Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivasyon Sistemi Kullanılarak Bej Yağ Biyolojisi ve Metabolizmasının İncelenmesi

2.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/64849

⸱

6 Ocak 2023

 ,  , 
1Obesity and Comorbidities Research Center, State University of Campinas, 2Department of Structural and Functional Biology, Institute of Biology, State University of Campinas

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, bej yağ biyolojisini araştırmak için adeno ilişkili virüse (AAV) alternatif bir strateji olarak adipositlerde (AdipoSPH) CRISPR SunTag-p65-HSF1 (SPH) kullanımını sunmaktadır. Endojen Prdm16 genini hedef alan AAV taşıyan sgRNA'nın in vivo enjeksiyonu, bej yağ gelişimini indüklemek ve termojenik gen programını geliştirmek için yeterlidir.

Özet

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) teknolojisi biyolojide bir devrim yarattı ve yeni araçlar orijinal olarak tarif edilen gen düzenlemesinin çok ötesinde uygulandı. CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) sistemi, endojen gen ekspresyonunu indüklemek için katalitik olarak inaktif Cas9 (dCas9) proteinini farklı transkripsiyon modülleri ile birleştirir. SunTag-p65-HSF1 (SPH), sinerjik aktivasyon mediatörlerinin (SAM) bileşenlerini SunTag aktivatörleri ile birleştiren yakın zamanda geliştirilmiş bir CRISPRa teknolojisidir. Bu sistem, özelleştirilmiş bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tasarlayarak tek veya çoklu genlerin aşırı ekspresyonuna izin verir. Bu çalışmada, AdipoSPH adı verilen adipositlerde (adiponektin Cre soyundan) SPH eksprese eden koşullu bir fare oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH faresi kullanılmıştır. Beyaz-bej yağ (kahverengileşme) fenotipini indüklemek için, endojen Prdm16 genini (kahverengi ve bej yağ gelişimi ile ilgili iyi kurulmuş bir transkripsiyon faktörü) hedef alan sgRNA taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV), inguinal beyaz yağ dokusuna (iWAT) enjekte edildi. Bu fare modeli, endojen Prdm16 ekspresyonunu indükledi ve termojenik gen programını aktive etti. Ayrıca, in vitro SPH kaynaklı Prdm16 aşırı ekspresyonu, bej adipositlerin oksijen tüketimini arttırdı ve önceki bir Prdm16 transgenik fare modelinin sonuçlarını fenotopkopyaladı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusu biyolojisini araştırmak için çok yönlü, uygun maliyetli ve zaman etkili bir fare modelini tanımlar.

Giriş

Bej (veya brite) adipositler, beyaz yağ dokusu (WAT) depolarında bulunan protein 1 (UCP1) eksprese edici ve mitokondriyal bakımından zengin adipositleri ayırır. Bej yağ, soğuğa maruz kalma ve diğer uyaranlara yanıt olarak adiposit progenitörlerinin veya olgun beyaz adipositlerin bir alt kümesinden ortaya çıkar 1,2. Bej adipositler, enerjiyi UCP1'e bağımlı veya bağımsız bir şekilde ısıya dönüştürebilir3. Termojenik işlevinden bağımsız olarak, bej yağ, adipokinlerin salgılanması ve anti-enflamatuar ve anti-fibrotik aktiviteler gibi diğer yollarla metabolik sağlığı da iyileştirebilir. Farelerde ve insanlarda yapılan çalışmalar, bej yağın indüksiyonunun tüm vücut glikozunu ve lipit homeostazını iyileştirdiğini göstermiştir3. Bununla birlikte, bej yağ biyolojisi hakkındaki bilgimiz son yıllarda hızla gelişmesine rağmen, metabolik faydalarının çoğu ve ilgili mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) ilk olarak ökaryotik hücrelerde, Cas9 proteini 4,5'in nükleaz aktivitesi yoluyla genomdaki belirli bir bölgede çift iplikçik kırılması (DSB) üretebilen bir araç olarak tanımlanmıştır. Cas9, belirli bir genomik bölgeyi hedeflemek için sentetik bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) tarafından yönlendirilir ve bir DNA DSB'ye yol açar. Nükleaz Cas9'u düzenleme amacıyla kullanmanın yanı sıra, CRISPR-Cas9 teknolojisi, diziye özgü bir gen düzenleme aracı6 olarak kullanılmak üzere gelişmiştir. Katalitik olarak inaktif bir Cas9 proteininin (dCas9) geliştirilmesi ve gen ekspresyonunu artırabilen transkripsiyonel modüllerin ilişkisi, CRISPR aktivasyonu (CRISPRa) araçlarına yol açmıştır. SAM ve SunTag aktivatörlerinin bileşenlerini birleştiren VP647,8, sinerjik aktivasyon aracısı (SAM)9, SunTag10,11, VPR12,13 ve SunTag-p65-HSF1 (SPH)14 gibi çeşitli CRISPRa sistemleri ortaya çıkmıştır. Son zamanlarda, N2a nöroblastlarında ve primer astrositlerde nörojenik genlerin indüklenmiş ekspresyonunun, diğer CRISPRa sistemlerine kıyasla SPH kullanılarak daha yüksek olduğu gösterilmiştir14, SPH'yi umut verici bir CRISPRa aracı olarak göstermektedir.

