slaytları kapatın ve bir inkübatörde 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, musluk suyu ekleyerek enzim reaksiyonunu durdurun. Çözeltiyi dökün. Her iki alanı da yukarıda açıklandığı gibi TBS ile 3 kez yıkayın.
    5. Peroksidaz aktivasyonunu bloke etmek için metanol çözeltisi ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında slaytları örtün. Çözeltiyi dökün.
      NOT: İmmünofloresan tespiti için (bölüm 2), endojen peroksidazların bloke edilmesinin, yaban turpu peroksidaz (HRP) ve 3,3'-Diaminobenzidin hidrat (DAB) ile tespitin neden olduğu artefakt sinyali önlemeye hizmet ettiği göz önüne alındığında, bu adım atlanabilir.
    6. Her iki alanı da adım 1.4.3'te açıklandığı gibi TBS ile 3 kez yıkayın. % 3 yağsız süt çözeltisi ekleyin ve bloke etmek için RT'de 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi dökün. Daha sonra yıkamayın.
    7. Primer antikoru (AB) sadece test alanına ekleyin. Kontrol alanına AB kontrol solüsyonu (bkz. Tablo 2) ekleyin. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Kurumayı önlemek için bu süre zarfında slaytları örtün.
      NOT: Kontrol değerlerini etkileyeceğinden, çözeltileri testten kontrol alanına aktarmaktan kaçının.
    8. Antikor çözeltisini dökün. Her iki alanı da adım 1.4.3'te açıklandığı gibi TBS ile 3 kez yıkayın.
    9. Belirsiz bağlamayı önlemek için bir engelleme adımı gerçekleştirin. % 3 normal keçi serumu ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
    10. İkincil antikor çözeltisini ekleyin ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Alanları adım 1.4.3'te açıklandığı gibi TBS ile 3x yıkayın.
  5. Boyama ve örtü gelişimi
    1. Seyreltilmiş avidin-peroksidaz çözeltisi ekleyerek ve RT'de 30 dakika inkübe ederek avidin bağlı HRP reaksiyonunu ( Tablo 2'deki seyreltmeye bakınız) gerçekleştirin.
    2. Tablo 3'e göre, kullanımdan önce immün boyamayı geliştirmek için DAB karışımını hazırlayın.
      DİKKAT: DAB tehlikelidir. H341 (genetik kusurlara neden olduğundan şüphelenilen) ve H350 (kansere neden olabilir) tehlike ifadelerini göz önünde bulundurun. Aşağıdaki önlem ifadelerini göz önünde bulundurun: P201, P202, P280, P308+P313, P405 ve P501.
    3. DAB kontrol boyamasını aşağıdaki gibi gerçekleştirin: HRP çözeltisini bir slayttan adım 1.5.1'den toplayın ve boyamadan önce ayrı bir santrifüj tüpünde küçük bir hacimle (örn. 1 mL) hazırlanmış DAB çözeltisi ile karıştırın. Karışım kahverengi/gri bir renk geliştirmelidir.
    4. Slaytları mikroskop altına yerleştirin (en az 200x büyütme) ve her iki alana da DAB solüsyonu ekleyin. RBC'lerin lekelenmesini sürekli olarak izleyin ve arka plan renklenmeye başlamadan önce DAB solüsyonunu tek kullanımlık bir pipetle çıkararak lekelenmeyi durdurun. RBC-NOS serin 1177 boyama için DAB inkübasyon süresi yaklaşık 17 dakikadır.
    5. Örnek dehidrasyon gerçekleştirin. Slaytları bir cam rafa yerleştirin ve her biri 5 saniye boyunca% 70'ten başlayarak,% 96 ve sonra% 100 ve son olarak ksilol içinde çeşitli seyreltmelerdeki etanol çözeltilerine daldırın. Slaytları raftan çıkarın ve fazla sıvıyı emmek için RBC'ler üstte olacak şekilde bir mendil üzerine yerleştirin.
    6. Slayt boyunca iki veya üç damla montaj ortamı ekleyin. Bir lamel kullanarak slaydı örtün. Mikroskobik değerlendirmeyi engellediği için hava kabarcıklarının dahil edilmesinden kaçının. Numuneleri en az bir gece çeker ocakta kurutun.
  6. Mikroskobik değerlendirmenin yapılması
    1. Görselleştirme ve görüntüleme için, slaytları en az 200x büyütme oranına sahip bir iletim ışık mikroskobuna yerleştirin. Lekeli RBC'lerin fotoğraflarını çekmek için mikroskobun bir kameraya bağlı olduğundan emin olun.
    2. Mikroskop ışık kaynağını açın. Mikroskoba bağlı kamerayı açın ve mikroskop kontrol yazılımını başlatın. Kaba ve ince odak ayar düğmelerini çevirerek ve RBC'lerin görünür olduğu odak seviyesini bularak uygun odağı belirlemek için parlak alan mikroskobunu kullanın.
    3. Resimlerin arka plan değerlerini, slaytın hücresiz üç alanında ölçülen 220 ± 5 gri değerine ayarlayın. Bunu yapmak için, ücretsiz olarak sunulan ImageJ yazılımını kullanarak ilk resmi açın. Ölçümleri ayarla panelini kullanarak ortalama gri değerler seçeneğini seçin. Ölç komutunu kullanarak gri değeri ölçmek için oval simgeyi kullanın. Ölçülen değerler aralık dışındaysa, mikroskoptaki arka plan ışığını buna göre ayarlayın. Arka plan değerleri doğru olana kadar bu adımları tekrarlayın.
      NOT: Bu arka plan değerleri, çekilen tüm görüntüler için verilen aralıkta olmalıdır. Aksi takdirde, veriler karşılaştırılamaz.
    4. RBC gri değerinin analizi için, ImageJ yazılımındaki Oval seçim aracını kullanarak her RBC'nin kenarını işaretleyin. Measure komutunu kullanarak tek tek RBC'lerin gri değerlerini belirleyin. Testten en az 50 RBC'nin ve kontrol alanından en az 10 RBC'nin gri değerlerini ölçün.
      NOT: Analiz edilen toplam RBC sayısı ayrı ayrı ayarlanabilir. Ne kadar çok RBC analiz edilirse, sonuç o kadar anlamlı olur. Bununla birlikte, analiz edilen toplam RBC sayısı, belirli bir deneydeki her koşul, denek vb. için karşılaştırılabilir olmalıdır.
      1. Yağlı kalemin yakınında RBC'lerin analizinden kaçının, çünkü bu alanda boyama eksik olabilir. Boyama yoğunluğunu etkilediği için çakışan RBC'lerin analizinden kaçının. Yalnızca diğer RBC'lerden ayrılmış RBC'leri kullanın. 50/10 RBC'lerin değerlendirilmesi için testten en az beş görüntüyü ve kontrol alanından en az iki görüntüyü analiz edin. Son analizde her resimden RBC'leri dahil edin.
    5. Boyama yoğunluğunu hesaplamak için son sinyalleri şu şekilde hesaplayın:
      (bireysel test alanı RBC - ortalama test alanı arka planı) - (bireysel kontrol alanı RBC - ortalama kontrol alanı arka planı)