Burada, adiponektin Cre soyunu (AdipoSPH) kullanarak SPH'yi özellikle adipositlerde ifade eden koşullu bir fare modeli oluşturmak için daha önce geliştirilmiş bir SPH fare14'ten yararlandık. Endojen Prdm16 genini hedef alan gRNA'yı taşıyan adeno ilişkili bir virüs (AAV) kullanılarak, termojenik gen programının ekspresyonunu arttırmak için inguinal WAT'ın (iWAT) kahverengileşmesi (beyazdan bej dönüşümüne) indüklendi. Ayrıca, in vitro Prdm16 aşırı ekspresyonu oksijen tüketimini arttırdı. Bu nedenle, bu protokol yağ dokusunda bej yağ gelişimi mekanizmalarını keşfetmek için çok yönlü bir SPH fare modeli sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan çalışmaları, Campinas Üniversitesi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na (protokol CEUA #5810-1/2021) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Moleküler klonlama

  1. Tek kılavuzlu RNA'ların (sgRNA'lar) tasarımı
    1. https://chopchop.cbu.uib.no/'de mevcut olan CHOPCHOP'u veya başka bir uygun aracı kullanarak CRISPR aktivasyonu için sgRNA'lar tasarlayın. Prdm16 genini hedefleyen sgRNA'yı tasarlamak için aşağıdaki parametreleri kullanın: Hedef: Prdm16; İçinde: Muş musculus; Kullanım: Crispr/Cas9; İçin: Etkinleştirme.
      NOT: 200 bp yukarı akış transkripsiyon başlangıç bölgesi (TSS) bölgesine yayılmış her bir ilgi alanı için sgRNA'lar tasarlayın. Örneğin, bu çalışmada kullanılan Prdm16'yı hedefleyen sgRNA, TSS'nin 154 bp yukarı akışını bağlar.
    2. vektör omurgası pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry'deki SacI kısıtlama bölgesini eşleştirmek için sgRNA'ya çıkıntılar ekleyin (bkz. İçindekiler: 5'- (N20)AGCT-3' (N = nükleotidler). Örneğin, Prdm16 genini hedefleyen dizi 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGG-3' ve çıkıntılarla 5'- CGAGCTGCGCTGAAAAGGGGAGCT-3'tür.
    3. https://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html'de bulunan aracı kullanarak 3' sgRNA ters kompleman dizisini elde edin. Örneğin, Prdm16 genini hedefleyen 3' sgRNA dizisi 3'- TCGAGCTCGACGCGACTTTTCCCC-5'tir.
  2. Tek sarmallı tamamlayıcı oligonükleotidlerin tavlanması
    1. Her 5' ve 3' tek sarmallı oligonükleotidden 1 μL (stok konsantrasyonu: 100 μM), 1 μL T4 ligaz tamponu, 0.5 μL T4 polinükleotid kinaz (PNK) (1 × 104 ünite / mL) ve 6.5 μLH2O 10 μL'lik bir son reaksiyon hacmine ekleyin. Aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak tamamlayıcı tek sarmallı oligonükleotidleri tavlayın: 30 dakika boyunca 37 °C ve 5 dakika boyunca 95 °C, ardından 5 °C / dak rampa düşürme hızı.
      NOT: PNK enzimi PNK tamponu ile birlikte verilir ve fosforilasyon reaksiyonu için gereken yeterli ATP içermez (bkz. Reaksiyonu basitleştirmek için, T4 ligaz tamponunu kullanın (PNK tamponu yerine). T4 ligaz tamponu, fosforilasyon reaksiyonu için uygun miktarda (1 mM ATP) fosfat sağlar. PNK enzimi, sonraki ligasyon reaksiyonu için oligonükleotidlerin 5' uç fosforilasyonunu sağlar.
  3. Tavlanmış sgRNA oligonükleotidlerin ligasyonu
    1. 2 μL tavlanmış sgRNA oligonükleotidlerine, 1 μL SacI enzimine, 2 μL 10x T4 DNA ligaz tamponuna, 1 μL T4 DNA ligaz tamponuna, 1 μL T4 DNA ligazına (1-3 u / μL) 25 ng plazmid pAAV-U6-gRNA-CBh-mCherry ekleyin (bkz.
    2. Aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak reaksiyon karışımını inkübe ederek ligasyon gerçekleştirin: 5 dakika boyunca 37 ° C'lik 15 döngü ve 5 dakika boyunca 25 ° C'lik döngü, ardından 4 ° C'de tutma.
  4. Transformasyon ve ardından koloni polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
    1. Yetkili E. coli DH10B hücrelerini (bakınız Malzeme Tablosu) 4 μL ligasyon ürünü ile ısı şoku kullanarak (45 s için 42 °C) dönüştürün ve 100 μg / mL ampisilin içeren bir agar plakasına yayın.
    2. PCR ana karışımını kullanarak koloni PCR ile dönüştürülmüş kolonileri onaylayın (bkz. Koloni seçin ve 5 μL ana karışım, 0,1 μL üniversal astar (stok konsantrasyonu: 100 μM), 0,1 μL sgRNA ters astar (stok konsantrasyonu: 100 μM) (Tablo 1) ve 5 μLH2O ile karıştırın. PCR'yi aşağıdaki koşullar altında bir termosiklet kullanarak çalıştırın: ilk denatürasyon (2 dakika boyunca 94 °C), bunu 35 döngü denatürasyon (20 s için 94 °C), tavlama (30 s için 60 °C), uzatma (30 s için 72 °C) ve son uzama adımı (5 dakika için 72 °C) izler. DNA'yı agaroz (% 1.5) jel elektroforezi kullanarak 90 V'ta 0.5x TAE tamponunda 30 dakika boyunca çözün.
      NOT: Pozitif klonlar ~ 280 bp'lik bir bant verir.
    3. Evrensel astar kullanarak Sanger dizilemesi için pozitif örnekler gönderin (Tablo 1, Ek Dosya 1).
  5. Plazmid saflaştırma
    1. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir plazmid saflaştırma kiti kullanarak plazmidi pozitif bir klondan arındırın (bkz.
      NOT: Plazmidi anyon değişim reçinesi veya hücre transfeksiyonunda kullanıma uygun başka bir kit kullanarak saflaştırın.
    2. 100 μg / mL ampisilin içeren standart bir bakteri büyüme ortamı kullanarak pozitif klonu (200 rpm'de çalkalayarak 37 ° C'de 12 saat) inkübe edin.
    3. Bakteri hücrelerini 6.000 × g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüj edin. Üreticinin kit talimatlarına göre sonraki adımları izleyin.

2. AAV paketleme

NOT: AAV paketlemesi önceki yayınlara göre15,16 küçük değişikliklerle gerçekleştirilmiştir.