figure-protocol-2
Şekil 2: Fiksatif sürecin ve kan yayma oluşumunun tasviri. (Şema BioRender.com ile oluşturulmuştur.) Seyreltilmiş kan örnekleri paraformaldehit içinde kimyasal olarak sabitlenir, daha sonra santrifüjlenir ve fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Son olarak, yeniden süspanse edilen kan bir cam lam üzerine sürülür ve bir Bunsen brülör alevi üzerinde gezdirilerek termal olarak sabitlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: İmmünohistokimyasal boyama için gerekli solüsyonların hazırlanması ve saklanma koşulları. Çözüm, protokolden önce hazırlanabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Acil kullanım için antikor çözeltilerinin açıklaması. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: DAB çözümünü hemen kullanıma hazırlamak için bileşenler ve protokol. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

2. RBC proteinlerinin floresan etiketlemesi

NOT: Aşağıdaki bölüm, floresan konjugatlarla antikorların kullanımını sağlamak amacıyla geliştirilen immünohistokimyasal protokolün bir uyarlamasını özetlemektedir (Şekil 1).

İmmünofloresan protokolü için kan numunesi hazırlama, bölüm 1'de tarif edilenle aynıdır, bu nedenle aşağıdaki bölüm numunelerin boyanmasından başlar.

  1. İmmünofloresan boyama
    1. İkincil, floresan konjuge antikor (hacim için, bkz. adım 1.4.2) ile 30 dakika boyunca, amaca yönelik bir inkübasyon odası veya alüminyum folyo kullanarak, ışıktan korunan RT'de inkübe edin.
    2. İkincil antikor solüsyonunu dökün ve numuneleri 3x TBS ile yıkayın. Kurumasını önlemek için son yıkamayı numunelerin üzerinde bırakın.







Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RBC proteinlerindeki akut değişikliklerin saptanmasını kolaylaştıran yöntemleri tanımlayan sunulan protokol, iyi bilinen mekanik olarak hassas bir protein değişikliği üzerinde test edildi: serin 1177 kalıntısında RBC-NOS'un fosforilasyonu. Sağlıklı gönüllülerden tam kan elde edildi ve daha sonra iki ayrı alikota bölündü. Belirli bir kan örneği, daha önce serin 117714'te RBC-NOS fosforilasyonunu ortaya çıkardığı gösterilen 300 s boyunca fizyolojik büyüklükte (5 Pa) mekanik kesme gerilimine maruz bı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son literatür, RBC-NOS proteininin, RBC deforme olabilirliğinin 15,22,23 düzenlenmesi için çok önemli olduğunu ve bunun da dar kılcal damarlardan geçişlerini kolaylaştırdığınıgöstermektedir 24. Protein aktivitesi büyük ölçüde translasyon sonrası protein modifikasyonlarına, özellikle belirli kalıntılarınfosforilasyonuna bağlıdır 18. İlgi odağı, RBC-NOS proteini23'...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını açıklamıştır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LK, Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursunun desteğini kabul eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3,3&asal;-Diaminobenzidin -tetrahidroklorür HidratSigma/MerckD5637DAB
Amonyumklorür Merck /Millipore101145NH4Cl
Santrifüj 5427 R Eppendorf5409000010
LamelleriVWR631-0147 
di-sodyum Hidrojen Fosfat Dihidrat Merck /Millipore106580Na2HPO4. 2 H2O
Tek kullanımlık transfer pipetleriVWR612-6803
EntellanMerck /Millipore 107961mikroskopi için hızlı montaj ortamı
%1 metil etil keton (MEK)Hofmann642
Sigma/MerckG2133
Yağlı kalem DakoS 2002
At turpu peroksidaz / ExtrAvidin & eksi; PeroksidazSigma / MerckE-2886HRP
Hidroklorik asit &Merck / Millipore 109057HCl
Hidrojen peroksit,% 30Merck / Millipore107203H 2< / sub > O 2 < / sub>
ImageJ YazılımıÜcretsiz
Lazer destekli optik rotasyonel hücre analizörü (LORCA)RR MekatronikMetanol kesmek için kullanılan ektasitometre aleti
Merck / Millipore
Mikroskop slaytlarıVWR630-1985
Nikel (II) -sülfat Heksahidrat Sigma / MerckN4882NiSO4.< / sub>6H2< / sub>O
Normal Keçi serumuAgilent / DAKOX0907NGS
ParaformaldehitMerck / Millipore 818715PFA
Pipetleri Eppendorf Referans 2VWR613-5836 / 613-5839
Tavşan Anti-fosfo eNOS Antikoru (Ser1177)Merck / Millipore07-428-IBirincil Antikor
Reaksiyon tüpleri, 2mlEppendorf30120094
İkincil Antikor keçi anti tavşanAgilent / DAKOE0432İkincil Antikor
Yağsız süt tozuBio-Rad170-6404
Sodyum klorür ve nbsp;Merck /Millipore 106404NaCl
Sodyum Dihidrojen Fosfat MonohidratMerck /Millipore 106346NaH2PO4. H2O
Sodyum hidroksit, 1 MMerck / Millipore150706NaOH
Tris (hidroksimetil) -aminometanMerck / Millipore108382Tris
TripsinSigma / MerckT7409
Tween20 Merck / Millipore822184
Whatman Glas mikrofiber filtre, kalite GF / FMerck / MilliporeWHA1825047
XylolVWR Kimyasalları2,89,73,465
ß-D-Glikoz monohidratMerck / Millipore14431-43-7
Glikoz-Oksidaz kullanılarak denatüre edilmiş etanol106009

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393(2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076(2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945(2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370(2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218(2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103(2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982(2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36(2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759(2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47(2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417(2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206(2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36(2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813(2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Red Blood Cell ProteinsImmunostaining DetectionProtein Activation StatesAntibody LabelingImmunohistochemistry StainingImmunofluorescent StainingMechanotransductionProtein ModificationsLight MicroscopyImageJ Analysis

Related Articles