  1. %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin/streptomisin (P/S) içeren 25 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kullanılarak 175cm2'lik bir şişede (şişe başına 5 ×10 6 hücrenin tohumlanması) plaka 293T hücreleri (bkz. Hücreler% 50 -% 70 birleşime ulaşana kadar 37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nemde inkübe edin.
  2. 14 μL polietilenimin (1 μg/μL) ile 1 mL 150 mM NaCl karıştırın. AAV üretimi için gerekli üç plazmidi 1:1:1 molar oranında (yani, 17.7 μg pAdDeltaF6, 7.9 μg AAV2/8 (bakınız Malzeme Tablosu) ve 150 mM NaCl'nin 1 mL'sinde 1. adımdan 5.9 μg klonlanmış sgRNA'yı karıştırın. Polietilenimin:NaCl karışımını DNA'yı (plazmidlerin karışımı) içeren tüpe damla damla aktarın ve 25 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: pAdDeltaF6 bir Yardımcı plazmiddir ve pCapsid pAAV2/8, Replikasyon (Rep) ve Kapsid (kapak) genlerini eksprese eden bir ambalaj plazmididir. Her iki plazmid de AAV üretmek için gereklidir.
  3. Transfeksiyondan önce, hücre büyüme ortamını% 1 FBS ve L-alanil-L-glutamin (0.5 g / L) içeren 18 mL DMEM ile değiştirin. Her kültür şişesine 2 mL polietilenimin:DNA karışımı ekleyin ve hücreleri bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2,% 95 nem).
  4. 5 saat sonra,% 10 FBS ve L-alanil-L-glutamin (0.5g / L) ile desteklenmiş 5 mL DMEM ekleyin.
  5. 3 günlük inkübasyondan sonra, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri kültür şişesinden ayırın. 293T hücrelerini 10 (175cm2) hücre kültürü şişesinden 50 mL konik tüplere toplayın ve 30 mL'ye kadar DMEM ekleyin (bkz.
  6. 293T hücrelerini içeren her 50 mL konik tüpe 3 mL kloroform ekleyin ve 5 dakika boyunca yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın. 7.6 mL 5 M NaCl ve kısaca vorteks ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın. 5 dakika boyunca 3.000 × g ve 4 ° C'de santrifüj.
  7. Sulu fazı yeni bir konik tüpe aktarın ve 9.4 mL% 50 (v / v) polietilen glikol (PEG) 8000 ekleyin. Bir vorteks karıştırıcı ile 10 s boyunca yüksek hızda karıştırın ve numuneleri 1 saat boyunca buz üzerine koyun.
  8. 30 dakika boyunca 4 °C'de 3.000 × g'da santrifüj. Süpernatantı çıkarın ve peletin 10 dakika kurumasını bekleyin.
  9. 1,4 mL HEPES (50 mM, pH 8) ekleyin ve yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak 5 dakika boyunca karıştırın. 3.5 μL 1 M MgCl2, 14 μL DNaz I (20 birim / μL) ve 1.4 μL RNaz A (10 μg / μL) ekleyin. 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin ve ardından numuneleri yeni 1,5 mL tüplere aktarın (her tüpte 700 μL).
  10. Her 1,5 mL'lik tüpe 700 μL kloroform ekleyin ve 10 sn boyunca yüksek hızda bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın. 5 dakika boyunca 4 ° C'de 3.000 × g'da santrifüj yapın ve sulu fazı yeni bir tüpe aktarın. Bu adımı 3x tekrarlayın.
  11. Kloroformu bir biyogüvenlik kabininde 30 dakika buharlaştırın. Daha sonra, sulu fazın 300 μL'sini 0,5 mL'lik bir ultra santrifüjleme tüpüne aktarın ( bkz. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 5 dakika döndürün. Akışı çıkarın ve tüm ses seviyesi filtreden geçene kadar filtreyi tekrar döndürün.
  12. Filtreyi 300 μL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) ekleyerek yıkayın ve çözeltileri pipetleme ile karıştırın. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj edin. Bu yıkama adımını 4x tekrarlayın.
  13. Filtreyi 25 °C'de 14.000 × g'da 8 dakika boyunca santrifüjleyin. Filtreyi yeni bir tüpe baş aşağı yerleştirin ve 25 ° C'de 1.000 × g'da 2 dakika döndürün.

3. AAV'nin qPCR ile titrasyonunun yapılması

  1. AAV titrasyonu için standart bir eğri hazırlayın ve Fripont ve ark.15 tarafından yapılan orijinal çalışmaya göre AAV titresini belirleyin.

4. AAV'nin inguinal beyaz yağ dokusuna (iWAT) in vivo enjeksiyonu

  1. Ameliyat için gerekli cerrahi aletleri ve malzemeleri ayırın ve her bir malzeme için önerilen şekilde sterilize edin.
  2. İntraperitoneal enjeksiyonla fareyi 100 mg/kg ketamin ve 10 mg/kg ksilazin ile uyuşturun. Pençe ve kuyruk üzerinde kuvvetli bir baskı uygulayarak ve bir refleks olup olmadığını kontrol ederek anesteziyi onaylayın. Ameliyat sırasında göz kuruluğunu önlemek için farenin gözlerine merhem sürün.
  3. Anestezi uygulanan fareyi sırtüstü pozisyona yerleştirin ve bir tıraş makinesi ile iWAT enjeksiyonları için kalça eklemlerine yakın, yanlarda küçük bir alanı tıraş edin. 5 dakika boyunca tüy dökücü krem sürün. Cilt yanmasını önlemek için artık kremi suyla çıkarın.
  4. Cildin üzerine üç alternatif antiseptik çözelti (povidon-iyot) uygulayarak cildi temiz bir gazlı bez ve% 70 alkol ile dezenfekte edin. Her kullanımdan sonra gazlı bezi atın.
  5. Cilde antiseptik bir çözeltinin son uygulamasını yapın. Daha sonra, eklemlerin proksimal bölgesinde sterilize edilmiş makasla 1-2 cm'lik bir kesi yapın ve yağ deposunu açığa çıkarmak için forseps kullanarak cildi açık tutun. WAT, her iki taraftaki cilde bağlı olarak, başlangıçtan itibaren sırtta ve testislere doğru uzanır.
    NOT: Ameliyat veya dikiş prosedürleri sırasında kontaminasyonu önlemek için perdeler kullanın.
  6. Forseps kullanarak, insizyon boyunca, enjeksiyonun doğru yerde ve derinlikte olduğundan emin olmak için yağ deposunu yavaşça yukarı doğru çekin.
    NOT: Dokuyu orijinal konumundan çıkarmamaya dikkat edin.
  7. Mikrolitre şırıngasını (gösterge: 33; nokta stili: 4; açı: 12; uzunluk: 10) (bakınız Malzeme Tablosu) AAV'nin 2.5 μL (5.6 ×10 10 viral genomu [VG]/μL) ile doldurun (endojen Prdm16 genini hedef alan sgRNA'yı içerir). İğneyi iWAT'a 30°-45° açıyla dikkatlice yerleştirin. Tüm iWAT yağ yastığını homojen bir şekilde enfekte etmek için enjeksiyonu dokunun farklı yerlerine 5 kez tekrarlayın. iWAT'ı enfekte etmek için toplam 15 μL'lik bir hacim önerilir.
    NOT: Şırınganın yerleştirilme derinliği, yağ yastığı birikintisinin kalınlığına bağlıdır. Enjeksiyonu hazırlamak için dokunma tekniğini kullanın.
  8. Tıraş edilen cilt insizyonunu 4/0 monofilament sütürler kullanarak kapatın. Bilinç yeniden kazanılana kadar fareyi bir ısı yastığına yerleştirin. Tamamen iyileşene kadar hayvanı her 10-15 dakikada bir izleyin. Hayvan bilincini yeniden kazandıktan sonra, doğrusal olması gereken ve sıkıntı veya ağrı belirtisi olmayan lokomotor profillemesini gözlemleyin.
  9. Ameliyattan sonraki 48 saat içinde tramadol hidroklorür (5 mg/kg) intraperitoneal olarak 3 gün (2x/gün) süreyle uygulanarak postoperatif ağrı kontrolü yapın.
    NOT: Sıkıntı ve rahatsızlık belirtilerini izleyin ve su ve yiyecek alımını izleyin. Önleyici bir şekilde, tercihen ameliyattan önce veya ameliyatın başında etkili bir analjezik dozu verin.
  10. İyileşme döneminde fareyi yiyecek ve suya serbest erişimi olan bir kafeste tutun. İyileşme süresinden sonra, fareyi ötenazi yapmaya devam edin. Bu çalışmada ötenazi, indükleyici dozun 3 katından (300-360 mg / kg ketamin hidroklorür + 30-40 mg / kg ksilazin hidroklorür) aşırı dozda enjekte edilebilir anestezik (intraperitoneal) ve ardından kafa kesme ile gerçekleştirildi.
    NOT: Anesteziden tamamen iyileşene kadar hayvanların ayrı kafeslerde tutulması şiddetle tavsiye edilir.

5. Stromal vasküler hücrelerin (SVF'ler) bej adipositlere in vitro farklılaşması

  1. Aune ve ark.17'ye göre, AdipoSPH farelerinin iWAT'ından birincil SVF'lerin izolasyonunu ve kaplanmasını gerçekleştirin. AdipoSPH fareleri iWAT'tan türetilen tohum SVF'leri, 1-2 saat boyunca tam ortam (3.1 g / L glikoz, 0.5 g / L L-alanil-L-glutamin,% 10 FBS ve% 2.5 P / S içeren DMEM) içeren 6 delikli bir plakaya türetilmiştir.
    NOT: SVF fraksiyonu farklı hücre tiplerinin bir karışımını içerir. Bu aşamada, adipositlere yol açan tohumlanmış progenitör hücrelerin sayısını tanımlamak mümkün değildir.
  2. Ortamı aspire edin, fosfat tamponlu salin (1x PBS) kullanarak kuyuyu 2x yıkayın ve taze komple ortamla değiştirin. Hücreleri% 70 -% 80 akıcılığa ulaşana kadar hücreleri 37 ° C,% 5 CO2,% 95 nemde inkübe edin.
  3. Hücreleri indüksiyon ortamı ile tedavi ederek farklılaşmayı (gün 0) indükleyin (Tablo 2).
    NOT: İndüksiyon ortamının ilaç kokteyli, bej adiposit farklılaşmasını arttırmak ve termojenik gen programı17'nin ekspresyonu için gereklidir.
  4. 2 gün sonra (2. gün), indüksiyon ortamını bakım ortamıyla değiştirin (Tablo 2).
  5. 2 gün sonra (4. gün), bakım ortamını 2 ila 3 gün boyunca taze bakım ortamıyla (Tablo 2) değiştirin.
  6. Preadipositler adipositlere tamamen farklılaşana kadar (tipik olarak indüksiyon ortamının eklenmesinden 6 gün sonra) bakım ortamını her 48 saatte bir değiştirin. Olgun adipositler ışık mikroskobu kullanılarak gözlemlenebilir, çünkü farklılaşmış hücreler lipit damlacıkları ile yüklü gibi görünmektedir.

6. SVF'lerin in vitro AAV enfeksiyonu

NOT: AdipoSPH fareleri iWAT'tan türetilen SVF'ler, Wang ve ark.18 tarafından daha önce birkaç modifikasyonla tarif edildiği gibi AAV taşıyan sgRNA-Prdm16 ile enfekte olmuştur.

  1. Hücreleri, daha önce 5.1-5.3 adımlarında tarif edildiği gibi, hücreler% 70-80 birleşmeye ulaşana kadar tam ortamla 6 delikli bir kültür plakası üzerinde büyütün.
  2. 5.6 ×10 10 VG/μL AAV taşıyan sgRNA-Prdm16'yı 2 mL tam ortam ve hekzadimetrin bromür (8 μg/mL) ile karıştırın (bkz. Tam ortamı değiştirerek ve AAV içeren tam ortamı ekleyerek hücreleri dönüştürün. Dönüştürülen hücreleri 37 ° C'de,% 95 nem ve% 5 CO'da 12 saat boyunca inkübe edin.
  3. Hücre proliferasyonu ve bej adipositlere farklılaşma için adım 5'te açıklandığı gibi hücreleri bölün ve tohumlayın.
    NOT: Oksijen tüketimi testi için, tohum 4.0, 24 delikli bir hücre kültürü plakasında indüksiyon ortamı ile kuyu başına 104 hücreye (adım 6.2'den itibaren) ×. Hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının sonraki adımları, adım 5'te açıklandığı gibi gerçekleştirilir. Oksijen tüketimi testi, hücreler% 80-100 birleşmeye ulaştığında ve daha önce bildirildiği gibi tamamen farklılaştığında gerçekleştirilir19.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

AdipoSPH fareleri, SPH ve Adipoq-Cre fare suşlarının üremesiyle geliştirilmiştir. Her iki fare suşu da hibrit bir C57BL6J-DBA / 2J arka planındaydı (ticari tedarikçiye göre; bkz. SPH fare soyu başlangıçta Zhou ve ark.14 tarafından tanımlanmıştır.

AdipoSPH aracılı Prdm16 aşırı ekspresyonu yoluyla in vivo bej adiposit gelişimi
Bu çalışmada açıklanan modelin in vivo bej adipositler geliştirme kapasite...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CRISPR teknolojisinin en kullanışlı düzenleme dışı uygulamalarından biri, CRISPRa sistemleri6 kullanılarak endojen genlerin aktivasyonu yoluyla gen fonksiyonunun sorgulanmasıdır. SPH, başlangıçta birkaç nörojenik geni hedef alarak astrositlerin aktif nöronlara dönüşümünü indüklediği açıklanan güçlü bir CRISPRa'dır14. Bu çalışmada, AdipoSPH'nin adipositlerde endojen Prdm16 ekspresyonunu aktive ederek bej yağ biyolojisini araştırmak için uygun bir araç olduğu gösterilmiştir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório (Cemib), Unicamp'tan AdipoSPH farelerinin üretimi için aldıkları destek, Inmmunometabolizma ve Hücre Sinyalizasyon Laboratuvarı ve Hücre Biyolojisine Uygulanan Fotonik Ulusal Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'ne (INFABIC) tüm deneysel destek için teşekkür eder. Sao Paulo Araştırma Vakfı'nın (FAPESP) finansal desteğine teşekkür ederiz: 2019/15025-5; 2020/09308-1; 2020/14725-0; 2021/11841-2.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3,3 ',5-Triiyodo-L-tironinSigma-AldrichT2877
3-İzobutil-1-metilksantinSigma-AldrichI5879
AAVpro 293T Hücre HattıTakarabio632273
Amicon Ultra Santrifüj FiltreMerckmilliporeUFC510008100 KDa
DeksametazonSigma-AldrichD1756
Dulbecco'nun Eagles Medium Modifikasyonu (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) F-12, GlutaMAX ve ticaret;Gibco10565-018yüksek konsantrasyonlarda glikoz, amino asit ve vitamin
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)Sigma-AldrichD8662
Excelta Kendiliğinden Açılan Mikro MakasFisher Scientific17-467-496
Fetal sığır serumuSigma-AldrichF2442
Fisherbrand Hücre Sıyırıcılar (100 pk)Fisher Scientific08-100-241
Fisherbrand Yüksek Hassasiyetli Düz Konik Ultra İnce Uçlu Cımbız/ForsepsFisher Scientific12-000-122
Fisherbrand Keskin Uçlu Diseksiyon MakasıFisher Bilimsel08-940
GliserolSigma-AldrichG5516
HEPESSigma-AldrichH3375-25G
Heksadimetrin bromür (Polibren)Sigma-AldrichH9268
İndometasinSigma-AldrichI7378
İnsülinSigma-AldrichI9278
LigaFast Hızlı DNA Ligasyon SistemiPromegaM8225
Maxiprep saflaştırma kiti Qiagen12162
Mikrolitre şırıngaHamilton80308Model 701
NEB 10-beta/Kararlı New England BiolabsC3019H E. coli< / em> yetkili hücreler
pAAV2 / 8 Ekle 
pAAV-U6-gRNA-CBh-mKirazEklentisi 91947
pAdDeltaF6 Ekle 
112867 PEG 8000Sigma-Aldrich89510
Penisilin / streptomisinGibco15140-122
PolietileniminSigma-Aldrich23966Doğrusal, MW 25000
Povidon-iyotRioquí mika510101303Antiseptik
RosiglitazonSigma-AldrichR2408
SacI enzimiNew England BiolabsR0156
Cerrahi Tasarım Premier Adson ForsepsFisher Scientific22-079-741
ŞırıngaHamilton475-40417
T4 DNA LigazPromegaM180B
T4 DNA ligaz tamponu New England BiolabsB0202S
T4 PNK enzim kitiNew England BiolabsM0201S
Tramadol HidroklorürSEM43930
Vidisik Jel ve nbsp;Bausch + Lomb 99620
takviyesi112864

Kaynaklar

  1. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Cohen, P., Kajimura, S. The cellular and functional complexity of thermogenic fat. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (6), 393-409 (2021).
  4. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  5. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  6. Dominguez, A. A., Lim, W. A., Qi, L. S. Beyond editing: Repurposing CRISPR-Cas9 for precision genome regulation and interrogation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 5-15 (2016).
  7. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  8. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  9. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  10. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  13. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  14. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  15. Fripont, S., Marneffe, C., Marino, M., Rincon, M. Y., Holt, M. G. Production, purification, and quality control for adeno-associated virus-based vectors. Journal of Visualized Experiments. (143), e58960(2019).
  16. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house aav vector production based on chloroform extraction. Current Protocols in Neuroscience. 93 (1), 103(2020).
  17. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  18. Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
  19. Oeckl, J., Bast-Habersbrunner, A., Fromme, T., Klingenspor, M., Li, Y. Isolation, culture, and functional analysis of murine thermogenic adipocytes. STAR Protocols. 1 (3), 100118(2020).
  20. Cohen, P., et al. Ablation of PRDM16 and beige adipose causes metabolic dysfunction and a subcutaneous to visceral fat switch. Cell. 156 (1-2), 304-316 (2014).
  21. Harms, M., Seale, P. Brown and beige fat: development, function and therapeutic potential. Nature Medicine. 19 (10), 1252-1263 (2013).
  22. Divakaruni, A. S., Jastroch, M. A practical guide for the analysis, standardization and interpretation of oxygen consumption measurements. Nature Metabolism. 4 (8), 978-994 (2022).
  23. Seale, P., et al. Prdm16 determines the thermogenic program of subcutaneous white adipose tissue in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (1), 96-105 (2011).
  24. Valet, P., Tavernier, G., Castan-Laurell, I., Saulnier-Blache, J. S., Langin, D. Understanding adipose tissue development from transgenic animal models. Journal of Lipid Research. 43 (6), 835-860 (2002).
  25. Bates, R., Huang, W., Cao, L. Adipose tissue: an emerging target for adeno-associated viral vectors. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 19, 236-249 (2020).
  26. Wang, D., Tai, P. W. L., Guangping, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  27. Colella, P., Ronzitti, G., Mingozzi, F. Emerging issues in AAV-mediated in vivo gene therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 87-104 (2018).
  28. Deshmukh, A. S., et al. Proteomics-based comparative mapping of the secretomes of human brown and white adipocytes reveals EPDR1 as a novel batokine. Cell Metabolism. 30 (5), 963-975 (2019).
  29. Sponton, C. H., et al. The regulation of glucose and lipid homeostasis via PLTP as a mediator of BAT-liver communication. EMBO reports. 21 (9), 49828(2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

CRISPR AktivasyonuAdiposit Gen EkspresyonuPrdm16 Aşırı EkspresyonuAdeno-İlişkili VirüsBeyaz Adipoz DokuTermojenik Gen ProgramıOksijen TüketimiStromal Vasküler Hücreler
CRISPR SunTag-p65-HSF1 Aktivasyon Sistemi Kullanılarak Bej Yağ Biyolojisi ve Metabolizmasının İncelenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.